鼻咽癌患者血漿EBV-miR-BART7-3p與EBV-miR-BART17-5p的表達及其臨床意義

覃煒玲 湯敏中 徐霄 陳學杰

【摘要】?目的?檢測鼻咽癌患者血漿中BART-miRNAs的表達情況，評價它們對鼻咽癌診治的臨床應用價值。方法?采用反轉(zhuǎn)錄PCR檢測111例首診鼻咽癌患者、42例治療后復發(fā)/轉(zhuǎn)移鼻咽癌患者、22例非鼻咽癌患者及24名健康體檢者血漿中BART-miRNAs，統(tǒng)計分析其與鼻咽癌患者臨床特點的關系，以及治療前后的變化，繪制ROC曲線，計算AUC，評估其作為鼻咽癌診斷工具的性能。結(jié)果?鼻咽癌患者血漿中EBV-miR-BART7-3p與EBV-miR-BART17-5p相對表達水平顯著高于非鼻咽癌患者與健康體檢者（P<0.05），均與患者N分期和臨床分期相關（P<0.05），且在治療后顯著下降（P<0.05），而治療后轉(zhuǎn)移患者相對表達水平顯著升高。單獨檢測診斷鼻咽癌的AUC為0.829和0.833，聯(lián)合檢測診斷鼻咽癌的AUC為0.860。結(jié)論?檢測血漿中EBV-miR-BART7-3p與EBV-miR-BART17-5p，可為鼻咽癌診療以及分期等進一步研究提供有效依據(jù)。

【關鍵詞】?鼻咽癌;EBV;BART-miRNAs;EBV-miR-BART7-3p;EBV-miR-BART17-5p

中圖分類號：R739.6?文獻標志碼：A?DOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2020.12.004

【Abstract】?Objective?To detect the expression of BART-miRNAs in plasma of patients with nasopharyngeal carcinoma， and evaluate their clinical application values in the diagnosis and treatment of nasopharyngeal carcinoma.Methods?RT-PCR was used to detect BART-miRNAs in plasma of 111 patients with first diagnosed nasopharyngeal carcinoma， 42 patients with recurrent / metastatic nasopharyngeal carcinoma after treatment， 22 patients without nasopharyngeal carcinoma and 24 healthy controls. And then， relationship between BART-miRNAs and clinical characteristics of patients with nasopharyngeal carcinoma， as well as the changes before and after treatment， were statistically analyzed. ROC curve was drawn， AUC was calculated， and its performance as a diagnostic tool for nasopharyngeal carcinoma was evaluated.Results?The relative expression levels of EBV-miR-BART7-3p and EBV-miR-BART17-5p in the plasma of nasopharyngeal carcinoma patients were significantly higher than those of patients without nasopharyngeal carcinoma and healthy people （P < 0.05），?which were all correlated with N stage and clinical stage of patients （P < 0.05）， and decreased significantly after treatment （P < 0.05）， and the relative expression level of metastatic patients increased significantly after treatment. The AUC of single detection for diagnosis of nasopharyngeal carcinoma was 0.829 and 0.833， and that of?combined diagnosis of was 0.860.Conclusion?The detection of EBV-miR-BART7-3p and EBV-miR-BART17-5p in plasma can provide an effective basis for the diagnosis， treatment and staging of nasopharyngeal carcinoma.

【Key words】?nasopharyngeal carcinoma; EBV; BART-miRNAs; EBV-miR-BART7-3p; EBV-miR-BART17-5p

