lncRNA-47491、lncRNA-49770 和lncRNA-51636在發(fā)生炎癥反應(yīng)仔豬肝臟和脾臟中的表達(dá)分析

徐 鑫，黃興法，王秀英，汪文俊，朱惠玲，劉玉蘭，張 晶*

（1.武漢輕工大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料科學(xué)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北武漢 430023；2.中南民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，武陵山區(qū)特色資源植物種質(zhì)保護(hù)與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北武漢 430074）

內(nèi)毒素是革蘭陰性菌外膜上的脂多糖（LPS）成分，是危害畜禽健康的主要致病因子之一。LPS 可通過(guò)激活TLR4 和NOD 信號(hào)通路引起大量的炎性細(xì)胞因子的釋放，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）[1]。這些因子的過(guò)量釋放可引起動(dòng)物機(jī)體的炎癥反應(yīng)，造成組織損傷和功能紊亂，影響動(dòng)物健康。

長(zhǎng)鏈非編碼RNA（lncRNA）是一類(lèi)自身不編碼蛋白的轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度大于200 個(gè)核苷酸的RNA 分子，其主要參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控及轉(zhuǎn)錄后調(diào)控、蛋白質(zhì)運(yùn)輸和mRNA 降解3 類(lèi)生物學(xué)功能[2]。越來(lái)越多的研究表明，lncRNA可能是炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，在許多炎癥性疾病的發(fā)病機(jī)制中起著至關(guān)重要的作用[3]。lncRNA Mirt2 可抑制NF-κB 和MAPK 途徑的活化并抑制促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生[4]。lncRNA HOTAIR 在LPS 誘導(dǎo)的膿毒癥小鼠的心肌細(xì)胞中顯著上調(diào)，對(duì)p65 磷酸化和NF-κB 活化具有正調(diào)節(jié)作用[5]。lncRNA MALAT1 敲除可通過(guò)上調(diào)miR-146a 的表達(dá)來(lái)抑制LPS 誘導(dǎo)的小鼠肺泡巨噬細(xì)胞系MH-S 和鼠肺泡上皮細(xì)胞系MLE-12 中的炎癥反應(yīng)[3]。

前期通過(guò)LPS 刺激仔豬外周血單核細(xì)胞（PBMCs）建立細(xì)胞炎癥模型，經(jīng)高通量測(cè)序及生物信息學(xué)分析后，獲得了一系列炎癥相關(guān)候選lncRNA，其中包括表達(dá)變化較顯著的lncRNA-49471、lncRNA-49770、lncRNA-51636（未發(fā)表）。本研究通過(guò)給仔豬注射LPS 建立動(dòng)物炎癥模型，旨在研究肝臟和脾臟中炎性細(xì)胞因子及3 個(gè)lncRNA（lncRNA-49471、lncRNA-49770、lncRNA-51636）表達(dá)的變化。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)試劑 LPS（大腸桿菌血清型O55：B5）購(gòu)于Sigma 公司；RNAiso Plus（Total RNA 提取試劑）、Primescript?RT Reagent Kit with gDNA Eraser 反轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR?Premix Ex TaqTMRT-PCR 試劑盒均購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司。

1.2 試驗(yàn)儀器 RT-PCR 儀（7500 Real-time PCR system，ABI 公司）；梯度升降溫功能PCR 儀（TaKaRa）；Nanodrop2000 超微量分光光度計(jì)（Thermo）；電泳儀、電泳槽（Bio-Rad）；Tanon-4100 凝膠成像系統(tǒng)（上海天能）。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 試驗(yàn)選取8 頭21 日齡、體重（7.15±0.42）kg的杜×長(zhǎng)×大三元雜交斷奶仔豬，隨機(jī)分為對(duì)照組、LPS 組，每個(gè)處理4 個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)1 頭豬。預(yù)試14 d 后，LPS 組腹腔注射100 μg/kg 體重的LPS，對(duì)照組注射等量生理鹽水。4 h 后仔豬屠宰并取肝臟及脾臟樣品置于液氮中備用。

