畜禽糞便揮發(fā)性有機物的研究進展及其在動物健康診斷應用中的潛力

石海春，劉建新，王迪銘

（浙江大學動物科學學院，浙江杭州 310029）

隨著《國務院辦公廳關于加快推進畜禽養(yǎng)殖廢棄物資源化利用的意見》等新文件不斷實施，我國各地對環(huán)境污染的治理加強，更加重視污染源處理，對不合規(guī)范的工廠、養(yǎng)殖場等實行強制關閉或整改。畜牧業(yè)糞污中產(chǎn)生的揮發(fā)性有機物（Volatile Organic Compounds，VOCs）是周圍環(huán)境空氣中的主要污染成分之一，也是PM2.5 的重要前體物。隨著養(yǎng)殖業(yè)的規(guī)?；图s化發(fā)展，糞污堆積造成了養(yǎng)殖場中VOCs 大量揮發(fā)，從而造成嚴重的空氣污染（表1）。以牛為例，1 頭體重在550 kg左右的成年奶牛每天排糞30～50 kg，排尿15～25 kg[1]。假設每年成年奶牛占50%，一年奶牛排糞量總計約6 億t，從而產(chǎn)生大量的VOCs。研究顯示，干奶期與泌乳期奶牛糞便每頭每秒產(chǎn)生總有機氣體（Total Organic Gases，TOGs）分別為12 μg 和18 μg，其中反應有機氣體（Reactive Organic Gases，ROGs）占74%～77%，TOGs 包含甲烷、ROGs 以及丙酮和丙醛，除甲烷外，另外幾種氣體都屬于VOCs[2]。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，通過精確檢測VOCs，并與動物機體健康信息進行關聯(lián)可為動物健康的無損檢測提供重要理論支撐。

表1 2013—2018 年度家畜存欄量[3] 萬頭

1 VOCs 的定義與來源

根據(jù)我國生態(tài)環(huán)境部定義，VOCs 是指在標準狀態(tài)下，飽和蒸氣壓高于13.33 Pa，而沸點低、分子量小、常溫易揮發(fā)的一系列有機物（不含甲烷）[4]。美國環(huán)境保護局（EPA）認為VOCs 是一種有機化合物，其組成物能夠在常溫常壓的室內(nèi)大氣條件下蒸發(fā)[5]。美國國家研究委員會將VOCs 描述為一種在室溫下容易汽化，且具有強烈的刺激性氣味、毒性和致癌性的有機化合物[6]。動物糞便堆積是畜牧業(yè)生產(chǎn)中VOCs 生成的主要來源，因此對于以集約化為主要特點的畜牧業(yè)來說，畜禽糞便大量堆積，微生物活動會不斷累積VOCs，從而使整個養(yǎng)殖場以及周圍的環(huán)境不斷惡化。

2 畜禽糞便VOCs 的危害和檢測方法

目前，有關化工行業(yè)VOCs 排放造成的環(huán)境問題已經(jīng)被廣泛認識和報道，但有關畜禽糞便VOCs 的產(chǎn)生和排放對畜禽本身和長期工作在畜牧業(yè)一線的從業(yè)者的影響研究較少。同時，家畜糞便存在著極其復雜且具有極強揮發(fā)性的VOCs 混合物（表2），其主要成分為醇、醛、芳香族化合物烷烴等，提示畜禽糞便中VOCs 的研究具有潛在價值。

表2 泌乳中期奶牛ROGs 的釋放[2]

2.1 VOCs 的危害特征 VOCs 是城市霧霾和光化學污染的重要來源。在對流層中，VOCs 可通過物理過程的濕沉降和干沉降去除，通過光解、與羥基（OH）自由基反應、與硝酸鹽（NO3）自由基反應和與O3反應的化學過程轉(zhuǎn)化[7]。在氮氧化物（NOx）和陽光的照射下，VOCs 的降解反應導致NO 轉(zhuǎn)化為NO2，形成O3。在VOC/NOx比值大時，也就是受到NOx的限制時，會影響能夠形成的臭氧濃度最大值；在VOC/NOx比值小時，自由基變化會影響臭氧形成的初始速率[8]。二次有機氣溶膠（SOA）的生成也與VOCs 密切相關，SOA 是由VOCs 氧化后形成的氣體顆粒平衡狀態(tài)物質(zhì)[9]。Rule 等[10]研究發(fā)現(xiàn)，豬糞在發(fā)酵過程中產(chǎn)生大量VOCs，進而形成由顆粒物質(zhì)、活細菌和VOCs 組成的氣溶膠，從而對工人健康狀況形成威脅。

