超高壓處理對冷藏鱸魚片細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響

趙宏強(qiáng) 藍(lán)蔚青* 劉書成 孫曉紅 謝 晶

（1 上海海洋大學(xué)食品學(xué)院 上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心食品科學(xué)與工程國家級實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心（上海海洋大學(xué)）上海201306

2 廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院 廣東省水產(chǎn)加工與安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室廣東高等教育機(jī)構(gòu)水產(chǎn)品深加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 廣東湛江524088）

鱸魚（Lateolabrax japonicus）又名花鱸，為鱸形目經(jīng)濟(jì)魚類，其主要生活在太平洋西部、中國沿海等地，又以我國黃海、渤海地區(qū)為多，因其肉質(zhì)鮮美，營養(yǎng)價值豐富而深受消費(fèi)者歡迎[1]。然而，其含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)和水分，易受外界污染，導(dǎo)致腐敗變質(zhì)，從而影響食用價值。采用適當(dāng)處理方式延緩其品質(zhì)劣變，延長貨架期成為國內(nèi)外研究學(xué)者普遍關(guān)注的課題。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，使用藍(lán)莓葉多酚處理鱸魚，能有效抑制細(xì)菌生長，減緩脂肪氧化[2]。近年來，隨著科技的發(fā)展，超高壓（High Hydrostatic Pressure，HHP）作為食品的冷處理方式之一逐漸得到科研人員的推崇。該處理方式是將食品物料放入一個高壓容器內(nèi)，以水、油等液體作為媒介傳遞壓力，在超高壓（100～1 000MPa）下保持一定時間，引起食品中非共價鍵（如氫鍵、離子鍵與疏水鍵等）的形成或破壞，導(dǎo)致食品中的微生物菌體死亡與蛋白質(zhì)變性等，從而起到殺菌鈍酶，改善食品品質(zhì)和延長貨架期的目的[3]。例如：Brianna等[4]研究了超高壓處理紅鮑魚，得出300MPa處理10min，可有效延長其貨架期，且理化與感官品質(zhì)均不受影響。

高通量測序（High-throughput sequencing）技術(shù)又稱“下一代”測序（Next-generation sequencing）技術(shù)，以能一次并行對幾十萬到幾百萬條DNA分子進(jìn)行序列測定，成為微生物領(lǐng)域中重要的研究方法，對于疾病預(yù)防與環(huán)境檢測具有重要意義[5]。相較于第一代測序（Sanger法）技術(shù)，高通量測序具有測序通量高與結(jié)果精準(zhǔn)等優(yōu)點(diǎn)[6]，雖建立時間不長，但發(fā)展迅速，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于基因組，包括測序、表觀基因組學(xué)與功能基因組學(xué)研究等方面[7]。所用技術(shù)中涉及的宏基因組是相關(guān)環(huán)境中所有微生物DNA的總和，該技術(shù)能將待測樣品中不可培養(yǎng)的微生物與低豐度微生物檢出，從而更好地反映樣品中微生物的種群結(jié)構(gòu)特征。通過與高通量測序技術(shù)相結(jié)合，使待測樣品的菌群結(jié)構(gòu)分析更加全面[8]。本文主要研究超高壓處理對冷藏鱸魚片細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)影響，以250MPa 9min的超高壓條件對鱸魚進(jìn)行處理，以0.1MPa處理為對照組。將處理后樣品置于4℃冰箱中貯藏，分別在0，3，6，9，11，13，15 d進(jìn)行總揮發(fā)性鹽基氮（Total Volatile Basic Nitrogen，TVB-N）與微生物指標(biāo)（細(xì)菌總數(shù)、希瓦氏菌數(shù)、假單胞菌數(shù)和嗜冷菌數(shù)）測定，并作相關(guān)性分析，以此評價不同處理方式對冷藏鱸魚品質(zhì)的影響。隨后分別提取鱸魚魚肉在貯藏前期、中期、中后期與末期4個階段的宏基因組，采用高通量測序技術(shù)分析冷藏鱸魚片不同階段的總細(xì)菌菌群，以期為超高壓處理技術(shù)在水產(chǎn)品保鮮領(lǐng)域中的推廣應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 原料

鮮活鱸魚，購自上海市浦東新區(qū)農(nóng)工商超市。樣品體態(tài)勻稱，質(zhì)量為（500±50）g，體長（28±2）cm，30min內(nèi)運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室仍保持鮮活狀態(tài)，層冰層魚裝入泡沫箱內(nèi)進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2 主要藥品、試劑