鼻咽癌系一種來源于鼻咽黏膜的上皮細胞惡性腫瘤，其發(fā)病與環(huán)境因素、EBV感染、遺傳因素等密切相關，我國鼻咽癌發(fā)病和死亡仍處于世界較高水平，發(fā)病與死亡高發(fā)的區(qū)域主要集中在兩廣地區(qū)，發(fā)病率都在10/105以上[1～3]。鼻咽癌早期易漏診，絕大部分新發(fā)鼻咽癌病例為局部晚期（Ⅲ期、Ⅳ期）[4]。隨著放射治療技術(shù)的發(fā)展，鼻咽癌的治療已從傳統(tǒng)的放化療發(fā)展為以放療為主的綜合治療階段[5]。然而，由于仍然缺乏高效能低毒性的靶向藥物與新的治療方法，鼻咽癌患者不得不承受放射治療與化療藥物帶來的損傷與毒副作用，許多患者在治療后出現(xiàn)了放射性鼻竇炎、放射性中耳炎、放射性顱神經(jīng)損傷、放射性腦病等，還有不同程度的骨髓抑制、貧血、低蛋白血癥等，這無疑加重了患者的疾病負擔。尋找敏感特異的生物標志物可能是提高鼻咽癌治愈率、獲得良好預后以及減少疾病負擔的關鍵所在。EBV miRNAs在鼻咽癌中的表達譜已被廣泛研究，BART-miRNAs高表達于鼻咽癌組織中[6～9]。在鼻咽癌細胞中，BART-miRNAs約占總miRNA含量的15.57%，然而在病毒和細胞基因的總體調(diào)控影響中，BART-miRNAs卻占相當大的比例，有著很關鍵的作用[6，9]。因此， BART-miRNAs作為鼻咽癌診斷的血清學標志物的用途以及是否適合在臨床推廣應用則需要更大的樣本量加以研究與驗證。此次研究通過檢測鼻咽癌患者治療前后、非鼻咽癌患者以及健康體檢者血漿中BART-miRNAs的表達情況，分析它們與患者臨床特點、分期、復發(fā)及轉(zhuǎn)移等的關系，以及治療前、中、后的水平改變，評價它們在鼻咽癌診治中的臨床應用價值，并評估它們是否能用來準確預測預后及監(jiān)測鼻咽癌復發(fā)或轉(zhuǎn)移，以期為鼻咽癌的早診早治與預后評估等提供有效、可靠的依據(jù)。

1?材料與方法

1.1?研究對象

收集2019年8月～2020年3月間在梧州市紅十字會醫(yī)院就診的鼻咽癌患者血液樣本，以同階段就診的非鼻咽癌患者與健康體檢者作為對照，記錄他們診斷時的年齡、性別、診斷、臨床分期、病史和轉(zhuǎn)移狀態(tài)等臨床信息。所有鼻咽癌患者均經(jīng)過鼻咽活檢病理檢查確診，并根據(jù)WHO分類方法分類，既往無其他惡性腫瘤史;均行MRI檢查、CT掃描等常規(guī)檢查方法，評估患者腫瘤情況、淋巴結(jié)播散程度以及是否存在遠處轉(zhuǎn)移的情況，并根據(jù)鼻咽癌中國分期2017版進行準確分期。治療方案由主診醫(yī)師依照個體化原則，科學合理制訂。收集首診鼻咽癌患者治療結(jié)束時的血液樣本，以分析治療過程中BART-miRNAs表達水平的變化。所有樣本均為患者診療過程中臨床檢測后剩余的血液樣本，所有納入分析的樣本臨床診斷信息完整可溯源，對于臨床診斷信息保存不完整，樣本量不足或源記錄不清晰的樣本則被剔除;人為因素（如操作不當、操作過程樣本污染等）或儀器問題導致無法完成實驗過程的樣本則被剔除;實驗重復孔結(jié)果之間差異大的樣本剔除。

1.2?研究方法

1.2.1?樣本采集與儲存

所有血液樣本均在采集后6小時之內(nèi)處理，離心分離出血漿，分裝到RNase-free凍存管中，置于零下80℃的低溫冰箱保存，用于后續(xù)血漿RNA的提取和檢測。

1.2.2?參照的選擇與序列

選擇合成的Caenorhabditis elegans microRNA，cel-miR-39-3p作為RNA提取、cDNA合成以及PCR期間變化的參照。從miRBas 中獲取各目標序列，其中EBV-miR-BART7-3p為5-CAUCAUAGUCCAGUGUCCAGGG-3;EBV-miR-BART17-5p為5-UAAGAGGACGCAGGCAUACAAG-3;cel-miR-39-3p為5-UCACCGGGUGUAAAUCAGCUUG-3。

