SerpinB6b 在大鼠著床期子宮及蛻膜的表達(dá)與調(diào)控

騰瑤瑤，李世杰，馬興紅

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150030）

大鼠早期妊娠通常是指妊娠第1～9 天，大鼠交配后檢測到陰道栓，即為妊娠第1 天。早期妊娠包括受精、著床前胚胎發(fā)育、胚胎著床和蛻膜化等幾個關(guān)鍵事件。胚胎著床是胚胎經(jīng)歷定位、黏附和侵入，最終植入于子宮內(nèi)膜的過程[1]，其關(guān)鍵在于活化的胚胎與處于“接受態(tài)”的子宮密切合作，而該過程受到卵巢分泌的類固醇激素、細(xì)胞因子、黏附分子和酶類等多種因素的調(diào)節(jié)[2]。大鼠胚胎著床發(fā)生在妊娠第6 天，在著床過程中，胚胎周圍的基質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行廣泛增殖與分化，轉(zhuǎn)變?yōu)橥懩ぜ?xì)胞，這一過程被稱為子宮基質(zhì)細(xì)胞蛻膜化[3]。蛻膜化異常會導(dǎo)致妊娠失敗[2]，因此妊娠過程中蛻膜化至關(guān)重要。

絲氨酸蛋白酶抑制劑亞家族成員B（Serine Peptidase Inhibitor，Clade B，SerpinB）有15 個成員，其成員SerpinB6 是由白細(xì)胞、血小板、內(nèi)皮細(xì)胞等產(chǎn)生的一種胞內(nèi)絲氨酸蛋白酶抑制劑[4]。Charron 等[5]研究發(fā)現(xiàn)，SerpinB6 在小鼠性腺生殖細(xì)胞中有表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)，SerpinB6b（SerpinB6 成員之一）的表達(dá)與小鼠胚胎著床及蛻膜化相關(guān)[6]，但SerpinB6b在大鼠圍著床期子宮中的表達(dá)和作用機(jī)制尚無報道。本研究采用原位雜交、熒光定量PCR、免疫組織化學(xué)和蛋白質(zhì)印跡分析等方法檢驗(yàn)SerpinB6b在大鼠早期妊娠1～9 d、人工誘導(dǎo)蛻膜化及體外誘導(dǎo)蛻膜化模型子宮中的表達(dá)規(guī)律，探究SerpinB6b的功能。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 實(shí)驗(yàn)所采用的模式動物為性成熟的SD品系大鼠，約6～12 周齡，購買自黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)。人工控制飼養(yǎng)環(huán)境為室溫22℃，光照時間為07:00—19:00，自由采食及飲水。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物模型

1.2.1 早期妊娠 將性成熟的雌性大鼠與雄性大鼠按3:1的比例于16:00 合籠進(jìn)行交配，次日07:00 進(jìn)行檢栓及陰道涂片，在雌鼠陰道內(nèi)發(fā)現(xiàn)精子則記作該鼠妊娠懷孕的第1 天。收集早期妊娠1～9 d 的大鼠子宮，在對應(yīng)天數(shù)09:00 之前完成取材。第1 天子宮取材是以雌鼠見栓和陰道涂片發(fā)現(xiàn)精子為依據(jù)；第2～5 天子宮取材需用生理鹽水從輸卵管或子宮中沖出胚胎確定妊娠；第6 天子宮取材前，先從大鼠尾部靜脈注射1%芝加哥藍(lán)，以確認(rèn)大鼠胚胎的著床位點(diǎn)；第7～9 天，在大鼠子宮中已經(jīng)能明顯觀察出著床位點(diǎn)，確定妊娠發(fā)生，可直接取材。

1.2.2 人工誘導(dǎo)蛻膜化 選取健康且輸精管結(jié)扎、性成熟的雄性大鼠，與性成熟的健康雌性大鼠1 對1 進(jìn)行交配，次日見到陰道栓證明交配成功，見栓當(dāng)日記為假孕第1 天。在其假孕第5 天時，對其中一側(cè)子宮的子宮角進(jìn)行芝麻油注射，另一側(cè)不注射，作為對照。在第9 天時處死、取材。

