藍(lán)莓果實(shí)常溫貯藏過程中表面病原真菌的分離與鑒定

周 倩 馮 肖 紀(jì)淑娟 魏寶東 周 鑫 王斯瑤 王亞娟 郝 佳

（沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院 沈陽(yáng)110866）

藍(lán)莓又稱越橘，俗稱都市果，屬杜鵑花科（Ericaceae）越橘屬（Vaccinium spp.），為多年生灌木小漿果果樹，耐寒性極強(qiáng)，可抵御-50℃的嚴(yán)寒，原產(chǎn)于北美、蘇格蘭和俄羅斯，是一種具有極高經(jīng)濟(jì)價(jià)值的新興世界性小漿果[1]。隨著藍(lán)莓種植面積的增加和種植年限的增長(zhǎng)，其病害的發(fā)生也比較普遍，由于藍(lán)莓果實(shí)柔軟、皮薄、多汁、營(yíng)養(yǎng)成分豐富，因此在采后極易受到微生物的侵染，導(dǎo)致果實(shí)表面凹陷、破裂，霉菌沿裂縫處開始繁殖蔓延，造成全果腐爛變質(zhì)[2]。藍(lán)莓果實(shí)病害具有發(fā)生普遍、侵染部位多樣、發(fā)病時(shí)期持久、影響產(chǎn)量和品質(zhì)等特點(diǎn)[3]。侵襲采后藍(lán)莓的病原真菌很多，還存在一定的地域差異性：西班牙、美國(guó)、智利、阿根廷等地的病原菌主要是灰霉菌（Botrytis cinerea）、炭疽菌（Colletotrichum spp．）、鏈格孢菌（Alternaria spp．）、枝孢菌（Cladosporium spp．）、青霉菌（Penicillium spp．）、鐮刀菌（Fusarium spp．）和根霉菌（R hizopus spp．）[4-7]。國(guó)內(nèi)一些地區(qū)的藍(lán)莓貯藏病害致病病原真菌已被分離鑒定出幾種常見的病原真菌，包括灰葡萄孢、青霉、鏈格孢霉、褐孢霉[8]。其中，灰霉病是藍(lán)莓的主要病害之一[9-10]。

本試驗(yàn)中針對(duì)遼寧地區(qū)的“藍(lán)豐”藍(lán)莓果實(shí)為試材，通過對(duì)藍(lán)莓采后常溫貯藏過程中自然發(fā)病果實(shí)表面病原菌的分離與篩選，明確采后藍(lán)莓腐爛的主要病原菌的種類。采用傳統(tǒng)混菌法對(duì)表面病原真菌進(jìn)行培養(yǎng)和純化，經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察分析，初步確定藍(lán)莓表面病原真菌種類，并進(jìn)行返接試驗(yàn)。對(duì)真菌核糖體基因ITS區(qū)進(jìn)行特異性PCR擴(kuò)增，對(duì)病原真菌分類鑒定。采用該技術(shù)對(duì)植物病原真菌的分子檢測(cè)已在國(guó)際上廣泛應(yīng)用[11]。通過生理生化實(shí)驗(yàn)確定所鑒定菌種的最適生長(zhǎng)溫度，為藍(lán)莓果實(shí)貯藏保鮮過程中病害的預(yù)防和控制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

藍(lán)莓品種為“藍(lán)豐”，采摘當(dāng)天，選取成熟度相同，果實(shí)飽滿，無(wú)病蟲害，大小均勻一致的果實(shí)運(yùn)回沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗(yàn)室。分裝后置于室溫（20±0.5）℃貯藏。

1.2 儀器與設(shè)備

顯微鏡，日本OLYMPUS公司；FA-004電子分析天平，上海精科科技有限公司；PCR儀，美國(guó)Thermo Fisher scientific公司；電泳儀和電泳槽，北京市六一儀器廠；凝膠成像儀Amershan Imager 600，美國(guó)GE公司；酶標(biāo)儀，美國(guó)博騰儀器有限公司；臺(tái)式高速離心機(jī)，上海天美生化儀器設(shè)備工程有限公司。