1.2.3?BART-miRNAs的提取

采用天根生化科技生產(chǎn)的miRcute血清/外周血miRNA提取分離試劑盒從血漿中提取總RNA，即血漿200 μL與900 μL的裂解液MZA混勻，最終RNA在60 μL RNase-free Water中洗脫，保存于-80℃，直到進一步處理。提取過程中，所有樣本加入等量的cel-miR-39-3p（InvitrogenTM mirVanaTM miRNA Mimics），以監(jiān)測RNA提取的偏倚。

1.2.4?反轉(zhuǎn)錄與實時熒光定量PCR檢測

取9.16 μL總RNA加入2.84 μL反轉(zhuǎn)錄體系中，與3 μL的5×RT引物混勻，制備cDNA。反轉(zhuǎn)錄試劑盒TaqMan?MicroRNA Reverse Transcription Kit來自美國Applied Biosystems，反轉(zhuǎn)錄程序為：16℃ 30 min，42℃ 30 min反轉(zhuǎn)錄，85℃ 5 min終止反應，4℃保溫。取2 μL的cDNA作為模板加入18 μL配制好的PCR體系進行擴增。其中，配制PCR體系的TaqMan?Universal Master Mix Ⅱ（no UNG）以及PCR試劑盒TaqManTMSmall RNA Assay均來自美國Applied Biosystems。擴增條件為：95℃ 10 min，1個循環(huán);95℃ 15 s，60℃ 60 s，50個循環(huán)。

1.2.5?結(jié)果計算與分析

查看擴增圖譜，判斷有無擴增，然后根據(jù)需要調(diào)整基線和閾值，查看每孔的Ct值。模板的豐度越低，Ct值越大，Ct值>40為低表達或不表達。取3孔Ct值的平均值作為終值，對于分析后的Ct值，運用2-ΔCt法來計算基因的相對表達量，ΔCt=Ct目的基因-Ct參照。模板豐度越低，Ct值越大，ΔCt也越大，相應的2-ΔCt值越小，為方便數(shù)據(jù)計算，所得數(shù)值均放大10 000倍。

1.3?統(tǒng)計學方法

運用IBM SPSS Statistics 26.0軟件對各組數(shù)據(jù)進行正態(tài)性檢驗，結(jié)果各組數(shù)據(jù)均不符合正態(tài)分布，因而以中位數(shù)（四分位間距）[M（P25～P75）]描述各指標水平。采用K-W檢驗對各指標在鼻咽癌患者、非鼻咽癌患者與健康體檢者中的表達差異進行分析;采用K-W檢驗對各指標與患者T分期、N分期及臨床分期的關系進行統(tǒng)計分析;采用Mann-Whitney U 秩和檢驗對各指標與患者年齡、性別及M分期的關系進行統(tǒng)計分析;采用Friedman秩和檢驗對各指標在治療前中后的差異進行分析;采用Spearman秩相關檢驗分析兩變量的相關性，以α=0.05為檢驗水準，雙側(cè)檢驗。通過繪制ROC曲線，計算與比較ROC曲線下面積AUC，以評估各指標作為鼻咽癌診斷工具的性能。根據(jù)約登指數(shù)（Youden）最大原則選出最佳截斷值，計算靈敏度與特異度。

2?結(jié)?果

2.1?研究對象臨床資料特點

研究中對下列血漿樣本進行了檢測與分析：111例首診治療前鼻咽癌患者、42例治療后復發(fā)和（或）轉(zhuǎn)移鼻咽癌患者、22例非鼻咽癌患者以及24名健康體檢者，各組間性別、年齡比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見表1。

2.2?EBV-miR-BART7-3p、EBV-miR-BART17-5p在各組中的表達情況

剔除實驗重復孔結(jié)果之間差異大的樣本后，首診鼻咽癌患者治療前血漿中EBV-miR-BART7-3p與EBV-miR-BART17-5p的表達水平明顯高于非鼻咽癌患者和健康體檢者，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.001），表明EBV-miR-BART7-3p與EBV-miR-BART17-5p在鼻咽癌患者血漿樣本中是特異并且可被檢測的。見表2。

2.3?首診鼻咽癌患者治療前血漿EBV-miR-BART7-3p、EBV-miR-BART17-5p的表達與鼻咽癌患者臨床特點的關系

血漿EBV-miR-BART7-3p與EBV-miR-BART17-5p的相對表達水平均因患者的淋巴結(jié)播散情況（N分期）與臨床分期不同而存在統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表3。

