小分子活性多肽在骨組織工程中的研究進展

陳天洪 李景峰

武漢大學中南醫(yī)院脊柱與骨腫瘤科430071

0 引 言

骨組織具有一定的自愈能力，在遭受創(chuàng)傷后能自我修復。然而,這種自愈能力有一定限度，在面對較大或難治性骨缺損時修復效果差，因此需要尋找一些新的材料來修復這類骨缺損。目前，修復效果最好的方法是自體骨移植，因為自體骨供體不僅可以提供合適的骨基質(zhì)支持新骨生長，而且無免疫排斥反應。然而優(yōu)質(zhì)的自體骨供體來源有限、易感染等缺點使其應用具有很大的局限性[1]。同種異體骨移植也是骨缺損的修復方法之一。這種方法避免了供體部位的并發(fā)癥，同時來源豐富，易于獲取，但有免疫排斥、傳播疾病的風險，同時其成骨誘導活性較低且骨折風險較高[2]，也具有很大的局限性。與自體骨和同種異體骨相比，人工合成骨不僅具有良好的生物相容性和生物降解性，同時還彌補了自體骨來源有限，異體骨免疫排斥等缺點。因此，人工合成骨逐漸成為骨組織工程的研究熱點。

為了提高骨組織工程生物材料的骨誘導活性，常常復合骨誘導活性因子。在成骨誘導方面，最常用的生長因子是骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）。BMP 是轉(zhuǎn)化生長因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）超家族中的一員，能誘導骨祖細胞有絲分裂并分化為成骨細胞，其中BMP-2、BMP-7 等已經(jīng)被批準在臨床或商業(yè)中使用。然而，BMP 也具有一些缺點，包括成本較高以及長期使用可能導致骨腫瘤等[2-3]。為了克服這些缺點，在此基礎上進行改構的小分子活性肽的應用越來越廣泛。這些小分子活性肽一般是短肽序列，成本較低，也不易引起排異反應。相較于較長鏈的骨誘導活性因子，在相同面積的骨生物支架材料上能負載更多量和/或類型的小分子活性肽，使不同類型的小分子活性肽可以協(xié)同發(fā)揮效應，從而進一步提高骨生物材料的成骨誘導活性，同時還可實現(xiàn)小分子活性肽的可控釋放。

對幾種常見的用于骨組織工程的小分子活性肽的研究進展進行綜述。其中，除了能直接誘導成骨分化的小分子活性肽外，還包含了促種子細胞黏附以及血管生成的小分子活性肽。黏附及增殖是細胞成骨分化的必然途徑，而血管生成對新骨形成也至關重要，因為血管化為新骨生長提供了必須的成骨誘導因子等營養(yǎng)物質(zhì)。

1 用于骨組織工程的小分子活性多肽

1.1 促黏附肽

1.1.1 Arg-Gly-Asp（RGD）肽

RGD 肽是纖連蛋白中最短的促細胞黏附的氨基酸序列，廣泛存在于玻連蛋白、層黏蛋白、骨橋蛋白和骨涎蛋白等多種細胞外基質(zhì)蛋白中，可用于刺激細胞表面黏附[4]。RGD 肽已經(jīng)被證明能在多種生物活性材料上促進MC3T3-E1 細胞以及人間充質(zhì)干細胞（mesenchymal stem cells, MSCs）的黏附或成骨分化[5-9]，并能在兔體內(nèi)促進新骨形成[10]。但一項使用兩種物質(zhì)介導RGD 修飾磷脂雙分子層的研究取得了不同的結(jié)果，即使用1，2-二油?；字Ｄ憠A介導的RGD 能促進磷脂雙分子層上hMSCs 的成骨分化，而1，2-二棕櫚?；字Ｄ憠A介導的RGD 卻對磷脂雙分子層上的hMSCs 分化沒有影響[6]。還有研究結(jié)果表明，RGD 對液晶材料上的細胞沒有促黏附作用[7]。這些不同的結(jié)論目前并沒有被進一步研究。但研究者已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了一些能影響細胞黏附和分化的因素，如細胞的黏附水平與RGD 肽在材料表面的密度和遷移率呈正相關，而且肽的濃度還影響細胞的形狀，濃度越大，細胞越長、圓度越低[6]。