1.4 基因表達(dá)測(cè)定 組織樣品總RNA 提取、cDNA 合成、Real-time PCR 參照Liu 等[6]的方法。測(cè)定基因包括TNF-α、IL-1β、IL-6、lncRNA-47491、lncRNA-49770、lncRNA-51636。以GAPDH為內(nèi)參基因，Real-time PCR所有數(shù)據(jù)均采用Livak 等[7]的2-△△Ct法進(jìn)行分析。引物由武漢擎科生物有限公司合成，引物序列見(jiàn)表1。

表1 基因的引物序列

1.5 靶基因預(yù)測(cè) 從生物信息學(xué)的角度對(duì)lncRNA-47491、lncRNA-49770 及l(fā)ncRNA-51636 調(diào)控的順式靶標(biāo)基因進(jìn)行預(yù)測(cè)。lncRNA 與已知編碼蛋白質(zhì)基因的距離域值設(shè)定為lncRNA 的上下游100 kb 內(nèi)。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析 數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行獨(dú)立樣本T 檢驗(yàn)，以P＜0.05 表示差異顯著，P＜0.01 表示差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 LPS 刺激對(duì)仔豬炎性細(xì)胞因子mRNA 表達(dá)量的影響由表2 可知，與對(duì)照組相比，LPS 刺激提高了肝臟和脾臟中TNF-α、IL-1β、IL-6的mRNA 表達(dá)量（P＜0.05），表明炎癥模型建立成功。

2.2 LPS 刺激對(duì)仔豬肝臟、脾臟組織中l(wèi)ncRNA 表達(dá)量的影響 由表3 可知，與對(duì)照組相比，LPS 刺激可上調(diào)仔豬肝臟、脾臟中l(wèi)ncRNA-47491、lncRNA-49770 的表達(dá)量（P＜0.01）及l(fā)ncRNA-51636 的表達(dá)量（P＜0.05）。

2.3 lncRNA 靶基因的預(yù)測(cè) 如表4 所示，預(yù)測(cè)得到lncRNA-47491、lncRNA-49770 及l(fā)ncRNA-51636 均 存在多個(gè)潛在靶基因。

表2 LPS 對(duì)仔豬肝臟及脾臟TNF-α、IL-6 和IL-1β mRNA 表達(dá)量的影響

表3 LPS 對(duì)仔豬肝臟及脾臟lncRNA 表達(dá)量的影響

3 討 論

LPS 是革蘭氏陰性菌外膜的主要成分，其誘導(dǎo)的炎癥損傷模型非常經(jīng)典。有研究顯示，LPS 刺激4 h 肝臟炎癥相關(guān)基因顯著上升[8]；LPS 刺激脾臟3 h 時(shí)促炎因子表達(dá)量達(dá)到最大[9]。本試驗(yàn)選擇用LPS 刺激仔豬4 h后取樣測(cè)定，結(jié)果顯示肝臟和脾臟中LPS 刺激均使炎性細(xì)胞因子mRNA 表達(dá)量顯著上調(diào)，表明LPS 誘導(dǎo)了炎性細(xì)胞因子的大量釋放，炎癥模型建立成功。

目前研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA 在不同組織中的生物學(xué)功能不同，具有組織和細(xì)胞特異性[10]。前期研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA-47491、lncRNA-49770、lncRNA-51636 在 肝臟和脾臟中均表達(dá)豐富，因此對(duì)肝臟和脾臟中這3 個(gè)lncRNA 進(jìn)行炎癥反應(yīng)差異表達(dá)分析（未發(fā)表）。本試驗(yàn)中，在肝臟、脾臟中，LPS 誘導(dǎo)的lncRNA-47491、lncRNA-49770、lncRNA-51636 表達(dá)量均顯著上調(diào)。由此可見(jiàn)，在肝臟和脾臟中，lncRNA-47491、lncRNA-49770、lncRNA-51636 均參與了炎癥反應(yīng)。

