基于SSR標(biāo)記的樹(shù)莓資源遺傳多樣性分析

鄧寬平 楊秀偉 楊勝偉 楊選輝 張永剛 陳榮輝 徐德林

摘要：為探索樹(shù)莓種內(nèi)個(gè)體之間和不同樹(shù)莓品種間的遺傳特性，應(yīng)用SSR標(biāo)記開(kāi)展樹(shù)莓的遺傳多樣性分析。對(duì)引進(jìn)、收集的樹(shù)莓種質(zhì)資源進(jìn)行基因組DNA提取，然后應(yīng)用PCR擴(kuò)增和PAGE電泳檢測(cè)篩選材料間的多態(tài)性SSR標(biāo)記，利用NTsys 2.10 e軟件進(jìn)行遺傳多樣性分析。結(jié)果表明，從75對(duì)SSR標(biāo)記中篩選出22對(duì)多態(tài)性良好的標(biāo)記引物，共擴(kuò)增得到285個(gè)條帶，引物擴(kuò)增出的清晰條帶數(shù)為7～25個(gè)，平均每對(duì)引物的多態(tài)性比率為96.8%。對(duì)引物的擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行聚類(lèi)分析發(fā)現(xiàn)，樹(shù)莓樣品在遺傳系數(shù)為0.71的水平上共聚類(lèi)為兩大類(lèi)群，第一類(lèi)包括21份樹(shù)莓樣品，其中除sm46、sm85、sm102從遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院引種外，其余樹(shù)莓樣品均來(lái)自貴州省，從遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院引種的22份樹(shù)莓樣品，除上述歸為第一類(lèi)的3份外，其余的與貴州省遵義市習(xí)水土城、貴州省雷山縣永樂(lè)、從廣東省引種的樹(shù)莓樣品歸為第二大類(lèi)。45份樹(shù)莓具有較豐富的遺傳多樣性，篩選出的SSR可有效應(yīng)用于貴州省樹(shù)莓品種的遺傳多樣性研究。

關(guān)鍵詞：樹(shù)莓;SSR標(biāo)記;種質(zhì)資源;遺傳多樣性;聚類(lèi)分析

中圖分類(lèi)號(hào)：S663.202?文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A?文章編號(hào)：1002-1302（2020）21-0062-06

樹(shù)莓（Rubus corchorifolius L.），別稱(chēng)懸鉤子、托盤(pán)、馬林等，為薔薇科（Rosaceae）樹(shù)莓屬（Rubus，別稱(chēng)懸鉤子屬）的多年生灌木漿果類(lèi)植物，其果實(shí)具有外觀鮮艷、口感細(xì)膩、風(fēng)味芳香等特點(diǎn)，除用作生食果品外，還可加工制成果醬、果酒、果汁、果凍、果羹及蜜餞等食品。此外，樹(shù)莓還是藥用植物，果實(shí)、莖、根皆可入藥，主要功效為醒酒、止渴、止血、解毒、鎮(zhèn)痛等。樹(shù)莓屬植物在我國(guó)27個(gè)?。ㄗ灾螀^(qū)）均有分布，并以西南地區(qū)分布最為集中，其中分布最廣泛的省份是貴州省、云南省、四川省、廣西壯族自治區(qū)、廣東省、福建省，其次為湖南省、湖北省及西藏自治區(qū)、陜西省、甘肅省等[1-3]，且是貴州省山地農(nóng)業(yè)開(kāi)發(fā)的重要經(jīng)濟(jì)作物。

我國(guó)約在20世紀(jì)80年代開(kāi)始大面積栽培樹(shù)莓，但品種選育工作尚處于起步階段，再加上樹(shù)莓育種過(guò)程中，會(huì)受到多倍體、無(wú)融合生殖、花粉不親和、種子發(fā)芽率低等遺傳問(wèn)題的影響[4-5]，樹(shù)莓育種工作變得漫長(zhǎng)而復(fù)雜。因此，結(jié)合地區(qū)經(jīng)濟(jì)發(fā)展實(shí)際，選擇根系發(fā)達(dá)、抗旱能力強(qiáng)的優(yōu)良樹(shù)種對(duì)改善樹(shù)莓種植業(yè)結(jié)構(gòu)、增加農(nóng)民受益、帶動(dòng)地方經(jīng)濟(jì)發(fā)展等具有重大意義?；跇?shù)莓的經(jīng)濟(jì)和藥用價(jià)值以及育種過(guò)程中所遭遇的亟需解決的問(wèn)題，從分子水平探討樹(shù)莓屬內(nèi)親緣關(guān)系，對(duì)種質(zhì)資源進(jìn)行遺傳分析和種質(zhì)評(píng)價(jià)，可進(jìn)一步了解樹(shù)莓親緣關(guān)系和遺傳差異，為樹(shù)莓遺傳多樣性研究、保育策略制定和雜交育種提供理論依據(jù)。

