血性胸腹水液基涂片中紅細胞去除方法探討

李亞輝 代愛軍 李會平 張帆

【摘要】?目的?探討去除疑似腫瘤血性胸腹水液基涂片、細胞塊中紅細胞的方法，為提高臨床病理細胞學診斷陽性率提供參考。方法?收集河南科技大學第三附屬醫(yī)院臨床送檢病理科的新鮮血性疑似腫瘤胸腹水標本65例為研究樣本。每例分為對照組與實驗組，實驗組分別加入95%酒精、85%酒精、75%酒精、50%酒精、30%酒精、10%酒精，與不做任何處理并按照傳統(tǒng)方法行液基涂片、細胞塊的對照組進行比較。結果?液基細胞學和組織沉渣包埋染色顯示，隨著酒精濃度的降低紅細胞溶解呈上升趨勢，當酒精濃度降低到50%以后，紅細胞完全溶解，然后隨著酒精濃度的進一步降低細胞開始出現(xiàn)退變，切片染色評分有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。50%酒精處理組免疫組化陽性信號更強（P<0.05或0.01），腫瘤細胞陽性檢出率顯著升高（P<0.05或0.01）。結論?50%酒精能去除血性胸腹水液基涂片、細胞塊背景中的紅細胞，提高腫瘤血性胸腹水細胞學的陽性率。

【關鍵詞】?血性胸腹水;細胞塊;50%酒精;蘇木素-伊紅染色

中圖分類號：R361+.2?文獻標志碼：A?DOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2020.12.009

【Abstract】?Objective?To explore the method of removing red blood cells from liquid-based smear of bloody hydrothorax and ascites and cell blocks of suspected tumors， so as to provide reference for improving the positive rate of clinical pathological cytology diagnosis.Methods?65 cases of fresh bloody hydrothorax and ascites of suspected tumors from the department of pathology of The Third Affiliated Hospital of Henan University of Science and Technology were collected as study samples. Each case was divided into control group and experimental group. The experimental group were added with 95% alcohol， 85% alcohol， 75% alcohol， 50% alcohol， 30% alcohol， 10% alcohol， respectively， and compared with the control group which did not receive any treatment and performed liquid-based smear and cell block according to traditional method.Results?Liquid-based cytology and tissue sediment embedding staining showed that erythrocyte dissolution increased with the decrease of alcohol concentration. When the alcohol concentration dropped to 50%， erythrocyte dissolved completely， and then cells began to degenerate with the further decrease of alcohol concentration， and the section staining score was statistically significant （P < 0.01）. Immunohistochemical positive signal was stronger in the 50% alcohol treatment group（P < 0.05 or P < 0.01）， and the positive detection rate of tumor cells significantly increased （P < 0.05 or P < 0.01）.Conclusion?50% alcohol can remove red blood cells from the background of liquid-based smear of bloody hydrothorax and ascites and cell blocks， and improve the positive rate of cytology in hemothorax and ascites of tumor.

【Key words】?hemorrhagic pleural and ascites; cell block; 50% alcohol; hematoxylin-eosin staining

脫落細胞學檢查已成為診斷腫瘤的重要方法，其具有快速、準確、方便以及患者痛苦少等優(yōu)點，已成為臨床診斷的重要手段之一[1～2]。但在病理操作中，血性胸腹水由于有大量的紅細胞存在，影響了涂片質量的陽性率和診斷結果，給查找腫瘤細胞帶來一定困難[3～4]。如何除去血性胸腹水中紅細胞，提高胸腹水中腫瘤細胞的陽性率一直是一個亟待解決的問題[5～6]。本實驗通過采用梯度酒精處理血性胸腹水，對比液基細胞學涂片、組織沉渣包埋切片、免疫組化在不同濃度酒精條件下的紅細胞去除效果和腫瘤細胞陽性檢出率。

1?材料與方法

1.1?胸腹水標本

收集2019年1月到12月間送檢河南科技大學第三附屬醫(yī)院病理科的疑似腫瘤血性胸腹水標本共65例，均為300 mL。血性胸腹水排除標準：（1）近1～2個月有胸部外傷病史;（2）穿刺時損傷肋間動脈等針刺傷;（3）患有如結核、肺炎、肝硬化、血液系統(tǒng)疾病等對胸水有影響的疾病。血性胸腹水納入標準：（1）血性;（2）影像學、病理學診斷為腫瘤;（3）有既往腫瘤病史;（4）腫瘤包括肺癌、卵巢癌、前列腺癌、惡性間皮瘤等引起的血性胸水。

