白菜尾菜與稻草秸稈混合青貯飼料對(duì)瘤胃微生物體外發(fā)酵的影響

常榮鑫，戚如鑫，史劍云，張振斌，王夢(mèng)芝

（揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇揚(yáng)州 225009）

我國(guó)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)所產(chǎn)生的農(nóng)作物秸稈和尾菜面廣量大，但資源化利用率較低，是目前農(nóng)業(yè)面源污染源之一；同時(shí)，我國(guó)的養(yǎng)殖飼料資源相對(duì)短缺。因此，秸稈和尾菜的資源化對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)生態(tài)環(huán)境治理和飼料資源開(kāi)發(fā)有雙重意義。據(jù)2013 年中國(guó)統(tǒng)計(jì)年鑒報(bào)道，我國(guó)蔬菜的種植面積和產(chǎn)量分別占世界的43% 和49%[1]，2015 年我國(guó)蔬菜產(chǎn)量達(dá)7.8 億t，較2012 年增長(zhǎng)10.8%，年均增長(zhǎng)3.6%[1-4]。李東霞等[5]認(rèn)為，蔬菜生產(chǎn)中廢棄的尾菜約為20%～67%，推算2015 年我國(guó)蔬菜尾菜產(chǎn)量為1.56 億～5.23 億t。另外，我國(guó)每年可生產(chǎn)秸稈7 億t 以上，其中每年水稻秸稈產(chǎn)量大約為2.4 億t[6-7]。目前，秸稈的資源化利用率也較低，其中，約33%廢棄或露天焚燒、約20%作為生活燃料、僅約15%作為飼料[7]。可見(jiàn)，尾菜和秸稈的資源化利用有待進(jìn)一步研究。

青貯技術(shù)可飼料化處理尾菜或秸稈，但由于農(nóng)作廢棄物各自的營(yíng)養(yǎng)特點(diǎn)，單獨(dú)青貯效果不佳。稻草秸稈的水分含量是15%[8]；白菜尾菜水分含量是94.70%[9]。若單獨(dú)青貯，可能會(huì)由于水分含量過(guò)低或過(guò)高導(dǎo)致青貯效果不佳。依據(jù)養(yǎng)分搭配進(jìn)行混合青貯則可在一定程度上改善青貯效果。李海玲等[10]將白菜尾菜和小麥秸稈按一定比例進(jìn)行混合發(fā)酵，增加了兩者飼料化的可利用性。戴洪偉等[11]將玉米秸稈和蓮花菜尾菜利用酵母菌進(jìn)行發(fā)酵，提高了原物料中粗脂肪和粗蛋白質(zhì)含量。綜上，混合青貯不僅可以獲得較高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的飼料，還可合理配置資源并節(jié)約處理成本。鑒于我國(guó)水稻和白菜栽培面積都較為廣泛，為了更好地開(kāi)發(fā)非飼料資源和緩解農(nóng)廢環(huán)境問(wèn)題，本課題組前期采用不同添加劑對(duì)稻草和白菜尾菜進(jìn)行了混合青貯，經(jīng)測(cè)定提高了飼料的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[12]，但其對(duì)瘤胃發(fā)酵性能的影響還有待進(jìn)一步研究。為此，本試驗(yàn)擬通過(guò)體外模擬瘤胃發(fā)酵，研究稻草和白菜尾菜的混合青貯飼料對(duì)瘤胃體外發(fā)酵的影響，以進(jìn)一步篩選適宜于反芻動(dòng)物瘤胃微生物發(fā)酵的復(fù)合青貯飼料，為今后飼養(yǎng)試驗(yàn)的開(kāi)展及其在動(dòng)物生產(chǎn)中的應(yīng)用技術(shù)研發(fā)提供試驗(yàn)資料。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物與飼養(yǎng)管理 在揚(yáng)州大學(xué)實(shí)驗(yàn)農(nóng)牧場(chǎng)選取4 頭健康狀況良好、體況相近且裝有永久性瘤胃瘺管的綿羊，用于提供體外模擬瘤胃發(fā)酵試驗(yàn)所需的瘤胃液。試驗(yàn)用綿羊的精飼料為玉米和豆粕，粗飼料為燕麥草，精粗比為4:6。每日07:00 和19:00 等量飼喂，自由飲水。