1.3 方法

1.3.1 藍(lán)莓病原真菌的分離純化 稱取藍(lán)莓10 g，于90mL無(wú)菌生理鹽水中混勻，制成質(zhì)量濃度為10-1g/mL的菌混液。取1mL于9mL無(wú)菌生理鹽水中，制成質(zhì)量濃度為10-2g/mL的菌混液，同理制得質(zhì)量濃度10-3g/mL的菌混液。分別取10-1，10-2，10-3菌混液1mL涂布于孟加拉紅培養(yǎng)基中，28℃倒置培養(yǎng)48 h以上，每個(gè)梯度的菌混液分別重復(fù)4次涂布試驗(yàn)。待菌落長(zhǎng)出，觀察分離出的菌株的菌落形態(tài)。選擇生長(zhǎng)形態(tài)不同的病原真菌，挑取邊緣菌絲轉(zhuǎn)接到新的孟加拉紅培養(yǎng)基上培養(yǎng)，于28℃條件下倒置培養(yǎng)5～7 d，連續(xù)培養(yǎng)3～5次，使其在培養(yǎng)基上出現(xiàn)單一菌落，從而使藍(lán)莓表面病原真菌得到分離純化。

1.3.2 返接試驗(yàn) 選取新鮮無(wú)病害的藍(lán)莓用體積分?jǐn)?shù)75%乙醇浸泡5 s，無(wú)菌水清洗3次后取出、晾干備用[12]。用滅菌針頭在每個(gè)果實(shí)腰部穿刺，挑取純化好的菌絲接入孔內(nèi)。每種菌接種4～6顆藍(lán)莓，放于滅菌培養(yǎng)皿中，用紗布蓋好，常溫保存3～5 d，觀察發(fā)病情況。分離純化返接試驗(yàn)藍(lán)莓果實(shí)上的病原真菌，觀察是否與此前分離純化菌種相同。

1.3.3 藍(lán)莓病原真菌的生態(tài)學(xué)鑒定 將純化后的病原真菌置于培養(yǎng)基中培養(yǎng)5～10 d，觀察其純化菌株的菌落形態(tài)、性狀、色澤。采用插片法，在接種菌絲的孟加拉紅培養(yǎng)基中插入滅菌的蓋玻片，培養(yǎng)3～5 d后取出蓋玻片于顯微鏡下觀察其菌株的分生孢子及分生孢子梗的形狀、色澤，分生孢子縱橫隔膜的數(shù)目等性狀，通過與有關(guān)文獻(xiàn)對(duì)比，參照真菌形態(tài)學(xué)鑒定手冊(cè)和中國(guó)真菌志[13-15]對(duì)病原真菌種類進(jìn)行初步鑒定，確定主要病原真菌。

1.3.4 藍(lán)莓病原真菌DNA的提取 取新鮮菌體100mg加入液氮充分研磨，將研磨后的粉末收集到離心管中，參照康為世紀(jì)新型植物基因組DNA提取試劑盒提取。收集DNA溶液于-20℃保存。

1.3.5 藍(lán)莓病原真菌ITS區(qū)的PCR擴(kuò)增 在50 μL反應(yīng)體系中加入25μL 2×Taq MasterMix（Dye）、2μL Forward Primer，10μmol/L、2μL Reverse Primer，10μmol/L、0.5μL Template DNA，加ddH2O補(bǔ)足50μL。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性2min，94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，循環(huán)35次，72℃終延伸2min。

1.3.6 PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳分析 將0.2 g瓊脂糖粉末倒入20mL的TAE緩沖液中，煮開2次，加入EB染料，倒入配膠板中，得到質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的膠版。PCR體系反應(yīng)結(jié)束后，從獲得的體系中分別取出體積為5μL的PCR產(chǎn)物，加入凝固好的膠片中，同時(shí)加入5μL Marker 2000作為對(duì)照。將電泳條件設(shè)定為電壓U=95 V，電流I=400mA，時(shí)間T=20min。電泳結(jié)束后，經(jīng)凝膠成像分析系統(tǒng)成像，觀察是否有明亮單一的特異性條帶[16]。

1.3.7 藍(lán)莓病原真菌的相似性分析 將PCR產(chǎn)物送金唯智公司測(cè)序，利用SnapGene軟件處理測(cè)序結(jié)果后，將其提交到NCBI，使用GenBank中的Blast軟件在線比對(duì)，并下載相似的參比ITS rDNA序列，然后用MEGA7.0[17]軟件（Neighbor-Joining法）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，對(duì)其序列的相似性進(jìn)行分析。

1.3.8 溫度對(duì)藍(lán)莓病原真菌生長(zhǎng)的影響 在培養(yǎng)3~7 d的不同病原真菌的菌落邊緣用直徑為5 mm的打孔器打取菌苔，倒置接種于孟加拉紅平板上，分別在20，22，24，26，28，30℃的恒溫培養(yǎng)箱中黑暗條件下培養(yǎng)5 d。用十字交叉法[18]測(cè)量菌落直徑。每個(gè)溫度設(shè)3個(gè)重復(fù)，分析不同菌在不同溫度下的生長(zhǎng)情況。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