2.4?治療對血漿EBV-miR-BART7-3p與EBV-miR-BART17-5p表達的影響

首診鼻咽癌患者中，41例患者具有綜合放化療結(jié)束時的血液樣本，其中16例患者同時具有2個療程化療后及綜合放化療結(jié)束時采集的血液樣本，研究中均對這些樣本進行檢測。為了分析治療對血漿中EBV-miR-BART7-3p與EBV-miR-BART17-5p表達水平的影響，評價它們是否能用來準確評估療效，研究中還檢測了鼻咽癌患者2療程化療后與綜合放化療結(jié)束時，血漿中EBV-miR-BART7-3與EBV-miR-BART17-5p的表達情況。結(jié)果顯示，隨著治療的進行，血漿EBV-miR-BART7-3p與EBV-miR-BART17-5p表達水平顯著下降，治療后，兩者的表達水平顯著低于治療前（P<0.001）。見表4。

2.5?綜合治療后復發(fā)或轉(zhuǎn)移鼻咽癌患者血漿中EBV-miR-BART7-3p與EBV-miR-BART17-5p的表達情況

綜合治療后發(fā)生復發(fā)和（或）轉(zhuǎn)移的鼻咽癌患者，血漿EBV-miR-BART7-3p和EBV-miR-BART17-5p的相對表達量顯著高于非鼻咽癌患者與健康體檢者（P<0.05）;與首診鼻咽癌患者比較，血漿EBV-miR-BART7-3p的表達水平較高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;綜合治療后發(fā)生復發(fā)和（或）轉(zhuǎn)移的鼻咽癌患者血漿EBV-miR-BART17-5p的相對表達量雖高于首診鼻咽癌患者，但是差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見圖1、2。

進一步比較綜合治療后復發(fā)或轉(zhuǎn)移的鼻咽癌患者血漿中EBV-miR-BART7-3p和EBV-miR-BART17-5p表達水平，發(fā)現(xiàn)綜合治療后發(fā)生轉(zhuǎn)移時，血漿EBV-miR-BART7-3p和EBV-miR-BART17-5p表達的水平顯著高于首診非轉(zhuǎn)移（M0）或轉(zhuǎn)移（M1）鼻咽癌患者，也高于治療后發(fā)生復發(fā)的患者（P<0.05）。見圖2、3。

2.6?EBV-miR-BART7-3p、EBV-miR-BART17-5p在鼻咽癌中的診斷價值

通過制作ROC曲線，評價EBV-miR-BART7-3p、EBV-miR-BART17-5p對鼻咽癌的診斷效能（圖4）。EBV-miR-BART7-3p診斷鼻咽癌準確度中等，AUC為0.829，約登指數(shù)為0.540，P<0.001，95%CI為（0.755～0.903）;EBV-miR-BART17-5p診斷鼻咽癌準確度中等，AUC為0.833，約登指數(shù)為0.691，P<0.001，95%CI為（0.757～0.908）。見表5。

3?討?論

EBV-BART-miRNAs在鼻咽癌中的作用機制已被廣泛研究，EBV-miR-BART7-3p與EBV-miR-BART17-5p與鼻咽癌的發(fā)生、發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移、復發(fā)等息息相關，強大、多效的生物學功能是其成為鼻咽癌診斷標志物并在臨床推廣應用的有力依據(jù)，市場前景廣闊[4，10～17]。此次研究中，我們比較了首診鼻咽癌患者治療前與非鼻咽癌患者、健康體檢者血漿中EBV-miR-BART7-3p與EBV-miR-BART17-5p的相對表達水平，結(jié)果顯示EBV-miR-BART7-3p與EBV-miR-BART17-5p在鼻咽癌患者血漿中相對高表達，在非鼻咽癌患者與健康體檢者血漿中相對低表達甚至不表達，與先前報道相似[13～14，18～19]，進一步驗證了檢測血漿EBV-miR-BART7-3p與EBV-miR-BART17-5p對于診斷鼻咽癌的臨床意義。