1.3 熒光定量PCR

1.3.1 引物設(shè)計合成 根據(jù)熒光定量設(shè)計要求，于NCBI中獲取大鼠SerpinB6b基因、GAPDH基因和PRL基因的mRNA 序列并用Primer 5 進(jìn)行引物設(shè)計。選取引物（表1）送通用生物系統(tǒng)（安徽）有限公司進(jìn)行合成。

表1 引物序列

1.3.2 總RNA 提取及cDNA 合成 按照RNA 提取試劑盒（TRIzol?Reagent kit，Invitrogen 公司）說明 進(jìn)行大鼠子宮組織總RNA 提取實(shí)驗(yàn)。Nano Drop 2000（Thermo 公司）測定RNA 濃度及純度；使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（GoScript Reverse Transcription Mix，Promega公司），反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，保存在-20℃。

1.3.3 熒光定量PCR 使用TB GreenTMPremix Ex TaqTM（Tli RNaseH Plus）試劑盒（TaKaRa 公司），反應(yīng)體系為10 μL，按照說明書操作，反應(yīng)條件：95℃ 30 s，95℃5 s，60℃ 30 s，40 個循環(huán)后收集熒光信號。在Amplied Biosystems?7500 Real-Time PCR System（Amplied Biosystems）機(jī)器中進(jìn)行，反應(yīng)過程以GAPDH為內(nèi)參，計算基因相對表達(dá)量，采用2－△△ct進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.4 原位雜交 將凍存的正常妊娠1～9 d 和人工蛻膜化大鼠子宮組織切片、4%多聚甲醛（Paraformaldehyde，PFA）固定1 h。使用地高辛標(biāo)記的SerpinB6bRNA 探針于雜交液中，55 ℃雜交過夜。洗滌，1% Blocking solution 室溫封閉1 h。Anti-DNP-AP（1:200，PerkinElmer公司）4 ℃避光孵育過夜。滴加顯色試劑NBT/BCIP（1:50）與 2 mmol/L 左旋咪唑室溫顯色，甲基綠對染，甘油封片，照相。

1.5 免疫組織化學(xué) 取石蠟包埋的正常妊娠1～9 d 和人工蛻膜化大鼠子宮組織切片、烘片1 h，用二甲苯除蠟；梯度乙醇入水；檸檬酸鈉修復(fù)液98℃修復(fù)10 min；3%H2O2去除內(nèi)源性過氧化物酶；10%馬血清（用PBS 配制）室溫避光孵育1 h；兔抗大鼠SerpinB6b 單克隆抗體（1:1 000）4℃避光孵育過夜；洗滌，辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG（ABclonal 公司）室溫避光孵育1 h；DAB顯色；蘇木精對染，脫水、透明、中性樹脂封片，照相。

1.6 蛋白質(zhì)印跡分析 將凍存的正常妊娠1～9 d 和人工蛻膜化大鼠子宮組織加入到冰上預(yù)冷的蛋白裂解液中，用勻漿器間隔研磨，用BCA 蛋白濃度測定試劑盒（Biosharp 公司）測定蛋白樣品濃度。將等量蛋白煮沸變性，進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（Sodium Dodecyl Sulphate-Polyacrylamide Gelelectrophoresis，SDS-PAGE）。將蛋白電轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)膜后用5%脫脂奶粉溶液（美國BD 公司）37℃封閉1 h，然后用兔源SerpinB6b 一抗（1:400）和鼠源 GAPDH 一抗（1:3 000，Santa Cruz 公司）4℃孵育過夜。PBST 液洗3 次，每次5 min，二抗37℃孵育1 h，再PBST 液洗3 次，每次5 min，用ECL 超敏發(fā)光液（南京諾唯贊公司）顯影。