1.2 試驗(yàn)與采樣設(shè)計(jì) 在前期L9（33）三因素三水平正交設(shè)計(jì)青貯試驗(yàn)基礎(chǔ)上，篩選出青貯45 d 且青貯質(zhì)量較好的3 個(gè)處理組，以未加添加劑處理的青貯飼料為對(duì)照組（表1），進(jìn)行體外模擬瘤胃微生物發(fā)酵試驗(yàn)。每組各設(shè)置3 個(gè)重復(fù)，并設(shè)置空白組。培養(yǎng)開(kāi)始后，分別在0、12、24、36 h 采集培養(yǎng)液樣品并測(cè)定pH，以進(jìn)一步篩選出適合瘤胃發(fā)酵的青貯飼料優(yōu)選組。

表1 稻草秸稈+白菜尾菜混合青貯飼料的體外模擬發(fā)酵試驗(yàn)分組

1.3 體外培養(yǎng)試驗(yàn) 參照王加啟[13]的研究方法配制人工瘤胃緩沖液所需的溶液A、溶液B、溶液C、還原劑、刃天青溶液。試驗(yàn)前按以下比例配制瘤胃緩沖液：向400 mL 蒸餾水中分別加入0.1 mL 溶液A、200 mL 溶液B、200 mL 溶液C、1 mL 刃天青溶液和40 mL 還原劑，將以上溶液混勻通入CO2至飽和，并預(yù)熱至39℃。

于晨飼前從4 只瘺管羊瘤胃中采集瘤胃液，混勻后用4 層紗布過(guò)濾，裝入39℃預(yù)熱且充滿(mǎn)CO2的保溫瓶中后迅速帶到實(shí)驗(yàn)室，置于39℃水浴鍋中保溫并向瘤胃液中持續(xù)通入CO2以待接種。稱(chēng)取0.4 g 底物樣品于培養(yǎng)瓶中，每組3 個(gè)重復(fù)。將20 mL 瘤胃液和40 mL緩沖液迅速加入培養(yǎng)瓶中，并向瓶中通入CO2后將培養(yǎng)瓶置于39℃的恒溫振蕩水浴鍋中培養(yǎng)。在0、12、24、36 h 進(jìn)行樣品采集，即時(shí)測(cè)定pH；將1 mL 培養(yǎng)液加入1 mL 原蟲(chóng)染色液MFS 中，搖勻后靜置以用于原蟲(chóng)計(jì)數(shù)；用濾袋過(guò)濾殘?jiān)⑹占^(guò)濾出的培養(yǎng)液，分裝保存于-80℃，以待氨氮和微生物蛋白濃度的測(cè)定。殘?jiān)?jīng)洗滌和烘干后用于測(cè)定酸性洗滌纖維（ADF）降解率。

1.4 測(cè)定指標(biāo)及方法 采用梅特勒-托利多（FE20）pH計(jì)檢測(cè)pH。參照Broderick 等[14]的苯酚-次氯酸鈉比色法測(cè)定氨氮濃度。參照蘇海涯[15]的方法測(cè)定培養(yǎng)液中微生物蛋白濃度。首先采用酵母RNA 進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制作，再根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算出RNA 測(cè)定值，最后根據(jù)公式計(jì)算微生物蛋白濃度：

微生物蛋白濃度（mg/mL）=RNA 測(cè)定值（mg/mL）×RNA 含氮量（17.83%）×稀釋倍數(shù)× 6.25/細(xì)菌中RNA含氮量（10%）

參照王夢(mèng)芝等[16]的方法進(jìn)行原蟲(chóng)計(jì)數(shù)。將采集后的培養(yǎng)液立刻用MFS 染色液染色，采用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行計(jì)數(shù)。計(jì)算公式：

原蟲(chóng)數(shù)（個(gè)/mL）=N/4×D×16×10×1000=N×D×4×104其中，N 為計(jì)數(shù)4 個(gè)中方格的總數(shù)；D 為稀釋倍數(shù)。