臨床分期以T、N、M分期為依據(jù)，目前，磁共振成像等影像學檢查是鼻咽癌臨床分期的首要或主要檢查手段與診斷依據(jù)，但是影像學檢查則更多以解剖學特征為依據(jù)，不容易發(fā)現(xiàn)早期病變的微小瘤灶，也不易于鑒別早期鼻咽癌與其他鼻咽增生性病變，在評估腫瘤狀態(tài)與判斷預后方面存在一定缺陷。而BART-miRNAs是由活的腫瘤細胞釋放的，因此在鼻咽癌早期，監(jiān)測BART-miRNAs的表達水平的變化可能比影像學檢查更有利于發(fā)現(xiàn)早期活躍的腫瘤細胞，有助于早期鼻咽癌的發(fā)現(xiàn)與鑒別。N分期代表著淋巴結(jié)的播散程度與范圍，是獨立的預后因素之一，并能提示復發(fā)或遠處轉(zhuǎn)移的風險[20]。分析數(shù)據(jù)顯示，血漿EBV-miR-BART7-3p與EBV-miR-BART17-5p的表達水平與患者的N分期呈正相關，隨著分期的增加，表達水平顯著上升，表明檢測這兩個BART-miRNAs能較好地反映轉(zhuǎn)移瘤灶的負荷水平，對預測預后有較好的指導價值。此外，基于EBV-miR-BART7-3p、EBV-miR-BART17-5p的表達與N分期相關性，以及關于EBV-miR-BART7-3p與EBV-miR-BART17-5p生物學功能的研究，可以推斷檢測血漿EBV-miR-BART7-3p與EBV-miR-BART17-5p的表達水平，理論上能提示是否存在遠處轉(zhuǎn)移。但此次研究結(jié)果顯示，血漿EBV-miR-BART7-3p與EBV-miR-BART17-5p的中位表達水平在非轉(zhuǎn)移性鼻咽癌和轉(zhuǎn)移性鼻咽癌患者之間無顯著差異，即與M分期無關，這或許是因為M0期與M1期患者人數(shù)相差懸殊造成結(jié)果存在偏倚。EBV-miR-BART7-3p與EBV-miR-BART17-5p以及其他BART-miRNAs的表達水平是否能更好地反映鼻咽癌的分期，需要進一步擴大樣本量作研究分析。

目前，臨床上常通過觸診、影像學檢查或纖維鼻咽鏡來觀察鼻咽腫物是否縮小或消退，并結(jié)合一些腫瘤標志物的表達水平的變化來判斷治療是否有效，而后續(xù)治療方案的選擇也以瘤灶的殘存情況為依據(jù)。然而，對于微小的殘存瘤灶，上述檢查手段是很難檢測到的。我們的數(shù)據(jù)顯示，41例綜合治療后的患者在治療結(jié)束時，查體或MRI提示頸部淋巴結(jié)縮小，或纖維鼻咽鏡檢查提示鼻咽腫物縮小甚至消退，或MRI提示鼻咽部瘤灶及頸部淋巴結(jié)較前縮小，臨床上以此為判斷治療有效的依據(jù)之一。檢測這41名患者血漿EBV-miR-BART7-3與EBV-miR-BART17-5p表達水平的變化，結(jié)果顯示，隨著治療的進行，血漿EBV-miR-BART7-3與EBV-miR-BART17-5p表達水平顯著下降，與其他學者的研究結(jié)果一致[14，18～19]。BART-miRNAs是來源于活的腫瘤細胞的，隨著治療的進行，腫瘤組織和細胞逐漸被清除、殺滅，活的腫瘤細胞減少，其分泌的BART-miRNAs隨之減少，從而循環(huán)中BART-miRNAs的檢出水平下降。盡管表達水平顯著下降，但并非均下降到無法檢出，或降低到與健康體檢者一樣的水平，19名影像學檢查或纖維鼻咽鏡檢查顯示腫物消退的患者，血漿中仍能檢測到EBV-miR-BART7-3與EBV-miR-BART17-5p。EBV-miR-BART7與EBV-miR-BART7-3p能增強鼻咽癌細胞對常用于鼻咽癌治療的化學藥物順鉑的耐藥性[11]，下調(diào)鼻咽癌細胞對放射治療的敏感性[12];EBV-miR-BART17-5p也有助于降低鼻咽癌細胞對順鉑的敏感性[15]。此外，放射會改變內(nèi)皮細胞中miRNAs的水平，而受影響的miRNAs則調(diào)節(jié)內(nèi)皮細胞在后續(xù)放射中對放射治療的敏感性[21]。由此我們推斷，上述因素可能最終導致鼻咽癌瘤灶不能被完全清除，而殘存的瘤灶或癌細胞體積十分微小，影像檢查手段難以發(fā)現(xiàn)，因而影響評估治療后腫瘤殘存情況與療效的準確性，也不利于臨床上對鼻咽癌患者放療后制訂有效的后續(xù)治療方案。因此，監(jiān)測血漿中殘留存活的細胞分泌的BART-miRNAs的表達水平變化應比影像學檢查更敏感，更能反映微小殘留瘤灶的情況，尤其是殘存的活細胞的情況，能為療效的監(jiān)測、改善治療方案與預后提供更可靠的依據(jù)。