平板計數(shù)瓊脂培養(yǎng)基、胰蛋白胨、氯化鈉、輕質(zhì)氧化鎂（均為國產(chǎn)分析純），國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；假單胞菌選擇性培養(yǎng)基、鐵瓊脂，青島海博生物技術(shù)有限公司等。

1.3 主要設(shè)備與儀器

INV7-2996型真空包裝機(jī)（抽氣速率20m3/h，抽氣時間10 s，電熱封口時間1.5 s），美國INTERVAC公司；HPP.L2-600/2型超高壓設(shè)備，華泰森淼儀器有限公司；Kjeltec8400型凱式定氮儀，丹麥FOSS中國上海有限公司；5810R型冷凍離心機(jī)，德國Eppendorf公司；BCD-256KF型冰箱，青島海爾股份有限公司；TGL-16M型臺式高速冷凍離心機(jī)，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司；FJ200-S型數(shù)顯高速均質(zhì)機(jī)，杭州齊威儀器有限公司；SW-CJ-1D型單人凈化工作臺，蘇州凈化設(shè)備有限公司；生化培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；MLS-3750型滅菌鍋，日本SANYO公司；DYCZ-21型電泳槽、DYY-6C型電泳儀電源，北京市六一儀器廠；凝膠成像系統(tǒng)（美國UVP）；AUW320型分析天平，日本島津公司；722型可見分光光度計，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；Kjeltec2300型凱氏定氮儀，丹麥FOSS公司等。

1.4 原料處理

將運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室的鮮活鱸魚放入盛滿碎冰的泡沫箱中，使其窒息死亡，然后去頭、去尾、去內(nèi)臟與去皮，用蒸餾水洗凈瀝干。將預(yù)處理好的鱸魚片隨機(jī)裝入真空包裝袋內(nèi)，真空包裝，抽氣速率20m3/h，抽氣時間10 s，電熱封口時間1.5 s。從樣品猝死到前處理完成，全過程在15min內(nèi)完成。將包裝完成的樣品分為兩組：超高壓處理組壓力為250 MPa，以未作超高壓處理的樣品設(shè)為對照組（0.1 MPa），保壓時間均為9min。以水為媒介，升壓速率8MPa/s，卸壓處理10 s完成。將不同超高壓處理的樣品分組放入4℃冰箱中貯藏，分別于0，3，6，9，11，13，15 d測定各項指標(biāo)。

1.5 試驗(yàn)方法

1.5.1 指標(biāo)分析

1.5.1.1 TVB-N值 準(zhǔn)確稱取10 g碎魚肉，用凱氏定氮儀測定其TVB-N值，每個樣品做3個平行。根據(jù)水產(chǎn)品中揮發(fā)性鹽基氮的測定（GB5009.228-2016）[9]可知，TVB-N值≤13mgN/100 g為一級品，13mgN/100 g＜TVB-N值≤30mgN/100 g為合格品，TVB-N值＞30mgN/100 g為不可接受范圍。

1.5.1.2 微生物指標(biāo)（細(xì)菌總數(shù)、嗜冷菌數(shù)、假單胞菌數(shù)、希瓦氏菌數(shù)）參考GB 4789.2-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)菌落總數(shù)》[10]操作。在無菌工作臺稱取10 g魚肉，放入無菌均質(zhì)袋中，加入90mL無菌生理鹽水后拍打勻漿，取1mL做10倍稀釋。根據(jù)樣品感官與貯藏時間選取3個合適濃度的稀釋液，移取1mL稀釋液于滅菌的培養(yǎng)皿內(nèi)，及時將15～20mL不同選擇性瓊脂培養(yǎng)基傾注平皿，輕輕轉(zhuǎn)動平皿使其混合均勻。待瓊脂凝固后，將平板翻轉(zhuǎn)，置于生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)，培養(yǎng)條件如表1所示，選取的每個稀釋度做3個平行。

表1 鱸魚貯藏期間細(xì)菌總數(shù)、嗜冷菌數(shù)、假單胞菌數(shù)和希瓦氏菌數(shù)的培養(yǎng)條件Table1 Cultural conditions of TVC，Psychobacter bacteria counts，Pseudomonas counts and Shewanella counts in Lateolabrax japonicus during cold storage

表2 第1輪PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系Table2 PCR Reaction system at the first round

表3 第2輪PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系Table3 PCR Reaction system at the second round