簡(jiǎn)單重復(fù)序列（simple sequence repeat，簡(jiǎn)稱(chēng)SSR）是一類(lèi)一般由1～6個(gè)堿基組成的基元串聯(lián)重復(fù)而成的DNA序列[6]。不同等位基因間的重復(fù)數(shù)存在豐富的差異，且重復(fù)序列兩側(cè)多是相對(duì)保守的單拷貝序列，可以通過(guò)設(shè)計(jì)特異引物，對(duì)基因組總DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增[7-8]，擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度多態(tài)性可用作分子標(biāo)記。SSR標(biāo)記是以SSR多態(tài)性為基礎(chǔ)的遺傳標(biāo)記，與其他分子標(biāo)記相比，具有多態(tài)性高、共顯性、重復(fù)性高、數(shù)量豐富和對(duì)基因組有很好的覆蓋性等特點(diǎn)[9-10]，被廣泛地用于構(gòu)建植物遺傳圖譜[11]、遺傳多樣性分析[12-13]、基因定位[14]、輔助育種等基礎(chǔ)應(yīng)用研究中[15-16]。利用SSR分子標(biāo)記技術(shù)可為樹(shù)莓分類(lèi)提供分子基礎(chǔ)，并了解其遺傳多樣性。

本試驗(yàn)使用SSR分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)45份樹(shù)莓樣品的遺傳多樣性進(jìn)行研究，旨在為樹(shù)莓的種群鑒別、資源評(píng)價(jià)與保護(hù)的策略制定、功能基因克隆以及雜交育種選育新品種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)于2019年7月進(jìn)行，采集新鮮、飽滿(mǎn)、無(wú)病蟲(chóng)的樹(shù)莓嫩葉10～20 g，就地迅速保存于自封袋中，置于冰盒中，帶回實(shí)驗(yàn)室于4 ℃冰箱內(nèi)保存，用于DNA的提取。樹(shù)莓種質(zhì)材料樣品信息見(jiàn)表1。

1.2 研究方法

1.2.1 DNA提取 使用植物基因組DNA提取試劑盒（型號(hào)為DP350-02，本試劑盒采用的是可以特異性結(jié)合DNA的吸附柱和獨(dú)特的裂解液緩沖體系，能高效提取多種不同植物組織中的基因組DNA）對(duì)45份樹(shù)莓材料的DNA進(jìn)行提取，并加入緩沖液保存于-20 ℃冰箱中。

1.2.2 SSR引物篩選 以sm43、sm95、sm96、sm99、sm103號(hào)樣品DNA為模板，進(jìn)行引物篩選。先從筆者所在課題組合成的75對(duì)樹(shù)莓特異SSR引物中挑選出38對(duì)擴(kuò)增穩(wěn)定、條帶清晰、多態(tài)性明顯的SSR引物，然后進(jìn)行體系優(yōu)化，從38對(duì)引物中篩選出22對(duì)重復(fù)性高的引物，用于45個(gè)樹(shù)莓樣品DNA的PCR擴(kuò)增及多態(tài)性檢測(cè)。引物信息見(jiàn)表2。

1.2.3 SSR-PCR擴(kuò)增 用篩選出的22對(duì)引物擴(kuò)增45份DNA樣品。樹(shù)莓SSR-PCR反應(yīng)體系為 10 μL，其中包括ddH2O 1 μL、DNA模板1.5 μL、Primer-F 和Primer-R各0.75 μL、Mix 6 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)?5 ℃預(yù)變性4～5 min;95 ℃變性30 s，55 ℃退火溫度30 s，72 ℃延伸40 s，共35個(gè)循環(huán);72 ℃延伸5 min，最后4 ℃ 59 min。

1.2.4 電泳、染色 利用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物在垂直電泳槽中進(jìn)行電泳分離，條件為150 V 90 min。電泳后銀染顯色（染色劑：1 g AgNO3+500 mL H2O，顯色劑：2 mL甲醛、7.5 g NaOH，加ddH2O至250 mL，拍照記錄顯影圖片。

1.3 數(shù)據(jù)分析

根據(jù)顯影圖片，SSR位點(diǎn)按照位點(diǎn)順序以及等位基因片段大小排列，采用“0，1”統(tǒng)計(jì)方法進(jìn)行試驗(yàn)數(shù)據(jù)記錄[17]。