本研究中，血漿EBV-miR-BART7-3p與EBV-miR-BART17-5p的表達水平在非轉(zhuǎn)移性鼻咽癌患者與轉(zhuǎn)移性鼻咽癌患者之間無顯著差異，但統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，綜合治療后發(fā)生轉(zhuǎn)移的患者，血漿EBV-miR-BART7-3p與EBV-miR-BART17-5p的表達水平明顯高于首診非轉(zhuǎn)移鼻咽癌患者、首診轉(zhuǎn)移鼻咽癌患者以及治療后復發(fā)的患者。BART-miRNAs由活躍的細胞釋放到細胞外環(huán)境中，血漿EBV-miR-BART7-3p與EBV-miR-BART17-5p水平顯著升高，提示殘留的EBV與鼻咽癌細胞重新活躍，EBV編碼的BART-miRNAs被大量釋放到細胞外環(huán)境中。而大量表達的BART-miRNAs再次活化多條相關的信號通路，從而增強了鼻咽癌的侵襲性與遠處轉(zhuǎn)移的能力。因此，對于綜合治療后的鼻咽癌患者，監(jiān)測外周血EBV-miR-BART7-3p與EBV-miR-BART17-5p等BART-miRNAs的水平，有利于早期發(fā)現(xiàn)潛在的轉(zhuǎn)移。

研究表明，EBV-miR-BART7-3p 有助于增強鼻咽癌細胞的自我更新能力和再生的干細胞特性[22]，EBV-miR-BART17-5p能促進細胞增殖而發(fā)揮促進癌癥發(fā)展的作用[16]，由此我們推斷，若治療不能完全清除EBV和癌細胞，殘存的EBV和癌細胞在放射與化學藥物的不斷刺激下，不僅增強了對放射治療與化療藥物的耐受性，而且EBV編碼的BART-miRNAs也持續(xù)對相關靶點進行調(diào)控，鼻咽癌細胞自我更新和再生的干細胞特性可能也得到了進一步增強，經(jīng)過長時間的自我修復、更新后，表現(xiàn)出了更強大的生物學活性，更活躍的鼻咽癌細胞釋放更大量的BART-miRNAs 到細胞外，并隨循環(huán)進一步播散到遠處的組織、器官，導致遠處轉(zhuǎn)移的發(fā)生，因此循環(huán)中的BART-miRNAs含量顯著升高。此次研究中，單獨應用EBV-miR-BART7-3p或EBV-miR-BART17-5p對鼻咽癌的診斷價值中， AUC分別為0.829和0.833，與其他學者的研究結(jié)果相似[11，19]。結(jié)果提示，檢測血漿中EBV-miR-BART7-3p與EBV-miR-BART17-5p，可為鼻咽癌早期診斷、鑒別診斷以及鼻咽癌分期系統(tǒng)的進一步研究，提供分子生物學的依據(jù)，并為患者預后判斷、個體化治療以及監(jiān)測治療后遠處轉(zhuǎn)移提供有效的指導。

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（收稿日期：2020-07-13?修回日期：2020-11-06）

（編輯：王琳葵?梁明佩）