1.1.2 膠原模擬肽

膠原模擬肽能結(jié)合細胞膜整聯(lián)蛋白，介導細胞黏附。膠原模擬肽P-15 能促進MC3T3-E1 細胞在生物活性材料表面的黏附和增殖[11]。P-15 多肽能促進材料表面功能化從而增加犬下頜骨中的骨-種植體的接觸面積[12]。為了評估膠原模擬肽的促黏附效應，研究者使用RGD 肽與膠原蛋白I 衍生肽DGEA 進行比較[13]，結(jié)果顯示DGEA 肽促細胞黏附效應低于RGD 肽，但誘導成骨效應更強。另一項對膠原模擬肽AC-GCG（OPG）7（CMP）與RGD 肽的研究結(jié)果顯示，CMP 在體內(nèi)的促成骨效應明顯優(yōu)于RGD 肽[14]。

1.1.3 肝素結(jié)合肽

成骨細胞與細胞外基質(zhì)的黏附除了通過整合素與RGD 介導外，還能由基于跨膜蛋白多糖與肝素結(jié)合序列的相互作用介導[15]。肝素結(jié)合肽是第二種途徑中重要的小分子活性多肽。為了模擬細胞外基質(zhì)與整聯(lián)蛋白以及蛋白多糖受體之間的協(xié)同作用，研究者開發(fā)了同時復合RGD 肽和肝素結(jié)合肽的生物活性材料。這種材料可明顯促進成骨細胞的黏附、增殖和分化。但在細胞黏附與增殖方面，RGD和肝素結(jié)合肽并沒有顯示出明顯的協(xié)同效應。細胞培養(yǎng)結(jié)果顯示單獨的肝素結(jié)合肽和RGD 肽產(chǎn)生的促細胞黏附和增殖效應優(yōu)于這種新材料，在增殖和礦化方面，三者的促進效果相近。這可能是由于兩種肽實際暴露于細胞的量與比例無法準確調(diào)控造成，其具體機制仍需進一步研究[16-17]。

1.2 骨誘導肽

1.2.1 骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7 衍生肽

骨形成肽-1（bone forming peptide-1，BFP-1）是骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7（BMP-7）不成熟區(qū)域的衍生肽。Li等[18]和Yang 等[19]的研究結(jié)果均證明BFP-1 能增強成骨相關基因、蛋白、轉(zhuǎn)錄因子以及酶的表達和活性，從而促進脂肪來源間充質(zhì)干細胞（adiposederived MSCs，ADMSCs）和骨髓來源間充質(zhì)干細胞（bone MSCs,BMSCs）的成骨分化。Li 等[18]還證明了BFP-1 能促進裸鼠背部的血管及新骨形成，發(fā)現(xiàn)BFP-1 增強了生物活性材料的親水性、細胞黏附性以及生物相容性，在促進細胞成骨分化的同時還促進了細胞的黏附。但BFP-1 肽的促黏附效應并不強，Luo[20]等設計了一種RGD 與BFP-1 順序釋放的雙肽負載藻酸鹽雜交系統(tǒng)，這種系統(tǒng)在早期釋放RGD 肽能增強細胞黏附和增殖，晚期釋放BFP-1 則誘導成骨分化，實現(xiàn)了RGD 肽與BFP-1 的協(xié)同促成骨作用。值得一提的是，Wang[21]等發(fā)現(xiàn)BFP-1 能通過提高Smad 1/5 蛋白的磷酸化水平，增強兔內(nèi)皮祖細胞的遷移能力以及某些血管形成基因的表達，并在兔體內(nèi)誘導更多和更好的血管以及新骨形成。