畜禽糞便儲存過程中，有機質(zhì)的降解可產(chǎn)生VOCs。例如，甲苯是一種廣泛存在于家畜糞便中的VOCs[11-12]。甲苯是由苯環(huán)的一個氫原子被甲基替代后得到的一種VOCs，屬于芳香族化合物。長期接觸甲苯可導致神經(jīng)行為受損，表現(xiàn)為頭痛、嗜睡、記憶力下降和聽力受損[13]。甲苯的神經(jīng)毒性主要體現(xiàn)在2 個方面：①甲苯暴露可導致谷氨酸轉(zhuǎn)運體功能受損，導致谷氨酸升高，從而引起一氧化氮合酶活性和一氧化氮濃度增高，最終引起海馬損傷。②甲苯暴露可提高細胞內(nèi)鈣濃度和細胞凋亡，從而使海馬受損（圖1）[14]。另外，甲苯對腦、心臟、肺、肝臟、腎都有不同程度的損害。甲苯具有親脂性，能夠通過血腦屏障進入腦，故其能在肝臟、腎等脂肪較多的部位富集。當動物體發(fā)生甲苯急性中毒時，易表現(xiàn)為頭暈、惡心并伴隨體溫升高和昏睡，進而轉(zhuǎn)為呼吸困難、血壓下降、抽搐直至死亡[15]。有研究表明，急性中毒可引起中毒性腦病，出現(xiàn)意識不清及精神障礙[16]。畜禽糞便中存在一定濃度的甲苯，例如，泌乳中期奶牛每頭每天可產(chǎn)生約700 mg 甲苯（表2），當人類接觸50 mg/L 甲苯就會產(chǎn)生輕微嗜睡和頭痛現(xiàn)象，造成心肌受損[17]和機體氧化應激[18]。這些結(jié)果提示，畜牧一線工作者需要對畜禽糞便中的甲苯做好防護。然而，畜禽糞便產(chǎn)生的甲苯暴露對畜禽生理代謝和生產(chǎn)性能的影響仍然有待進一步探究。

糞臭素又名3-甲基吲哚，是L-色氨酸的代謝產(chǎn)物，具有糞臭味。在動物體內(nèi)，L-色氨酸脫氨生成吲哚丙酮酸，進一步轉(zhuǎn)化為吲哚，在脫羧酶作用下生成吲哚-3-乙酸后，最終轉(zhuǎn)化成3-甲基吲哚。糞臭素主要在反芻動物瘤胃、單胃動物大腸等厭氧條件下由消化道微生物產(chǎn)生，一部分被機體吸收進入肝臟，其代謝產(chǎn)物由糞和尿排出，未排除的糞臭素存儲于脂肪、肝臟等組織中[19]。李彩燕等[20]采用高效液相色譜法測定豬糞便細菌群作用下L-色氨酸體外代謝的發(fā)酵初始樣品中，測得糞臭素含量為11.05 μmol/L。進一步研究發(fā)現(xiàn)，當畜禽進行糞臭素暴露時，在細胞色素P450 的作用下，產(chǎn)生大分子鏈中間體以及羥基、氨基或巰基等，使細胞膜發(fā)生脂質(zhì)過氧化，進而造成細胞壞死，并造成動物的肺水腫[19]。同時，糞臭素具有可選擇性肺炎球菌毒性，可造成Ⅰ-型肺細胞和細支氣管上皮細胞損傷，最終導致肺氣腫[19,21]。另一些研究發(fā)現(xiàn)，糞臭素對某些微生物（如嗜酸乳桿菌、帶纖毛的原生菌等）存在抑制作用[22]，從而影響動物對營養(yǎng)物質(zhì)的消化，提示糞臭素對消化道微生物菌群和功能具有重要調(diào)控作用。上述結(jié)果表明，當畜牧業(yè)從業(yè)者和畜禽暴露于甲苯、糞臭素等糞便VOCs 時，機體代謝和健康狀況存在潛在風險。

2.2 VOCs 的主要檢測方法 VOCs 對環(huán)境以及人類健康等的影響越來越受到人們的重視，所以對VOCs 的研究也越來越多。同時，隨著科技發(fā)展，檢測VOCs 的方法也越來越精細，VOCs 研究要點在于樣品前處理和VOCs 檢測。樣品前處理主要有溶劑萃取法、吹掃捕集法、靜態(tài)頂空法和固相微萃取法。