表4 lncRNA 靶基因的預(yù)測(cè)

此外，靶基因預(yù)測(cè)結(jié)果顯示TMEM235、AFMID、PGS1、TK1、BIRC5和SYNGR2為lncRNA-47491 和lncRNA-51636 的靶基因；THOC6、SRRM2、PRSS21、PRSS33、PRSS41、FLYWCH1、FLYWCH2、KREMEN2、CLDN6、CLDN9、PKMYT1和TNFRSF12A為lncRNA-51636的靶基因。其中與炎癥密切相關(guān)的基因有TMEM235、PGS1、TK1、BIRC5、SRRM2、TNFRSF12A、CLDN6和CLDN9。TMEM235在過(guò)敏性氣道炎癥表型（中性粒細(xì)胞性哮喘小鼠模型）中上調(diào)[11]。PGS1可以編碼磷脂酰甘油磷酸合成酶。研究表明，LPS 刺激軟骨細(xì)胞8 h 使其蛋白表達(dá)量顯著下調(diào)[12]。TK1即胸苷激酶1，是脫氧核糖核苷酸代謝的補(bǔ)救途徑中的關(guān)鍵酶。有研究發(fā)現(xiàn)，呼吸系統(tǒng)急性炎癥病人血清細(xì)胞質(zhì)TK1水平顯著高于健康組及呼吸系統(tǒng)腫瘤病人，表明TK1參與炎癥反應(yīng)[13]。BIRC5（存活蛋白）是凋亡蛋白家族抑制劑的重要成員，涉及多種癌癥類(lèi)型，且在控制炎癥性疾病中發(fā)揮著作用。研究表明，BIRC5為miR-203 靶標(biāo)，且miR-203 和BIRC5 siRNA 均顯著抑制TNBC 細(xì)胞中的細(xì)胞增殖[14]；在支氣管炎性細(xì)胞存活和凋亡的不平衡調(diào)節(jié)誘導(dǎo)的哮喘疾病中，BIRC5mRNA 水平有較高表達(dá)[15]。SRRM2參與前mRNA 剪接，其在博來(lái)霉素誘導(dǎo)的肺損傷炎癥反應(yīng)模型中差異表達(dá)（較對(duì)照組顯著下調(diào)）[16]。CLDN6和CLDN9是緊密連接蛋白家族成員。研究顯示過(guò)表達(dá)CLDN6可改善呼吸屏障炎癥[17]；CLDN9在瘤樣細(xì)胞瘤中表達(dá)明顯高于正常垂體組織[18]，且有藥物可通過(guò)上調(diào)CLDN9表達(dá)來(lái)緩解缺氧誘導(dǎo)的人心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷[19]。TNFRSF12A即腫瘤壞死因子受體亞家族成員12A，與Toll 樣受體信號(hào)通路相關(guān)，參與LPS 誘導(dǎo)的機(jī)體炎癥反應(yīng)[20-21]。因此本研究中的這3個(gè)lncRNA 可能通過(guò)調(diào)節(jié)這些基因的表達(dá)從而在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮作用。

通過(guò)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，仔豬肝臟和脾臟中的lncRNA-47491、lncRNA-49770、lncRNA-51636 均在LPS 誘導(dǎo)的 炎癥反應(yīng)中發(fā)生了表達(dá)變化，但具體的功能及調(diào)控機(jī)制仍不清楚，后續(xù)將通過(guò)預(yù)測(cè)的潛在靶基因進(jìn)行深入研究。

4 結(jié) 論

LPS 刺激可誘導(dǎo)肝臟和脾臟產(chǎn)生大量炎性細(xì)胞因子。通過(guò)對(duì)肝臟和脾臟中l(wèi)ncRNA-47491、lncRNA-49770、lncRNA-51636 的差異表達(dá)分析可以看出其可能參與了機(jī)體的炎癥反應(yīng)，且通過(guò)靶標(biāo)基因的預(yù)測(cè)提示3 個(gè)lncRNA 可能發(fā)揮不同的調(diào)控作用。