1.7 原代大鼠子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)和誘導(dǎo)蛻膜化處理 將假孕第5 天的雌性大鼠頸椎脫臼處死，取子宮，然后用HBSS洗3遍，去除雜質(zhì)和血細(xì)胞；胰酶（2%）消化，4℃40 min，每10 min 間隔搖晃；37℃水浴15 min；用10%活性碳吸附的胎牛血清以1:10 的比例終止胰酶消化；膠原酶（0.5%）消化基質(zhì)細(xì)胞，37℃水浴15 min，然后用HBSS 終止消化反應(yīng)，1 000 ×g 離心7 min（4℃），離心棄上清，重復(fù)3 次；加入新鮮含10% 活性碳吸附的胎牛血清的DMEM/F12 培養(yǎng)液混勻，按1×106個細(xì)胞/皿的量接種于35mm 培養(yǎng)皿，37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)；當(dāng)細(xì)胞貼壁生長密度達(dá)到80%，更換為含2%活性炭處理血清的DMEM/F12 培養(yǎng)液，并在培養(yǎng)液中添加36 nmol/L 的雌二醇、1 μmol/L 的醋酸甲氫孕酮和0.1 mmol/L 的二丁酰環(huán)腺苷酸，對大鼠子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)；除實(shí)驗(yàn)組外，對照組為以僅含胎牛血清的正常培養(yǎng)液培養(yǎng)的細(xì)胞；每天進(jìn)行相同的上述激素處理，分別收集第1、3、6、9 天的細(xì)胞。用小量總RNA 提取試劑盒（Magen 公司）提取細(xì)胞RNA。熒光定量PCR 檢測PRL和SerpinB6bmRNA 的表達(dá)。以PRL表達(dá)量的變化值作為檢驗(yàn)?zāi)Ｐ褪欠窠⒊晒Φ臉?biāo)準(zhǔn)。

1.8 統(tǒng)計分析 采用GraphPad Prism 5.0 軟件繪圖并分析數(shù)據(jù)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用單因素方差分析或 Student′s t 檢驗(yàn)。用ImageJ 軟件對灰度進(jìn)行相對定量分析，以GAPDH作為內(nèi)參。

2 結(jié)果

2.1SerpinB6b在大鼠早期妊娠子宮中的表達(dá)情況 熒光定量PCR、原位雜交、免疫組化和蛋白質(zhì)免疫印記結(jié)果顯示，SerpinB6bmRNA 和蛋白在大鼠早期妊娠1～5 d子宮腔上皮、腺上皮有微弱表達(dá)；在第6 天的胚胎和蛻膜細(xì)胞表達(dá)；在7～9 d，表達(dá)主要集中在胚胎和蛻膜區(qū)，且隨蛻膜程度增加，表達(dá)量也逐漸增強(qiáng)，且在第8 天達(dá)到最高（圖 1）。

2.2SerpinB6b在大鼠人工誘導(dǎo)蛻膜化模型子宮中的表達(dá)情況SerpinB6b在人工蛻膜區(qū)的mRNA 和蛋白表達(dá)均顯著高于非蛻膜區(qū)。以PRL表達(dá)量的變化值作為檢驗(yàn)?zāi)Ｐ褪欠窠⒊晒Φ臉?biāo)準(zhǔn)（圖2）。

2.3SerpinB6bmRNA 在體外誘導(dǎo)蛻膜化大鼠子宮基質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá) 如圖3 所示，隨著誘導(dǎo)時間的增加，蛻膜化標(biāo)志分子PRL 的表達(dá)逐漸升高，并顯著高于對照組，表明誘導(dǎo)蛻膜化成功（圖3-A）；隨著誘導(dǎo)時間的增加，SerpinB6b的表達(dá)逐漸升高，并顯著高于對照組（圖3-B）。