參考張麗英[17]的《飼料分析及飼料質(zhì)量檢測(cè)技術(shù)》（第三版）測(cè)定培養(yǎng)前和36 h 培養(yǎng)后ADF 含量，并計(jì)算ADF 的36 h 降解率。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析 采用Excel 2013 對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行初步整理，再采用SPSS 16.0 對(duì)不同指標(biāo)進(jìn)行單因素方差分析，并用Duncan′s 法進(jìn)行多重比較。差異顯著水平判斷標(biāo)準(zhǔn)為P＜0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理的白菜尾菜與稻草秸稈混合青貯對(duì)體外發(fā)酵培養(yǎng)液pH 的影響 由表2 可知，各組底物在培養(yǎng)試驗(yàn)期間pH 在6.77～6.94。其中，36 h 時(shí)，1 組顯著高于其他各組。

2.2 不同處理的白菜尾菜與稻草秸稈混合青貯對(duì)體外發(fā)酵培養(yǎng)液氨氮濃度的影響 由表3 可知，總體上各組氨氮濃度在20.09～44.39 mg/100mL。其中24 h 和36 h 時(shí)組間都有顯著差異。12 h 時(shí)的氨氮濃度為1 組＞2 組＞對(duì)照組＞3 組，1 組顯著高于3 組；24 h 時(shí)為2 組＞3 組＞1 組＞對(duì)照組，3 個(gè)處理組均顯著高于對(duì)照組；36 h 時(shí)為3 組＞2 組＞1 組＞對(duì)照組，2 組、3 組顯著高于對(duì)照組。培養(yǎng)期間培養(yǎng)液氨氮濃度的均值則以2 組相對(duì)較低。

表3 不同處理的白菜尾菜與稻草秸稈混合青貯對(duì)體外發(fā)酵培養(yǎng)液氨氮濃度的影響 mg/100mL

2.3 不同處理的白菜尾菜與稻草秸稈混合青貯對(duì)體外發(fā)酵培養(yǎng)液微生物蛋白濃度和混合青貯ADF 的36 h 降解率的影響 由表4 可知，整體上各組皆以24 h 時(shí)微生物蛋白濃度最高。不同處理的青貯飼料對(duì)瘤胃體外微生物蛋白濃度有顯著影響。其中，0 h 和24 h 組間差異不顯著，12 h 和36 h 時(shí)皆以2 組的微生物蛋白濃度最高，且培養(yǎng)期微生物蛋白濃度的均值以2 組最高。另外，3個(gè)處理組ADF 的36 h 降解率均高于對(duì)照組，且以3 組最高，顯著高于對(duì)照組。

表4 不同處理的白菜尾菜與稻草秸稈混合青貯對(duì)體外發(fā)酵培養(yǎng)液微生物蛋白濃度和混合青貯ADF36 h 降解率的影響

2.4 不同處理的白菜尾菜與稻草秸稈混合青貯對(duì)體外發(fā)酵培養(yǎng)液原蟲(chóng)密度的影響 由表5 可以看出，各組的原蟲(chóng)密度隨培養(yǎng)時(shí)間呈先上升后下降的動(dòng)態(tài)趨勢(shì)，整體上在12 h 時(shí)各組原蟲(chóng)密度普遍達(dá)到最高值。36 h 時(shí)，2 組和3 組顯著高于對(duì)照組。培養(yǎng)期原蟲(chóng)密度的均值以3 組最高，2 組次之。