1.2.2 骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2 衍生肽

多種BMP-2 的衍生肽，如OP 肽[22]、BMP-2 殘基73-92[23]和BMP-2 殘基32～48（p17-BMP-2）[24]已被證明能增強MSCs 的成骨分化標志物——堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、Runx2 基因以及相關蛋白的表達，并在兔或老鼠體內(nèi)促進新骨形成，同時能促進被修飾材料表面的鈣沉積，表明BMP-2 衍生肽對成骨分化具有促進作用。值得一提的是，有研究發(fā)現(xiàn)地塞米松可加強BMP-2 殘基73-92 的骨誘導活性，同時當BMP-2 殘基73-92 修飾介孔二氧化硅粒子時，還使這種粒子獲得了更好的細胞相容性及細胞攝取效率[23]。由于BMP 衍生肽僅僅是BMP完整序列的一部分，因此其骨誘導能力遠不如BMP強大。研究者發(fā)現(xiàn)，在一定的濃度范圍內(nèi)，即使BMP-2 殘基73～92 的濃度達到BMP-2 的12 000倍，其骨誘導能力仍然不及完整肽鏈的BMP-2[25]。Li等[26]利用BMP-2 功能結(jié)構域中的20 個氨基酸片段合成了一種新肽P24，與前面幾種衍生肽不同，當將P24 肽與重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2（recombinant human bone morphogenetic protein-2，rhBMP-2）進行比較時，發(fā)現(xiàn)P24 肽的骨誘導能力與rhBMP-2 相近，并且P24 與rhBMP-2 能一起使用并發(fā)揮協(xié)同效應。

1.2.3 胰高血糖素樣肽

糖尿病患者較常人有更高的骨質(zhì)疏松患病率[27-28]以及骨折風險，某些糖尿病藥物甚至對這種風險有促進作用[29]。胰高血糖素樣肽-1（glucagon-like peptide-1,GLP-1）是一種治療糖尿病的藥物，被證明具有促成骨作用。其在治療糖尿病的同時，能預防骨質(zhì)疏松等疾病，對于糖尿病患者，特別是老年糖尿病患者有巨大的臨床應用價值。使用GLP-1 受體激動劑exendin-4（Ex-4）治療骨質(zhì)疏松大鼠時，能發(fā)現(xiàn)其增強了大鼠的骨形成和骨強度；在體外細胞培養(yǎng)中，研究者發(fā)現(xiàn)Ex-4 能促進骨髓基質(zhì)細胞（bone marrow stromal cells，BMSCs）向成骨細胞分化，同時抑制其分化為脂肪細胞[30]。此外，Ex-4 還能改善衰老成骨細胞的增殖[31]并抑制骨吸收[32]。研究者發(fā)現(xiàn)，長期使用GLP-1 受體激動劑能防止人體質(zhì)量減輕后的骨質(zhì)流失[33]。但并不是所有GLP-1 受體激動劑都能降低治療對象的骨折風險，有分析認為這可能是由于它們分子結(jié)構的差異所導致[34]。但想要找到解釋這些差異的具體原因，就必須明確GLP-1 受體激動劑促進骨形成的機制，但這種機制目前并不完全明確。Meng 等[30]發(fā)現(xiàn)Ex-4 增加了β-連環(huán)蛋白在細胞質(zhì)中的積累和細胞核中的轉(zhuǎn)運，改善了成骨調(diào)節(jié)因子的表達，并通過經(jīng)典的Wnt/β-連環(huán)蛋白傳導途徑調(diào)節(jié)BMSCs 成骨分化。通過對Wnt/β-連環(huán)蛋白系統(tǒng)的下游效應子的進一步觀察發(fā)現(xiàn)，GLP-1 受體激動劑通過雙重途徑促進成骨，即由CAMP/PKA/β-連環(huán)蛋白/轉(zhuǎn)錄因子7 樣2 途徑啟動成骨分化，由PKA/P13K/AKT/GSK3β 途徑抑制β-連環(huán)蛋白降解并促進其在BMSCs 中的積累。也有研究者認為，二型糖尿病可能對Wnt/β-連環(huán)蛋白傳導途徑具有抑制作用，而GLP-1 受體激動劑能減輕這種抑制作用[35]。