運(yùn)用NCBI Blast對(duì)ITS區(qū)擴(kuò)增產(chǎn)物序列進(jìn)行在線比對(duì)，采用MEGA7.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，采用Excel 2010對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 藍(lán)莓病原真菌菌落形態(tài)描述

藍(lán)莓病原真菌菌落如圖1、圖2、圖3所示，經(jīng)3~5次分離純化，分離出3種真菌，分別命名為L(zhǎng)、T、H。

真菌L菌落呈絨狀，后期顏色加深，逐漸生長(zhǎng)為墨綠色，菌落平整，邊緣整齊，有白色絨毛。底部呈現(xiàn)輪紋狀。

圖1 真菌L菌落形態(tài)Fig.1 Colony morphology of fungi L

圖2 真菌T菌落形態(tài)Fig.2 Colony morphology of fungi T

圖3 真菌H菌落形態(tài)Fig.3 Colony morphology of fungi H

真菌T具輻射狀皺紋，邊緣菌絲體白色，質(zhì)地絨狀，分生孢子結(jié)構(gòu)大量，藍(lán)綠色，5～7 d后有少許淺黃色滲出液和可溶性色素，菌落反面呈淺黃褐色。

真菌H菌落呈絨毛狀。顏色由淺黃色逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)樯铧S，5～7 d后逐漸變?yōu)楹诤稚q狀或帶粉狀，生長(zhǎng)迅速，邊緣毛糙。

2.2 返接試驗(yàn)結(jié)果

如圖4～6所示，在返接的藍(lán)莓上觀察到菌絲，接種的發(fā)病率為100%。其腐敗變質(zhì)的狀態(tài)與自然狀態(tài)下藍(lán)莓腐敗變質(zhì)狀態(tài)相同。從接種發(fā)病的藍(lán)莓果實(shí)上挑取菌絲再次分離純化，其形態(tài)性狀與原微生物相同，得到同種病原真菌。依照柯赫氏法則，可知此3類病原真菌為藍(lán)莓貨架期病害的主要致病菌[19]。

圖4 真菌L返接藍(lán)莓試驗(yàn)結(jié)果Fig.4 The results of fungi L return blueberry test

圖5 真菌T返接藍(lán)莓試驗(yàn)結(jié)果Fig.5 The results of fungi T return blueberry test

圖6 真菌H返接藍(lán)莓試驗(yàn)結(jié)果Fig.6 The results of fungi H return blueberry test

2.3 病原真菌的形態(tài)

如圖7、圖8所示，頂端稍膨大，有指狀分枝，呈掃帚狀，分枝上有一串孢子，分生孢子球形，分生孢子鏈稍叉開而呈現(xiàn)疏松的柱狀，初步斷定為青霉屬。

圖7 真菌L顯微鏡下形態(tài)Fig.7 The morphology of fungi L under the microscope

圖8 真菌T顯微鏡下形態(tài)Fig.8 The morphology of fungi T under the microscope

如圖9所示，分生孢子單生，分生孢子梗分枝，次生分生孢子?；蜴咦觽?cè)向分枝，形成矮樹狀分枝的分生孢子短鏈，初步斷定為鏈格孢屬。

2.4 藍(lán)莓病原真菌ITS區(qū)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳成像

圖10顯示藍(lán)莓病原真菌ITS區(qū)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳結(jié)果。在600 bp左右有條帶出現(xiàn)，符合真菌ITS區(qū)序列長(zhǎng)度范圍[20]，表明ITS區(qū)通用引物成功地?cái)U(kuò)增了藍(lán)莓病原真菌的ITS區(qū)基因序列。

圖9 真菌H顯微鏡下形態(tài)Fig.9 The morphology of Fungi H under the microscope

圖10 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳圖Fig.10 Gel electrophoresis of the product by PCR

2.5 藍(lán)莓病原真菌ITS區(qū)序列分析

利用NCBI中的Blast程序在線分析所提取的3種病原真菌的PCR擴(kuò)增片段序列，與Gen-Bank中已有的相關(guān)菌株的ITS序列進(jìn)行同源性比較，覆蓋率均超過90%，同源性超過90%。下載相似菌株序列，確定該菌株的系統(tǒng)發(fā)育位置，基于部分同源性較高的菌株用MEGA7.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（如圖11～13）。