1.2?試劑

無水乙醇（天津永大）;HE高清恒染試劑（哈爾濱格林）;免疫組化試劑（河南賽諾特生物技術有限公司）;二抗（Dako）;DAB顯色劑（Dako）。

1.3?儀器

組織脫水機，日本櫻花VP1;石蠟切片機，德國LEICA2235;自動染色機，中國達科為;修復儀，丹麥Dako PT LINK;全自動免疫組化染色機，丹麥Dako AS Link 48;細胞學全自動染色機，廣州鴻琪。

1.4?標本分組處理與取材

將同一血性標本進行等份處理，分為對照組（A組）和實驗組（B、C、D、E、F、G組），每組40 mL，將各組新鮮血性胸腹水標本充分搖勻，分別倒入10 mL的塑料離心管，離心5 min，轉速2000 r/min[5]，用吸管緩慢吸去上清液，留沉淀物充分震蕩后，B、C、D、E、F、G組分別加入95%酒精、85%酒精、75%酒精、50%酒精、30%酒精、10%酒精至10 mL，A組不予任何處理;離心5 min，轉速2000 r/min，若沉淀物仍肉眼可見紅細胞，重復上述步驟。如果沉淀物含大量血液，則用吸管輕巧吸取上清液與血液之間的“白膜”層沉淀物，放置于另一離心管內，繼續(xù)上述操作。取七組部分樣本分別加入細胞保存液中固定，制備液基涂片;余標本加入95%酒精離心5 min，轉速2000 r/min，凝固成細胞塊后，放入中性緩沖甲醛中固定，以待制備細胞塊。

1.5?蘇木素-伊紅（HE）染色檢測液基細胞學、細胞塊染色情況[7]

液基細胞學涂片：取各組標記實驗標本，并在細胞保存液中固定2 h后，用鴻琪細胞學全自動染色機進行液基細胞學制片，然后在達科為全自動染色機上染色，顯微鏡下觀察，并拍照保存。細胞塊切片：取各組標記實驗標本，并在10%中性緩沖甲醛液中固定24 h后，在櫻花全自動脫水機中處理標本，制備石蠟切片，切片厚度4 μm，常規(guī)HE染色，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察，并拍照保存。

1.6?用免疫組化染色驗證50%酒精處理后對腫瘤細胞的影響[8～9]

A組、E組分別進行4 μm連續(xù)石蠟切片，展片、撈片、烤片1 h后，置于修復儀熱孵育升溫30 min，維持加熱20 min，最高溫度97℃，冷卻時間40 min，將切片放置自動免疫組化染色機上進行相應指標染色后，放置全自動染色機上脫水透明，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察，并拍照保存。

1.7?切片HE染色評分標準

紅細胞評分標準：形態(tài)正常（0分）;細胞變形聚集溶解量≤25%（1分）;25%<細胞溶解量≤75%（2分）;細胞溶解量>75%（3分）。有核細胞評分標準：細胞退變量>75%（0分）;25%<細胞退變量≤75%（1分）;細胞量≤25%（2分）;細胞正常（3分）。細胞退變是指胞漿紅染細胞核膜模糊，有嚴重核空泡樣變，胞漿崩解。退變?yōu)榘俜謹?shù)統(tǒng)計數(shù)十個高倍視野的量。

1.8?統(tǒng)計學方法

通過SPSS 23.0軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料采用t檢驗，計數(shù)資料采用卡方檢驗，檢驗水準：α=0.05，雙側檢驗。

2?結?果

2.1?血性胸腹水HE切片檢測結果

細胞沉渣包埋HE染色結果顯示：酒精處理后紅細胞開始出現(xiàn)聚集和變形，隨著酒精濃度的降低紅細胞溶解呈上升趨勢，當酒精濃度降低到50%以后，紅細胞完全溶解。對照組有核細胞輪廓清楚，染色清晰，隨著酒精濃度的降低，當酒精濃度低于50%以后開始出現(xiàn)退變，并且隨著酒精濃度的進一步降低，細胞退變逐漸加重。切片染色評分有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。見圖1。