1.2.4 成骨生長肽

成骨生長肽（osteogenic growth peptide, OGP）是一種天然存在的14 肽，其氨基酸序列與組蛋白H4 的C 末端89～102 片段相同，具有促成骨作用[36]。OGP（10～14）是OGP 序列中的第10～14 氨基酸片段，是OGP 最小的衍生片段及生理活性形式[37]。將OGP（10～14）復合到改性聚乳酸[38]和鈦（titanium，Ti）[39]等材料上時，能促進成骨細胞的黏附、增殖、分化、ALP活性、鈣沉積及基因表達，從而發(fā)揮成骨誘導作用。在與Ti 復合時，OGP（10～14）還能抑制破骨細胞的表達，減少骨流失。Li 等[40]認為，OGP 可能通過增加AK141205 基因及CXCL13 mRNA 的表達介導促成骨作用，并可通過沉默成骨細胞中的AK141205 基因，減弱OGP 的促成骨作用。

1.2.5 甲狀旁腺激素相關肽

甲狀旁腺激素（parathyroid hormone，PTH）是一種含有84 個氨基酸的多肽，在機體鈣調(diào)節(jié)和骨重塑中發(fā)揮重要的生理作用。研究結(jié)果表明，PTH 序列N 端的前34 個氨基酸片段PTH（1～34）保留了其大部分功能[41]。PTH（1～34）對機體具有雙重作用，持續(xù)高劑量不利于骨形成，而間歇高劑量或持續(xù)低劑量則能促進骨的形成與再生。PTH（1～34）促進骨形成的能力使其在骨組織工程中具有巨大的潛力。然而，給藥不便以及存在全身暴露的潛在風險等缺點限制了PTH（1～34）的應用[42]。為了克服PTH（1～34）的上述缺點，Yang 等[42]自主設計并合成了一種新肽PTHrP-1，其能被生物材料高效負載并持續(xù)地釋放，在促進兔橈骨缺損處新骨形成時，呈劑量依賴性；此外，其可在體外促進MC3T3-E1 細胞的ALP 活性、細胞增殖以及cAMP 和RUNX2 基因的表達。此外，Liang 等[43]還發(fā)現(xiàn)PTHrP-1 能促進血管生成標志物的表達，這說明PTHrP-1 還具有促血管生成能力。值得注意的是，PTH（1～34）的促成骨作用是在間歇性的高劑量暴露下實現(xiàn)的，然而在文獻[42]報道的研究中，PTHrP-1 為持續(xù)釋放，但仍然促進了骨形成。這可能是由于PTHrP-1 改構后，與PTH 受體結(jié)合位點改變有關，但需要進一步對PTHrP-1 的促成骨機制進行研究以解釋這種現(xiàn)象。此外，PTH 相關肽的促成骨機制可能與Smad 依賴的典型BMP 受體信號通路、Wnt 信號通路以及Smad 無關的非典型BMP 受體信號通路的激活有關[42]，但具體機制有待進一步研究。

1.3 促血管生成肽

1.3.1 QK 肽

血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）衍生的QK 肽已經(jīng)被證明具有與重組VEGF 相當?shù)拇傺苌蓾摿44]。研究者發(fā)現(xiàn)，QK肽可促進人臍靜脈內(nèi)皮細胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）的增殖[45]。為了更好地發(fā)揮QK 肽的促血管生成潛力，研究者研發(fā)了2 種能實現(xiàn)QK 肽可控釋放的方法。第一種方法是使用含不同數(shù)量谷氨酸的聚谷氨酸結(jié)構域合成QK 肽。研究結(jié)果表明，QK 肽的釋放順序與谷氨酸數(shù)量呈負相關[46]。同時也有研究結(jié)果表明，谷氨酸結(jié)構域合成的QK 肽促血管生成活性與單純QK 肽沒有差異，并且谷氨酸還增強了QK 肽與骨組織工程材料（無機牛骨和羥基磷灰石）的黏附力[47]。第二種方法是使用聚乙二醇水凝膠納米顆粒負載QK 肽，通過改變納米顆粒的交聯(lián)密度調(diào)節(jié)QK 肽的釋放速率，納米顆粒的交聯(lián)密度越低，QK 肽釋放越快[48]。