病原真菌L、T、H的PCR擴(kuò)增長(zhǎng)度分別為554，560 bp和545 bp，所測(cè)序列在提交至NCBI中的Blast比對(duì)后，病原真菌L和T得到的同源性較高的菌株的ITS序列都是青霉屬，病原真菌H得到的同源性較高的菌株的ITS序列都是鏈格孢屬菌種。

圖11表明真菌L與尖海龍共附生真菌（Talaromyces amestolkiae）LT558951.1、青霉菌KP900322.1、青霉菌KP900320.1等的親緣關(guān)系較近，結(jié)合對(duì)病原真菌L的形態(tài)分析和ITS序列的相似性分析結(jié)果，確定真菌L為真核生物，菌類，雙核亞界，子囊菌門，盤菌亞門，散囊菌綱，散囊菌亞綱，散囊菌，曲霉科，青霉。

圖11 基于真菌L的ITSrDNA序列分析的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.11 Phylogenetic tree of ITSrDNA sequence analysis based on fungi L

圖12表明真菌T與產(chǎn)黃青霉KU743900.1、產(chǎn)黃青霉KU743899.1、灰玫瑰青霉（Penicillium griseoroseum）KY218671.1等的親緣關(guān)系較近，結(jié)合對(duì)病原真菌T的形態(tài)分析和ITS序列相似性分析結(jié)果，確定真菌T為真核生物，菌類，雙核亞界，子囊菌門，盤菌亞門，散囊菌綱，散囊菌亞綱，散囊菌，曲霉科，青霉，產(chǎn)黃青霉菌種復(fù)合物。

圖12 基于真菌T的ITSrDNA序列分析的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.12 Phylogenetic tree of ITSrDNA sequence analysis based on fungi T

圖13表明真菌H與鏈格孢菌KF380791.1、鏈格孢菌KP003824.1、極細(xì)鏈格孢菌（Alternaria tenuissima）KR912296.1等的親緣關(guān)系較近，結(jié)合對(duì)病原真菌H的形態(tài)分析和ITS序列的相似性分析，確定真菌H為真核生物，菌類，雙核亞界，子囊菌門，盤菌亞門，座囊菌綱，格孢菌亞綱，格孢腔菌目，孢腔菌科，黑斑，鏈格孢組。

2.6 溫度對(duì)藍(lán)莓病原真菌生長(zhǎng)的影響

表1～3所示不同種病原真菌在不同溫度下連續(xù)培養(yǎng)5 d菌落直徑的變化趨勢(shì)。

通過研究不同溫度對(duì)藍(lán)莓病原真菌生長(zhǎng)的影響，結(jié)果表明：青霉最適生長(zhǎng)溫度28℃，除第1天在26℃生長(zhǎng)較快外，之后都是28℃生長(zhǎng)最快，20℃或30℃以上生長(zhǎng)均較緩慢且高溫會(huì)抑制該真菌的生長(zhǎng)。產(chǎn)黃青霉第1天的適宜生長(zhǎng)溫度在24℃左右，之后在26℃生長(zhǎng)較快，從第3天開始最適生長(zhǎng)溫度在26～28℃之間，沒有明顯的差異，20℃和30℃以上均生長(zhǎng)較為緩慢。鏈格孢霉的適宜生長(zhǎng)溫度均為26℃，低溫抑制該真菌的生長(zhǎng)。

圖13 基于真菌H的ITSrDNA序列分析的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.13 Phylogenetic tree of ITSrDNA sequence analysis based on Fungi H

表1 不同溫度下青霉菌落的直徑Table1 Chrysosporium colony’s diameter at different temperatures

表2 不同溫度下產(chǎn)黃青霉菌落的直徑Table2 Diameter of Penicillium chrysogenum at different temperatures

表3 不同溫度下鏈格孢霉菌落的直徑Table3 Diameter of Alternaria alternata at different temperatures

3 討論

藍(lán)莓是具有較高經(jīng)濟(jì)價(jià)值和廣闊開發(fā)前景的新型果樹樹種，其果實(shí)具有防止腦神經(jīng)衰老，增強(qiáng)心臟功能，明目及抗癌等獨(dú)特功效[21]，被國(guó)際糧農(nóng)組織列為人類五大健康食品之一。然而藍(lán)莓果實(shí)成熟于6-8月份的高溫多濕季節(jié)，采后極易變質(zhì)、腐爛，因此研究藍(lán)莓果實(shí)貯藏過程中病害機(jī)理，從而開發(fā)出成本低廉、操作簡(jiǎn)便、安全高效的保鮮方法是今后藍(lán)莓保鮮技術(shù)研究的重點(diǎn)。