根據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果，利用NTsys 2.10e軟件得出樣品的遺傳相似系數(shù)和UPGMA聚類(lèi)圖，進(jìn)而得出樣品之間的遺傳關(guān)系[18]。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA提取結(jié)果

使用植物基因組DNA提取試劑盒（型號(hào)為DP350-02 ）提取 45份樹(shù)莓鮮嫩葉片樣品的基因組 DNA，結(jié)果（圖1）顯示，45份樹(shù)莓樣品基因組DNA的電泳條帶清晰、無(wú)降解、純度較高，說(shuō)明提取的DNA質(zhì)量可滿(mǎn)足后續(xù)PCR擴(kuò)增反應(yīng)的要求。

2.2 SSR標(biāo)記的多態(tài)性

以sm43、sm95、sm96、sm99、sm103號(hào)材料的基因組DNA為模板，對(duì)75對(duì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增、篩選，其中有38對(duì)引物產(chǎn)生理想的PCR產(chǎn)物。部分引物篩選結(jié)果見(jiàn)圖2。

通過(guò)優(yōu)化體系，從38對(duì)引物中篩選出22對(duì)擴(kuò)增條帶清晰、重復(fù)性高的SSR引物，用于45份樹(shù)莓樣品DNA的PCR擴(kuò)增及多態(tài)性研究。結(jié)果表明，篩選出的22對(duì)SSR引物對(duì)45份樹(shù)莓樣品DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，共得到285個(gè)條帶，不同引物擴(kuò)增出的清晰條帶在7～25個(gè)范圍內(nèi)，平均每對(duì)引物產(chǎn)生12.9個(gè)條帶，其中多態(tài)性條帶有276個(gè)，多態(tài)性比率為96.8%，各引物的多態(tài)性比率為85.71%～100.00%。引物Rubus25a對(duì)45份材料的檢測(cè)結(jié)果（圖3）表明，樹(shù)莓樣品的遺傳多樣性較為豐富。

2.3 居群遺傳結(jié)構(gòu)

根據(jù)45份樹(shù)莓樣品DNA的SSR PCR擴(kuò)增結(jié)果得到的相似系數(shù)進(jìn)行聚類(lèi)分析結(jié)果（圖4）表明，當(dāng)閾值為0.71時(shí)，45份樣品被分為兩大類(lèi)群。

第一大類(lèi)由編號(hào)為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、19、21、22、34等21份樹(shù)莓樣品組成，其中除19、21、34從遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院引種外，其余樹(shù)莓樣品均來(lái)自貴州省，它們可在閾值為 0.745 5 時(shí)，進(jìn)一步分為6個(gè)亞類(lèi)。第1亞類(lèi)由編號(hào)為1、2、3、4、8、9、10、13、15、16、17、19的樣品組成;第2亞類(lèi)僅有由編號(hào)為14的樣品組成;第3亞類(lèi)由編號(hào)為6、7、11、12的樣品組成;第4亞類(lèi)僅由編號(hào)為5的樣品組成;第5亞類(lèi)由編號(hào)為21、22的樣品組成;第6亞類(lèi)僅由編號(hào)為34的樣品組成。

第二大類(lèi)由編號(hào)為18、20、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45等24份樹(shù)莓樣品組成。其中除18、20、23、24為貴州省品種、25引種自廣東省外，其余樹(shù)莓樣品均來(lái)自遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院。它們可在閾值為0.734 8時(shí)進(jìn)一步分為5個(gè)亞類(lèi)。第1亞類(lèi)由編號(hào)為18、32、35、36、39的樣品組成;第2亞類(lèi)由編號(hào)為20、24、26、27、41、42、43、44、45的樣品組成;第3亞類(lèi)由編號(hào)為23、30、33、37、40的樣品組成;第4亞類(lèi)由編號(hào)為25、28、29、31的樣品組成;第5亞類(lèi)僅由編號(hào)為38的樣品組成。通過(guò)聚類(lèi)分析結(jié)果可知，不同類(lèi)型的樹(shù)莓品種之間遺傳相似性較小，不同來(lái)源的樹(shù)莓品種間親緣關(guān)系也比較遠(yuǎn)。