3 討 論

瘤胃微生物蛋白是反芻動(dòng)物宿主蛋白質(zhì)的主要供應(yīng)來(lái)源，且能夠提供反芻動(dòng)物所需蛋白質(zhì)的40%～80%[18]。pH 是反映瘤胃發(fā)酵情況的重要指標(biāo)，反芻動(dòng)物瘤胃微生物生長(zhǎng)適宜的pH 范圍為6～7，微生物蛋白合成適宜的pH 范圍為6.3～7.4[19]。本研究中各組培養(yǎng)液pH（6.77～6.94）均在瘤胃微生物生長(zhǎng)和微生物蛋白合成的適宜范圍。本研究中以第2 組的微生物蛋白濃度較高，這可能是由于其青貯效果較好，可利用養(yǎng)分含量較高以及底物養(yǎng)分降解率較高所致。本課題組前期檢測(cè)表明，第2 組的45 d 青貯的樣品其可溶性糖含量（對(duì)照組、1 組、2 組、3 組可溶性糖含量分別為1.93%、1.78%、2.20%、2.12%）和粗蛋白質(zhì)含量（對(duì)照組、1 組、2 組、3 組的粗蛋白質(zhì)含量分別為5.28%、7.66%、7.50%、6.81%）在各處理組中都相對(duì)較高；而ADF 含量則相對(duì)較低（對(duì)照組、1 組、2 組、3 組的ADF 含量分別為39.50%、33.48%、31.56%、32.62%）[12]，在利于微生物的生長(zhǎng)方面有一定的一致性。同時(shí)，第2 組ADF 的36 h 降解率也相對(duì)較高，都說(shuō)明第2 組的處理較有利于瘤胃微生物的生長(zhǎng)。

氨氮濃度可以在一定程度上反映瘤胃微生物對(duì)蛋白質(zhì)降解和對(duì)氨氮利用的程度。過(guò)高會(huì)超過(guò)瘤胃微生物所需氨氮的最大濃度，多余的氨氮積累不利于瘤胃微生態(tài)環(huán)境的平衡和微生物的生長(zhǎng)[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，氨氮濃度在培養(yǎng)期一直上升，在24 h 時(shí)氨氮濃度達(dá)到瘤胃微生物適宜生長(zhǎng)的最大濃度，所以在12～24 h 時(shí)的微生物蛋白濃度也在所測(cè)定時(shí)間點(diǎn)中較高。但在36 h 氨氮濃度超過(guò)了適宜微生物的濃度，這可能是由于體外培養(yǎng)沒(méi)有代謝物外移使得氨氮濃度不斷積累，其積累超過(guò)一定程度則可能抑制微生物的生長(zhǎng)。本研究結(jié)果也表明，在24～36 h 時(shí)微生物蛋白的濃度有所下降。組間以第2 組的氨氮濃度較低，可能是所使用的發(fā)酵飼料更適宜于微生物生長(zhǎng)，從而使得微生物對(duì)氨氮利用較多所致，第2組的微生物蛋白濃度較高也說(shuō)明了這一點(diǎn)。

瘤胃原蟲(chóng)在維持瘤胃微生態(tài)平衡、促進(jìn)纖維物質(zhì)和蛋白質(zhì)利用、降低硝酸鹽和亞硝酸鹽毒性等方面都至關(guān)重要，同時(shí)其活性和數(shù)量也受培養(yǎng)底物以及培養(yǎng)液環(huán)境多種因素的影響[21]。本研究中，原蟲(chóng)密度隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)有所增加，至12 h 達(dá)到最高值。這表明12 h 時(shí)培養(yǎng)液環(huán)境較適宜于其生長(zhǎng)，而后發(fā)酵的持續(xù)和代謝物的積累抑制了其增殖。另有研究表明，原蟲(chóng)有可溶性糖趨向性，在吞噬淀粉等底物后會(huì)隱匿在秸稈或瘤胃腹囊部，在下一次宿主采食時(shí)再次回到瘤胃液中吞噬底物[22]。這可能是本研究中12 h 原蟲(chóng)密度達(dá)到最高之后又有所下降的原因之一。本研究中，以2 組和3 組的原蟲(chóng)密度較高，可能與上述兩組的可溶性糖含量（對(duì)照組、1 組、2 組、3 組的可溶性糖含量分別為1.93%、1.78%、2.20%、2.12%）較高有關(guān)。

表5 不同處理的白菜尾菜與稻草秸稈混合青貯對(duì)體外發(fā)酵培養(yǎng)液原蟲(chóng)密度的影響 ×104 cells/mL

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)中，第2 組青貯飼料的瘤胃微生物蛋白濃度較高，而且其原蟲(chóng)密度較高、氨氮濃度較低。說(shuō)明稻草秸稈與白菜尾菜比例為4:6 混合青貯時(shí)，采用植物乳桿菌0.035 g/kg、纖維素酶0.250 g/kg 的組合處理，能夠獲得品質(zhì)較好且適宜于體外培養(yǎng)瘤胃微生物的發(fā)酵。