液基細胞學HE染色結果顯示：當處理液酒精濃度低于85%以后，紅細胞出現(xiàn)明顯變形，隨著酒精濃度降低，紅細胞逐漸溶解，在酒精濃度達到50%以后，紅細胞完全溶解。隨著酒精濃度降低，尤其是酒精濃度低于50%以后，有核細胞開始出現(xiàn)變形，并且細胞退變程度隨著酒精濃度的進一步降低而逐漸加重。切片染色評分有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。見圖2。

2.2?血性胸腹水免疫組化結果

與對照組相比，50%酒精組中CK7、EMA、NapsinA、TTF-1免疫組化結果細胞豐富，陽性定位清楚，蛋白表達量顯著升高（P<0.05或0.01）。見圖3。

2.3?腫瘤細胞陽性檢出率比較

65例血性胸腹水中，TCT法對照組腫瘤細胞檢出率為12.3%（8/65），50%酒精組腫瘤細胞檢出率為33.8%（22/65），兩種方法HE染色結果差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。組織沉渣包埋切片中對照組腫瘤細胞檢出率為16.9%（11/65），50%酒精組腫瘤細胞檢出率為32.3%（21/65），兩種方法HE染色結果差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表1。

3?討?論

胸腹腔積液是臨床常見癥狀之一，快速準確地鑒別其性質尤其是尋找到惡性細胞，對疾病的及時診斷和治療有重要意義[10]。在病理工作中，胸腹水脫落細胞學檢查因其具有快速、準確、簡便、易行以及患者痛苦少等優(yōu)點，在臨床上得以廣泛應用[11～12]。血性胸腹水標本常見于惡性腫瘤等多種疾病，在傳統(tǒng)的直接離心涂片法中，因大量紅細胞的存在，易造成涂片厚薄不均，影響染色效果，甚至涂片在染色水洗過程中脫片，使觀察結果受到限制和影響，干擾診斷的準確性[13]。同時，免疫化學標記鑒別細胞良、惡性時，因紅細胞及血漿蛋白增加了著色背景，從而不利于陽性結果的觀察。

本次實驗采用酒精梯度處理血性胸腹水，發(fā)現(xiàn)當50%酒精處理血性胸腹水時，紅細胞完全溶解，同時又能使各種有核細胞完整不變形，核染色質清晰便于觀察。50%酒精與胸腹水混合后可以形成低滲溶液，從而使紅細胞迅速溶解，同時又不影響有核細胞的形態(tài)，利于癌細胞充分暴露避免漏診。乙醇可以作為固定劑，對癌細胞具有良好的固定作用，保持癌細胞結構完整染色清晰，并可以制成沉渣包埋塊，用于特殊染色及免疫組織化學染色[14～15]。此外，TCT法中50%酒精組陽性數(shù)較組織沉渣包埋法中50%酒精組多出1例，對該例病人標本進行仔細檢查發(fā)現(xiàn)，該例TCT玻片上可疑腫瘤細胞量少，僅出現(xiàn)個別散在可疑腫瘤細胞，在沉渣包埋切片中，蠟塊粗修時，可能造成可疑腫瘤細胞丟失，因此，沉渣包埋組織切片及染色中，未見腫瘤細胞;對該例沉渣包埋切片做免疫組化驗證，結果顯示：CK7（+）、EMA（-）、 NapsinA（-） 、TTF-1（-），結合HE切片和免疫組化結果分析支持沉渣包埋切片未見腫瘤細胞的診斷。

本法的優(yōu)點是操作簡單不用配制任何試劑，直接利用50%酒精低滲原理和短時間（5 min左右）的低速離心使絕大部分紅細胞迅速裂解，裂解產物隨著上清液而倒掉，而間皮細胞、腫瘤細胞、淋巴細胞等結構完整、不退變，核質分明，核仁清晰，可提高病理細胞學診斷陽性率，值得推廣。

參?考?文?獻

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（收稿日期：2020-08-20?修回日期：2020-10-26）

（編輯：潘明志）