3 討 論

細(xì)胞凋亡參與早期妊娠的胚胎著床和蛻膜化過程。子宮對植入的囊胚作出反應(yīng)，經(jīng)過廣泛的組織修飾形成蛻膜化，這種修飾包括上皮細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞的分化和凋亡[7]。胚胎著床時其周圍的基質(zhì)細(xì)胞停止增殖并經(jīng)歷分化，形成初級蛻膜區(qū)和次級蛻膜區(qū)，最終初級蛻膜區(qū)和次級蛻膜區(qū)經(jīng)歷細(xì)胞凋亡，擴(kuò)大了植入室以適應(yīng)生長中的胚胎[8]。Kokawa 等[9]報道，細(xì)胞凋亡的變化及異常表達(dá)與妊娠的發(fā)生、發(fā)展有著密切的關(guān)系。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SerpinB6b主要定位于胚胎和蛻膜組織，而且SerpinB6b的表達(dá)隨蛻膜化的進(jìn)行而增強(qiáng)，這提示SerpinB6b參與子宮基質(zhì)細(xì)胞的蛻膜化過程。鑒于大鼠子宮蛻膜中含蛻膜細(xì)胞、免疫細(xì)胞等多種細(xì)胞，為了明確SerpinB6b是否參與子宮基質(zhì)細(xì)胞的蛻膜化過程，本研究體外培養(yǎng)大鼠子宮基質(zhì)細(xì)胞并誘導(dǎo)蛻膜化，對其連續(xù)誘導(dǎo)9 d，蛻膜化標(biāo)志分子PRL顯著上升，表明細(xì)胞的確向蛻膜細(xì)胞分化。在這個過程中，SerpinB6b的表達(dá)明顯升高，但SerpinB6b在大鼠早期妊娠過程如何發(fā)揮作用未知。近年來研究發(fā)現(xiàn)SerpinB 家族成員的功能與細(xì)胞凋亡相關(guān)。Cohen 綜合征是一種由于中性粒細(xì)胞大量凋亡導(dǎo)致中性粒細(xì)胞減少所引起的罕見疾病。Duplomb 等[10]研究發(fā)現(xiàn)，SerpinB1在Cohen 綜合征患者的中性粒細(xì)胞中表達(dá)顯著降低，推測SerpinB1可能參與細(xì)胞凋亡過程。SerpinB2 能與成視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白（Retinoblastoma Protein，Rb）結(jié)合，保護(hù)其免受鈣蛋白酶的裂解，并提高Rb 蛋白水平、增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞存活。Rb 在細(xì)胞增殖與凋亡方面扮演重要角色，猜想SerpinB2可能參與細(xì)胞凋亡發(fā)生[11]。同樣，SerpinB3也被認(rèn)為是參與細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)的多種細(xì)胞因子之一[12]。SerpinB6b是否參與細(xì)胞凋亡調(diào)控進(jìn)而在早期妊娠發(fā)揮作用值得進(jìn)一步研究。

胚胎滋養(yǎng)層侵入蛻膜時，細(xì)胞外基質(zhì)同時進(jìn)行降解反應(yīng)，具有溶解作用的蛋白酶在胚胎著床過程中發(fā)揮重要作用[13-14]。蛻膜化啟動的過程中，一些蛋白酶或被激活或被抑制，蛋白酶抑制劑與蛋白之間會達(dá)成一種平衡，來維持妊娠進(jìn)行。絲氨酸、半胱氨酸和基質(zhì)金屬蛋白酶3 個蛋白酶家族參與胚胎著床中的基質(zhì)細(xì)胞降解[15]。子宮內(nèi)膜衍生的外泌體的金屬蛋白酶在促進(jìn)胚胎著床過程中也發(fā)揮重要作用[16]。有研究發(fā)現(xiàn)，SerpinB3b能抑制胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶的活性[17]，在小鼠胚胎發(fā)育進(jìn)程中，胚胎胞質(zhì)內(nèi)胰蛋白酶樣的活性增強(qiáng)[18]，推測SerpinB3b在胚胎發(fā)育過程發(fā)揮作用。本研究中SerpinB6b在蛻膜中高表達(dá)，可能與絲氨酸蛋白酶抑制劑參與子宮基質(zhì)細(xì)胞的降解、形成蛻膜細(xì)胞的過程有關(guān)，其機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)中，SerpinB6bmRNA 在大鼠早期妊娠1～5 d在腔上皮與腺上皮表達(dá)微弱，在6～9 d 蛻膜區(qū)強(qiáng)表達(dá)；在人工蛻膜化模型中人工蛻膜側(cè)的表達(dá)高于對照側(cè)；SerpinB6b 蛋白的表達(dá)與SerpinB6bmRNA 的表達(dá)類似；并且在體外培養(yǎng)的大鼠子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞中，隨著誘導(dǎo)蛻膜化天數(shù)的增加SerpinB6b也呈上升趨勢，證明SerpinB6b在大鼠胚胎著床和蛻膜化過程發(fā)揮重要作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，SerpinB6b很可能參與胚胎著床與蛻膜化過程的發(fā)生，進(jìn)而在大鼠早期妊娠過程中發(fā)揮作用。