1.5.2 高通量測序

1.5.2.1 總DNA提取與PCR擴(kuò)增 采用液氮研磨法將魚肉樣品磨成粉末狀，提取樣品中的總菌群宏基因組，隨后用核酸蛋白儀檢測DNA的濃度和純度，置于-20℃?zhèn)溆?。通用引物選擇序列V3-V4（341F引物：CCCTACACGACGCTCTTCCGATCTGCCTACGGGNGGCWGCAG；805R引物：GACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCAGA CTACHVGGGTATCTAATCC）。PCR擴(kuò)增兩輪，第1輪PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系見表2。

第1輪PCR反應(yīng)步驟：1）94℃熱啟動3min；94℃30 s；45℃20 s；65℃30 s進(jìn)行5個循環(huán)；之后94℃20 s，55℃20 s；72℃30 s進(jìn)行20個循環(huán)，最后72℃延伸5min。隨后進(jìn)行第2輪PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系見表3。

第2輪PCR反應(yīng)步驟：1）95℃熱啟動3min；94℃20 s；55℃20 s；72℃30 s進(jìn)行5個循環(huán)，最后72℃延伸5min。PCR結(jié)束后取3μL PCR產(chǎn)物于1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.5.2.2 DNA純化回收與測序 對細(xì)菌擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物和正常擴(kuò)增片段在400 bp以上的PCR產(chǎn)物，選用0.6倍的磁珠（Agencourt AMPure XP）處理。對真菌PCR產(chǎn)物和其它擴(kuò)增片段低于400 bp的PCR產(chǎn)物，選用0.8倍的磁珠處理。在25 μL PCR產(chǎn)物中加入體積0.6倍的磁珠，震蕩、充分懸浮后放在磁力架上吸附5min，用移液槍吸出上清。加入30μL 0.6倍的磁珠洗滌液，震蕩、充分懸浮后放在磁力架上吸附5min，小心吸出上清。加入90μL洗滌緩沖液（或70%乙醇），反向放在磁力架上，使磁珠吸附到PCR管的另一面，充分吸附后吸出上清。將PCR管或8聯(lián)管放在55℃烘箱5min，使乙醇完全揮發(fā)，加入30μL洗脫緩沖液洗脫。將PCR管放在吸附架上5min，充分吸附，移出上清到干凈的1.5mL離心管中，定量備用。最后，將定量的DNA文庫樣本送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行高通量測序。

1.6 數(shù)據(jù)處理

對試驗(yàn)數(shù)據(jù)用軟件origin（Pro）8.5繪制曲線。對測序得到的原始序列進(jìn)行處理，首先去除引物接頭序列，根據(jù)PE reads間的overlap關(guān)系，將成對的reads拼接成一條序列，然后按照barcode標(biāo)簽序列識別樣品，得到各樣本數(shù)據(jù)，最后對各樣本數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控過濾，得到各樣本有效數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 TVB-N值

魚肉貯藏過程中，由于微生物及魚體內(nèi)源酶的共同作用，其蛋白質(zhì)發(fā)生降解，產(chǎn)生胺類物質(zhì)，導(dǎo)致TVB-N值升高，因此，TVB-N值是指示水產(chǎn)品腐敗程度的重要指標(biāo)[11]。

圖1顯示，貯藏前期，兩組的TVB-N值差異性不明顯，貯藏6 d后，對照組樣品的TVB-N值迅速上升。其中，超高壓處理組樣品的TVB-N值明顯低于對照組。這可能是由于樣品貯藏前期，其微生物數(shù)量還未占優(yōu)勢，增長不明顯[12]。對照組樣品15 d時TVB-N值達(dá)（41.86±1.595）mgN/100 g，超出限度值，為不可接受水平，而超高壓處理組15 d時TVB-N值為（32.56±1.471）mgN/100 g，超出限值。由此可見，超高壓處理能明顯延緩鱸魚樣品TVB-N值的上升，使其冷藏貨架期得到相應(yīng)延長。這與楊茜等[13]超高壓處理帶魚魚段所得TVBN值的變化趨勢相似。

圖1 超高壓處理對冷藏鱸魚片TVB-N值的影響Fig.1 Effect of high hydrostatic pressure for TVB-N value in Lateolabrax japonicas fillets during cold storage

2.2 微生物指標(biāo)

微生物指標(biāo)是水產(chǎn)品最重要的品質(zhì)評價標(biāo)準(zhǔn)之一，其對水產(chǎn)品在貯藏過程中品質(zhì)的影響特別明顯，由微生物的生長和新陳代謝所造成的水產(chǎn)品損失可達(dá)30%[14-15]。細(xì)菌總數(shù)的變化可反映蛋白質(zhì)和氨基酸分解代謝情況，表征其腐敗程度。Al-Daqal等[16]提出水產(chǎn)品可食用的細(xì)菌總數(shù)上限為6.0 lg（CFU/g）