3 討論與結(jié)論

本研究結(jié)果表明，從遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院引種的樣品44和45親緣關(guān)系最近，其遺傳相似系數(shù)為0.917 6。來(lái)自赤水市金沙溝鎮(zhèn)的樣品12和從遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院引種的樣品32遺傳相似系數(shù)最小，為0.627 2。研究表明，遺傳距離與雜種優(yōu)勢(shì)存在相關(guān)關(guān)系，遺傳相似系數(shù)越小，其雜種優(yōu)勢(shì)越大[19]，因此育種時(shí)可選取樣品12和樣品32作為親本進(jìn)行雜交，選育優(yōu)良品種應(yīng)用于生產(chǎn)。

同時(shí)來(lái)自不同省份的樹(shù)莓樣品親緣關(guān)系可以很近，如播州區(qū)楓香鎮(zhèn)的樣品1和從遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院引種的樣品19，二者雖生長(zhǎng)在不同地區(qū)，但二者遺傳相似系數(shù)為0.799 3，親緣關(guān)系很近，推測(cè)樣品1和樣品19雖然來(lái)自不同地區(qū)，但存在樹(shù)莓品種相互引進(jìn)種植等問(wèn)題，同一種屬的樹(shù)莓因生長(zhǎng)在不同的土壤、養(yǎng)料、溫度和水分環(huán)境下，其遺傳性狀發(fā)生了變化，具體原因需進(jìn)一步研究。與此同時(shí)，采集自同一省份同一地區(qū)的樹(shù)莓樣品親緣關(guān)系也會(huì)相距甚遠(yuǎn)，如遵義市習(xí)水民化鎮(zhèn)的樣品14和遵義市習(xí)水土城的樣品18親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，遺傳相似系數(shù)為0.673 8，推測(cè)可能是因其種子以及花粉的散布，出現(xiàn)種內(nèi)或種間的雜交，導(dǎo)致種內(nèi)甚至種間基因交流。

遺傳多樣性是植物種質(zhì)資源研究的重要內(nèi)容之一，全面地掌握現(xiàn)有種質(zhì)資源的遺傳多樣性，可以減少育種工作中親本選配的盲目性，從而提高育種效率[18-19]。遺傳多樣性的研究最可靠的是基因水平的研究，其中進(jìn)行基因測(cè)序是最直接、最具說(shuō)服力的方法，但是對(duì)于一個(gè)物種或一個(gè)種屬中的每個(gè)樣品都進(jìn)行基因組測(cè)序的可行性較低。SSR、擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性（AFLP）、簡(jiǎn)單重復(fù)序列間擴(kuò)增（ISSR）等技術(shù)的出現(xiàn)使得分子標(biāo)記技術(shù)得到高速發(fā)展。

本研究通過(guò)SSR技術(shù)對(duì)樹(shù)莓進(jìn)行遺傳多樣性分析，該方法可直接通過(guò)樣本DNA鑒別不同地區(qū)材料間的差異性，相對(duì)于傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定歸類(lèi)方法，用時(shí)較短且不受季節(jié)、環(huán)境限制。此外，還有利于樹(shù)莓現(xiàn)有優(yōu)良種質(zhì)資源的研究，同時(shí)可為構(gòu)建樹(shù)莓遺傳連鎖圖譜奠定基礎(chǔ)。選用SSR分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)45份樹(shù)莓品系進(jìn)行遺傳多樣性研究，從75對(duì)引物中篩選出22對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，共得到285個(gè)條帶，不同引物擴(kuò)增出的清晰條帶在7～25個(gè)范圍內(nèi)，平均每對(duì)引物產(chǎn)生12.9個(gè)條帶，其中多態(tài)性條帶276條，多態(tài)性比率為96.8%，各引物的多態(tài)性比率為85.71%～100.00%。同時(shí)本研究初步明晰了貴州省部分樹(shù)莓品種的親緣關(guān)系，并應(yīng)用22對(duì)SSR引物將貴州省推廣種植的45個(gè)樹(shù)莓品種區(qū)分開(kāi)。表明SSR標(biāo)記技術(shù)是一種對(duì)于樹(shù)莓遺傳多樣性研究較為合適的方法。開(kāi)發(fā)樹(shù)莓的SSR標(biāo)記不僅可進(jìn)一步提高遺傳多樣性分析的可靠性，而且更容易實(shí)現(xiàn)數(shù)據(jù)的共享，可有力促進(jìn)樹(shù)莓優(yōu)良品種選育進(jìn)程和產(chǎn)業(yè)延伸。今后可根據(jù)聚類(lèi)分析結(jié)果鑒定與分析特定優(yōu)良品種的抗性或農(nóng)藝性狀，培育出適合生產(chǎn)應(yīng)用推廣的高質(zhì)量樹(shù)莓品種。

參考文獻(xiàn)：

[1]左經(jīng)會(huì)，向 紅，王緒英，等. 貴州西部懸鉤子屬植物資源研究及開(kāi)發(fā)利用[C]//中國(guó)植物學(xué)會(huì)第十六次全國(guó)會(huì)員代表大會(huì)暨85周年學(xué)術(shù)年會(huì)論文摘要匯編，2018.