引起果品腐敗的微生物通常包括細(xì)菌、霉菌和酵母，以細(xì)菌和霉菌引起的果品腐敗最為常見。據(jù)報(bào)道，藍(lán)莓病害微生物主要有45個(gè)屬[22]。國(guó)外關(guān)于藍(lán)莓貯藏病害的研究報(bào)道主要集中在采后病害防治[23]，而在國(guó)內(nèi)，已分離出的細(xì)菌菌種包括沙雷氏菌屬、微桿菌屬和短小桿菌屬[24]。金義蘭等[25]針對(duì)貴州部分藍(lán)莓種植基地的藍(lán)莓病害進(jìn)行調(diào)查發(fā)現(xiàn)灰霉菌是藍(lán)莓主要病害真菌。梁晨等[9]針對(duì)北方地區(qū)栽培的藍(lán)莓采后病害致病病原菌分離鑒定出幾種常見的真菌，包括灰葡萄孢、青霉、褐孢霉、鏈格孢和枝頂孢等。徐成楠等[26]研究表明遼寧省部分地區(qū)藍(lán)莓采后病害主要是由尖孢炭疽菌和膠孢炭疽菌引起的。藍(lán)莓果實(shí)采后多采用冷藏法抑制細(xì)菌的滋生，貯藏效果并不十分明顯[27]。目前，國(guó)內(nèi)藍(lán)莓產(chǎn)業(yè)化已初步形成，而其成熟后感染霉菌會(huì)導(dǎo)致運(yùn)輸和貯藏過程中大量腐爛，嚴(yán)重影響其采后保鮮。對(duì)于藍(lán)莓而言，從源頭發(fā)現(xiàn)染病果實(shí)并及時(shí)處理，對(duì)減少其貯藏?fù)p失尤為重要。在藍(lán)莓生長(zhǎng)期，可通過徹底清園、加強(qiáng)管理、藥劑防治等方法防止藍(lán)莓被霉菌侵染[28]。藍(lán)莓在貯藏期間能否長(zhǎng)時(shí)間貯藏與本身的質(zhì)地、成熟度和所處環(huán)境的溫、濕度以及是否感染病原真菌有著密切的關(guān)系。果實(shí)采摘后，在果實(shí)采收、包裝、運(yùn)輸過程中劃傷或擠壓造成的微傷口，是微生物侵染的主要途徑[29]。

本試驗(yàn)通過對(duì)遼寧地區(qū)藍(lán)莓常溫貯藏過程中表面病原真菌的分離純化，結(jié)合傳統(tǒng)真菌形態(tài)鑒定和PCR擴(kuò)增測(cè)序的分子生物學(xué)鑒定，對(duì)藍(lán)莓貯藏期間主要病原真菌進(jìn)行診斷和分析。確定引起藍(lán)莓貯藏期腐敗變質(zhì)的病原真菌為青霉、產(chǎn)黃青菌和鏈格孢霉，這3種真菌皆屬腐爛致病菌，可導(dǎo)致貯藏期藍(lán)莓腐爛。本試驗(yàn)結(jié)果具有較高的普遍性，在不同品種的果蔬中經(jīng)常發(fā)現(xiàn)感染青霉菌或鏈格孢霉菌。霉菌侵染果后，不僅果實(shí)外觀受影響且降低果實(shí)品質(zhì)，還產(chǎn)生毒素，危害到人體的健康[30]。本試驗(yàn)對(duì)藍(lán)莓貯藏期表面病原真菌進(jìn)行初步的分離鑒定和序列診斷，確定其種類。其在貯藏期的傳播途徑、發(fā)生規(guī)律、致病機(jī)制[31]等還需進(jìn)一步的研究。

本試驗(yàn)最終通過對(duì)不同病原真菌在不同溫度下的生長(zhǎng)速率的分析，得出高溫和低溫均可抑制病原真菌的生長(zhǎng)。雖然高溫貯運(yùn)過程中有些病原真菌幾乎不生長(zhǎng)，但是高溫易造成脫水變質(zhì)。因應(yīng)適時(shí)采收，并盡快進(jìn)行預(yù)冷處理，在低溫下貯藏，以減少病原真菌的侵染，降低病害的發(fā)生率，進(jìn)而減少經(jīng)濟(jì)損失。