圖2 超高壓處理對冷藏鱸魚片細(xì)菌總數(shù)、希瓦氏菌數(shù)、假單胞菌數(shù)和嗜冷菌數(shù)的影響Fig.2 Effect of high hydrostatic pressure for TVC，Shewanella counts，Pseudomonas counts and PBC value in Lateolabrax japonicas fillets during cold storage

由圖2a所示，貯藏前期（0 d），對照組與高壓處理組鱸魚魚片的細(xì)菌總數(shù)分別為（2.28±0.17）lg（CFU/g）和（2.07±0.12）lg（CFU/g），符合新鮮魚肉的一級品要求，說明前期鱸魚的宰殺處理過程中未受到微生物的污染。貯藏中、后期，超高壓處理組樣品的細(xì)菌總數(shù)值明顯低于對照組，這可能是由于超高壓處理后，部分微生物細(xì)胞膜被破壞，酶活性被抑制，導(dǎo)致其失活或者死亡[17]。從圖2b、2c與2d可看出，超高壓處理組樣品在各時期的希瓦氏菌數(shù)、假單胞菌數(shù)與嗜冷菌數(shù)均低于對照組，說明超高壓處理對鱸魚樣品中的主要微生物有一定抑制效果。

2.3 相關(guān)性分析

從表4看出，對照組與超高壓處理組中各指標(biāo)的整體性變化基本一致。隨著樣品貯藏時間的延長，其TVB-N值、細(xì)菌總數(shù)、假單胞菌、希瓦氏菌和嗜冷菌等指標(biāo)呈增長趨勢，且正相關(guān)差異極顯著（P＜0.01）。超高壓處理能有效延緩樣品TVBN值的升高與抑制多種細(xì)菌的增殖。同時說明TVB-N值與微生物指標(biāo)可作為鮮度評價指標(biāo)，評價鱸魚片超高壓處理后貯藏期間的品質(zhì)變化。

表4 不同處理的樣品貯藏期間各指標(biāo)的相關(guān)性分析Table4 Correlation analysis among parameters of each group with different treatments during cold storage

2.4 樣本文庫的獲取與定量

選取不同貯藏時間的8個鱸魚樣品，提取各樣本的總DNA，對細(xì)菌16sRNA V3-V4區(qū)基因擴(kuò)增，并對PCR擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行膠回收，獲得樣本文庫，具體見圖3與圖4。

圖3 鱸魚魚片樣本總DNA瓊脂糖凝膠電泳Fig.3 Agarose gel electrophoresis of total DNA in Lateolabrax japonicas fillets samples

圖4 鱸魚魚片樣本總DNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳Fig.4 Agarose gel electrophoresis of PCR amplification products for total DNA in Lateolabrax japonicas fillets

從圖3可以看出，電泳圖譜中的部分條帶模糊，清晰度不高，表明其DNA濃度低（見表5）。由圖4可知，電泳圖譜中檢測目的條帶單一，片段長度與預(yù)期片段大小一致，適合進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

表5 鱸魚樣本PCR產(chǎn)物定量結(jié)果Table5 Quantitative results of PCR products in Lateolabrax japonicas fillets samples

2.5 各樣本屬水平上的比較分析

對8個樣本的有效基因序列在軟件中分析，根據(jù)各樣本中細(xì)菌種類組成繪制柱狀圖，所占比例低的細(xì)菌種類統(tǒng)一歸至其它類。

圖5 樣本在屬水平上群落結(jié)構(gòu)組成差異Fig.5 Differences in community structure composition in the genera level of samples