溶劑萃取法是傳統(tǒng)的提取工藝，主要利用樣品中不同組分在不同溶劑中溶解度的差異對樣品進行富集，從而實現(xiàn)分離、純化?；ㄇ嗨?、茶多酚等中藥成分、大多數(shù)精油的提取等均用溶劑萃取法[23-24]，VOCs 測定使用較少。吹掃捕集法主要利用惰性氣體將VOCs 連續(xù)吹出，然后通過吸附劑將其捕集，最后解析予以釋放。吹掃捕集法適用于萃取沸點低于200℃，溶解度小于2%的VOCs，在水環(huán)境VOCs 的監(jiān)測中廣泛應用。靜態(tài)頂空法主要將樣品封閉于容器內(nèi)，通過升高溫度使VOCs逸出，并取得樣品用于氣相分析。靜態(tài)頂空法適用于疏水性、沸點低的化合物。固相微萃取主要是利用涂有吸附劑的石英纖維萃取頭吸附待測物利用樣品與萃取相的飽和來實現(xiàn)微萃取。目前測定VOCs 使用較多的是吹掃捕集法和靜態(tài)頂空法。另外，通過多種技術(shù)相結(jié)合可以提高VOCs 的回收率，如頂空固相微萃取。Lo 等[25]采用頂空固相微萃取和新型多維氣相色譜-質(zhì)譜-嗅覺測定法（MDGC-MS-O）系統(tǒng)同時識別從豬糞中排放的VOCs 和相關氣味，共鑒定出295 種分子量為34～260的化合物，其中71 種化合物是具有臭味的化合物，提示頂空固相微萃取等VOCs 提取方法與現(xiàn)代高通量檢測技術(shù)的聯(lián)合應用，將成為深入研究糞污中VOCs 組成和功能的重要方法。

VOCs 的測定方法主要有氣相色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用、高效液相色譜法、膜導入色譜法、光聲光譜法等，較為常用的是氣相色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用。

氣相色譜法適用于分離易揮發(fā)而不易分解的物質(zhì)。流動相是載氣，通常用惰性氣體氦氣或者用氮氣代替。固定相則有一薄層液體或者聚合物附著在一層惰性的固體表面構(gòu)成。固定相裝在由玻璃或金屬制成的一根空心柱子內(nèi)，稱為色譜柱。載氣帶著樣品通過色譜柱，樣品各個組分在流動相和固定相之間多次分配調(diào)平，由于各個組分的結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)不同，在色譜柱中流動的速度也不一樣，這樣各個組分就會按照不同時間順序從色譜柱中出來，然后先后進入檢測器而被檢測到。氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用集色譜高效分離與質(zhì)譜特異性鑒定于一身。氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用可用于分離復雜的混合體系，同時對各組分定量定性，也能檢測出尚未分離的色譜峰，靈敏度高。采用固相微萃取以及氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用測定畜禽糞便的VOCs，鑒定出了牛糞的44 種、豬糞的40 種、雞糞的41 種物質(zhì)[26]；采用吹掃捕集法以及氣相色譜法分析豬糞好氧發(fā)酵產(chǎn)生的VOCs，并確定了豬糞中主要的致臭因子[27]。還有研究通過豬場糞肥現(xiàn)場試驗，用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀分析糞肥發(fā)酵產(chǎn)生了81 種VOCs，并且主要在堆肥的前2 周逸出[28]。

3 畜禽糞便VOCs 在動物健康診斷中的應用價值

隨著代謝組學技術(shù)的快速發(fā)展，糞中VOCs 在疾病檢測方面的應用得到了長足發(fā)展。目前，大部分基于糞便VOCs 的健康診斷技術(shù)在人類醫(yī)學上開展。研究發(fā)現(xiàn)，利用患者糞便中的VOCs 來替代其腸道環(huán)境，可區(qū)分炎癥性腸?。↖BD）和腸易激綜合征（IBS）患者[29]；另外一些研究通過對比健康和腸道性疾病患者的糞便VOCs，發(fā)現(xiàn)80% 的受試者共同擁有44 種VOCs，而且與健康組相比，潰瘍性結(jié)腸炎患者糞便中的揮發(fā)性模式有顯著差異，提示從糞便中提取的揮發(fā)性有機化合物具有診斷胃腸道疾病的潛力[30]；同時，肥胖非酒精性脂肪肝患者與健康的人的糞便VOCs 存在顯著差異，其中肥胖非酒精性脂肪肝組患者的糞便中酯類VOCs 顯著高于健康人群[31]，提示糞便中酯類VOCs 含量可作為非酒精性脂肪肝的重要生物標記。黑色素瘤是一種最惡性的皮膚癌。有研究者鑒定并比較了皮下注射B16 黑色素瘤細胞前后小鼠尿液和糞便中VOCs 組成，發(fā)現(xiàn)注射B16 黑色素瘤細胞的小鼠尿液和糞便中分別有16 種和13 種VOCs 濃度顯著提高，提示這些VOCs 可作為黑色素瘤細胞的潛在生物標志物[32]。在最近的一項研究中，93 位IBS 患者被隨機分為低FODMAP（低果糖、半乳糖、低寡糖、乳糖、果糖和多元醇）飲食組和對照組，發(fā)現(xiàn)糞便VOCs 分析可以預測IBS 患者對低FODMAP飲食的反應[33]，提示糞便VOCs 是指征機體代謝的重要生物標志物。研究發(fā)現(xiàn)，機體糖代謝水平不僅與血液酮體、乙醇、甲醇有關，也與糞中VOCs 濃度有關，這也為基于糞便VOCs 水平評估人體糖原代謝狀況提供了依據(jù)[34]。為了解嬰兒胃腸道的發(fā)育和微生物定植，Costello 等[35]研究表明，與無癥狀成年人糞便中311 種VOCs 相比，早產(chǎn)兒糞中VOCs 僅檢測出136 種，其中含氮化合物和含硫化合物的種類和濃度顯著降低，提示早產(chǎn)兒發(fā)育與腸道菌群的功能單一性有關。另外，在壞死性小腸結(jié)腸炎（Necrotising Enterocolitis，NEC）的研究中，發(fā)現(xiàn)NEC 患兒體內(nèi)酯類VOCs（特別是2-乙基己基乙酸乙酯、癸酸乙酯、十二酸乙酯和十六酸乙酯這4 種特異性酯類）含量低于健康嬰兒，提示VOCs 可能在NEC 的早期識別中起作用[36]。這些研究提示，基于糞便VOCs 組成和濃度判斷哺乳動物機體的應激狀況和代謝特征，是一項極具潛力的無損檢測技術(shù)。