[2]楊鼎元，張群英，陳 哲，等. 懸鉤子屬植物的組培快繁技術(shù)研究進(jìn)展[J]. 現(xiàn)代園藝，2019（11）：16-18.

[3]桂明珠，胡寶忠. 小漿果栽培生物學(xué)[M]. 北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2002：36-38.

[4]郭清明. 優(yōu)良樹(shù)莓品種及當(dāng)?shù)匾吧鷺?shù)莓的引種比較研究[J]. 低碳世界，2017（34）：344-345.

[5]劉 會(huì)，彭春鈺，武忠亮，等. 植物SSR標(biāo)記開(kāi)發(fā)及應(yīng)用研究進(jìn)展[J]. 科學(xué)技術(shù)創(chuàng)新，2018（36）：18-20.

[6]徐德林，陳紅波，馬 激，等. 白及SSR-PCR擴(kuò)增體系的優(yōu)化[J]. 中成藥，2018，40（12）：2672-2676.

[7]Li L，F(xiàn)ang Z W，Zhou J F，et al. An accurate and efficient method for large-scale SSR genotyping and applications[J]. Nucleic Acids Research，2017，45（10）：e88.

[8]Xu D L，Chen H B，Aci M，et al. De Novo assembly，characterization and development of EST-SSRs from Bletilla striata transcriptomes profiled throughout the whole growing period[J]. PLoS One，2018，13（10）：e0205954.

[9]李媛媛，郭修武，代漢萍，等. 樹(shù)莓SSR體系的建立及優(yōu)化[J]. 沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，40（4）：478-480.

[10]Dong H，Shang X D，Zhao X Y，et al. Construction of a genetic linkage map of Lentinula edodes based on SSR，SRAP and TRAP markers[J]. Breeding Science，2019，69（4）：585-591.

[11]Adjebeng-Danquah J，Manu-Aduening J，Asante I K，et al. Genetic diversity and population structure analysis of Ghanaian and exotic cassava accessions using simple sequence repeat （SSR） markers[J]. Heliyon，2020，6（1）：e03154.

[12]忻 雅，方獻(xiàn)平，王淑珍，等. 簡(jiǎn)單重復(fù)序列標(biāo)記和序列相關(guān)擴(kuò)增多態(tài)性標(biāo)記在草莓遺傳多樣性分析中的比較[J]. 浙江大學(xué)學(xué)報(bào)（農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版），2019，45（3）：278-287.

[13]張懷山，鄢秀芹，魯 敏，等. 基于EST-SSR標(biāo)記的貴州野生刺梨居群遺傳多樣性分析[J]. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，50（6）：1098-1108.

[14]吳 晶，項(xiàng)顯波，陸開(kāi)形，等. 水稻超短根突變體ssr1的遺傳分析和基因定位[J]. 西北植物學(xué)報(bào)，2015，35（4）：701-706.

[15]單紅麗，李文鳳，黃應(yīng)昆，等. 甘蔗抗褐銹病基因定位親本間多態(tài)性SSR標(biāo)記篩選[J]. 核農(nóng)學(xué)報(bào)，2019，33（11）：2119-2125.

[16]Dipnarayan S，Rajeev S R，Sukla C，et al. Development of a set of SSR markers for genetic polymorphism detection and interspecific hybrid jute breeding[J]. The Crop Journal，2017，5（5）：416-429.

[17]Qi Z，Mu K M，Ni Z X，et al. Analysis of genetic diversity of ancient ginkgo populations using SSR markers[J]. Industrial Crops and Products，2020，145：111942.

[18]蘇一鈞，王 嬌，霍愷森，等. 甘薯引進(jìn)種SSR遺傳多樣性分析[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2018，34（5）：984-997.

[19]張鶴山，陳志宏，田 宏，等. 49份白三葉種質(zhì)資源遺傳多樣性的SSR分析[J]. 種子，2019，38（11）：1-6.于少帥，趙文霞，姚艷霞，等. 新疆野蘋(píng)果和栽培蘋(píng)果特異性SSR標(biāo)記開(kāi)發(fā)及應(yīng)用[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2020，48（21）：68-73，83.