圖5顯示在細(xì)菌屬水平上分析不同處理隨貯藏時間的變化情況。對照組與超高壓處理組樣品在貯藏前期的細(xì)菌種類相似度較高，而在中、后期出現(xiàn)明顯差異。其中，對照組樣品的中期細(xì)菌有：嗜冷菌屬（Psychrobacter sp.48.83%）、希瓦氏菌屬（Shewanella sp.17.09%）、假單胞菌屬（Pseudomonas sp.11.32%）與不動桿菌屬（Acinetobacter sp.7.51%）；中、后期有：假單胞菌屬（Pseudomonas sp.51.97%）、嗜冷菌屬（Psychrobacter sp.8.32%）、乳球菌屬（Lactococcus sp.6.61%）與不動桿菌屬（Acinetobacter sp.6.54%）；末期有：氣單胞菌屬（Aeromonas sp.28.13%）、嗜冷菌屬（Psychrobacter sp.24.45%）、希瓦氏菌屬（Shewanella sp.16.64%）與假單胞菌屬（Pseudomonas sp.13.72%）。超高壓處理組樣品在貯藏中期的細(xì)菌主要有：不動桿菌屬（Acinetobacter sp.44.54%）、嗜冷菌屬（Psychrobacter sp.35.08%）、肉食桿菌屬（Carnobacterium sp.11.93%）；中、后期：嗜冷菌屬（Psychrobacter sp.69.82%）與肉食桿菌屬（Carnobacterium sp.13.6%）；末期：肉食桿菌屬（Carnobacterium sp.45.19%）、嗜冷菌屬（Psychrobacter sp.27.02%）、假單胞菌屬（Pseudomonas sp.11.46%）與耶爾森菌屬（Yersinia sp.10.85%）。從圖5還可以看出，在貯藏中后期與末期兩個階段，超高壓處理組與對照組的菌相組成出現(xiàn)顯著差異，優(yōu)勢腐敗菌種類不同。對照組在中、后期的主要細(xì)菌為假單胞菌屬（Pseudomonas sp.），超高壓處理組在中、后期的主要細(xì)菌為嗜冷菌屬（Psychrobacter sp.）。對照組末期主要腐敗菌為嗜冷菌屬（Psychrobacter sp.）、假單胞菌屬（Pseudomonas sp.）、希瓦氏菌屬（Shewanella sp.）和氣單胞菌屬（Aeromonas sp.），超高壓處理組末期主要腐敗菌為嗜冷菌數(shù)（Psychrobacter sp.）、假單胞菌屬（Pseudomonas sp.）、耶爾森氏菌屬（Yersinia sp.）。圖中各種細(xì)菌的比例代表不同階段細(xì)菌活性的狀態(tài)，如希瓦氏菌屬、假單胞菌屬和嗜冷菌屬均占有一定比例。對照試驗(yàn)前期數(shù)據(jù)圖2所示，對照組的希瓦氏菌屬細(xì)菌在試驗(yàn)的各階段均存在，尤其在貯藏末期，希瓦氏菌的生長占主要優(yōu)勢，處于不可計數(shù)范圍，超出其限值，這與楊勝平等[18]通過高通量法研究南美白對蝦貯藏期間的菌相變化：樣品在4℃貯藏6 d，希瓦氏菌占相當(dāng)比例的結(jié)果相似。圖5對照組（A、B、C、D）中顯示希瓦氏菌屬在4個階段的細(xì)菌豐度狀態(tài)，中、后期階段的希瓦氏菌數(shù)逐漸增加，其所占比例較大，末期有所下降，此結(jié)果與唐文靜等[19]研究鱸魚腐敗菌的情況一致。不同組別樣品在不同時期細(xì)菌種類上的差異表明超高壓處理對鱸魚樣品貯藏過程中菌相的影響顯著。

3 結(jié)論

本文分析了超高壓處理對冷藏鱸魚片貯藏期間的品質(zhì)變化，通過測定TVB-N值、細(xì)菌總數(shù)、假單胞菌數(shù)、希瓦氏菌數(shù)和嗜冷菌數(shù)等指標(biāo)，得出結(jié)論：超高壓處理能明顯延緩其冷藏貨架期4～5 d。指標(biāo)間的相關(guān)性分析表明，TVB-N值與微生物指標(biāo)間正相關(guān)，且差異性極顯著，能很好地表征鱸魚片貯藏期間的品質(zhì)變化。利用高通量測序法分析兩種處理方式在不同貯藏階段（前期、中期、中后期與末期）的細(xì)菌多樣性，結(jié)果兩個處理組共獲338 531條優(yōu)化的序列數(shù)。根據(jù)鱸魚魚肉樣本中的細(xì)菌主成分分析結(jié)果，得到不同貯藏時期的優(yōu)勢腐敗菌種類，反映不同樣本間的相似性與差異性。通過對高通量測序結(jié)果的分析，發(fā)現(xiàn)嗜冷菌屬、假單胞菌屬、希瓦氏菌屬、氣單胞菌屬與肉食桿菌屬等細(xì)菌均被檢出，成為鱸魚片在不同貯藏時期的腐敗菌群。綜上所述，高通量測序技術(shù)能準(zhǔn)確檢測出超高壓處理后鱸魚片樣品中的細(xì)菌種類與含量分布。