1.3.2 艾塞納肽

艾塞納肽（Ex-4）是一種GLP 受體激動劑，已經(jīng)被批準作為糖尿病治療藥物。Seo 等[49]使用Ex-4促進了糖尿病小鼠背部傷口的愈合，同時增強了HUVECs 的增殖、分化以及人角質(zhì)形成細胞中VEGF的表達。Kang 等[50]則發(fā)現(xiàn)Ex-4 改善了后肢缺血損傷小鼠的血流動力學，減少了肌肉的局部組織損傷，增加了腓腸肌中血小板-內(nèi)皮細胞黏附分子（CD31）的染色面積，并可促進血管生成因子表達。Roan等[51]還發(fā)現(xiàn)Ex-4 能抑制超氧陰離子產(chǎn)生及降低血清中白細胞介素6 的濃度，從而減輕糖尿病小鼠傷口的炎性反應。上述結(jié)果提示，Ex-4 對血管生成存在有益作用。Qi 等[52]發(fā)現(xiàn)Ex-4 的促血管生成效應可能通過P18K/AKT 通路介導，但相關機制有待進一步研究。

1.3.3 PR1P 肽

Prominin-1 衍生肽（prominin-1 derived peptide，PR1P）是最新被設計出來的含有12 氨基酸序列的多肽[53]，其能直接結(jié)合VEGF，促進VEGF 與血管內(nèi)皮細胞、VEGF 受體2 以及神經(jīng)菌毛蛋白-1 的結(jié)合。研究結(jié)果顯示，聯(lián)合使用PR1P 肽與VEGF 能促進小鼠左耳以及脈絡膜的傷口愈合和血管生成，同時還能增加小鼠右腿的血流灌注。但單獨使用PR1P肽并不具有促血管生成的能力，將PR1P 肽單獨注入角膜后并沒有增加新生血管的生成；而將PR1P肽與VEGF 一起注入角膜卻促進了角膜新血管的生成。因為角膜不含有內(nèi)源性VEGF，這說明PR1P肽只能通過與VEGF 結(jié)合并促進其活性來實現(xiàn)促血管生成作用。

2 結(jié) 語

目前，研究者已開發(fā)了多種可用于骨組織工程的成骨小分子活性多肽。盡管針對小分子活性多肽的研究依然有限，尤其在機制、用法、可控調(diào)節(jié)，雙肽甚至多肽協(xié)同效應等方面仍有待進一步研究，以揭示相關機制。例如，RGD 肽在促進細胞黏附上有相互矛盾的結(jié)果[11]，細胞外基質(zhì)與RGD 肽、肝素結(jié)合肽在細胞黏附上并未發(fā)揮出預計中的協(xié)同效應[16-18]，使用不同方法綴合到材料上的小分子活性多肽效用存在巨大差異[12]，等。但無法否認，小分子活性多肽在骨組織工程中的應用已經(jīng)取得了巨大的進展，有許多小分子活性多肽被用于修飾生物材料并且在體內(nèi)和體外實驗中取得了較好的促成骨效果，短鏈小分子多肽的促進能力絲毫不遜色于長鏈多肽[44]。這些小分子活性多肽相較于傳統(tǒng)的生長因子，具有成本低、易于調(diào)控，效用安全等優(yōu)點，在未來的骨組織工程研究與應用中具有無法估量的應用潛力。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突