目前，在大型家畜（豬、牛等）的疾病診斷和營養(yǎng)代謝研究和實踐中，存在樣品采集不便和成本較高的問題，亟需發(fā)展家畜健康狀況和代謝特征的無損采樣和檢測技術(shù)。但作為一項重要的無損檢測技術(shù)，基于糞便VOCs 的健康-代謝診斷技術(shù)在畜牧業(yè)中研究較少。鳥分枝桿菌副結(jié)核亞種（Mycobacterium avium ssp.Paratuberculosis，MAP）是反芻動物慢性腸道疾病的病原體，通過對42 只山羊（對照組16 只，接種MAP菌 26 只）的呼吸和糞便中VOCs 進行分析，發(fā)現(xiàn)感染MAP 菌的山羊，糞中VOCs 濃度顯著上調(diào)，提示糞便中VOCs 可以對反芻動物的慢性腸道疾病作早期診斷[37]。牛結(jié)核病（Bovine Tuberculosis）是影響公共衛(wèi)生安全和畜牧業(yè)發(fā)展的人畜共患病，病原菌為牛型結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium Bovis），接種疫苗是限制牛結(jié)核病傳播的重要方式。研究發(fā)現(xiàn)，接種了牛結(jié)核病疫苗的犢牛和未接種疫苗的犢牛糞便中的VOCs 組成呈顯著差異，提示糞便中的VOCs 在畜禽疫苗接種檢測領域具有重要應用價值[38]。慢性消耗性疾?。–hronic Wasting Disease，CWD）是一種天然存在的具有感染性、致命性、傳染性的頸狀海綿狀腦病，該疾病確診需要用免疫組織化學（IHC）方法對內(nèi)側(cè)咽后淋巴結(jié)或腦中的感染性朊病毒進行檢測，但對生物流體或糞便中存在的低濃度朊病毒進行IHC 檢測，進而使CWD 獲得確診并不可靠。近期研究發(fā)現(xiàn)，感染CWD 的白尾鹿與未感染CWD 的白尾鹿的糞便中VOCs 存在顯著差異，提示糞便VOCs在鑒定活體動物CWD 感染狀況中具有重要應用價值[39]。這些研究結(jié)果提示，糞便VOCs 可作為動物健康狀況和疾病監(jiān)測的重要生物標志物。糞便VOCs 分析還被探索用于診斷牛呼吸道疾病[40]、布氏桿菌病[41]、酮癥酸中毒[42]等。這些研究提示，通過將畜禽糞便VOCs 和機體代謝和健康狀況進行關聯(lián)研究并開發(fā)基于糞便VOCs 的機體代謝和健康狀況評估體系，將為動物代謝-健康狀況無損檢測理論的建立和應用提供重要支撐。

4 小 結(jié)

隨著VOCs 檢測手段的精細化和系統(tǒng)化發(fā)展，基于哺乳動物VOCs 的分類檢測和精準測定得到了長足發(fā)展，并進一步結(jié)合糞便采集等無損樣品采集技術(shù)，使其在生物醫(yī)藥領域特別是健康診斷領域取得了較好的應用前景?；诩S便VOCs 檢測的畜禽健康診斷技術(shù)的開發(fā)和應用，并將其與現(xiàn)有的畜牧科學技術(shù)進行集成，勢必將進一步推動畜牧業(yè)的發(fā)展。