單液滴干燥過(guò)程中載體組分對(duì)植物乳桿菌的保護(hù)作用

蔣蘇穎 伍文彬 朱雪梅 熊 華

（南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 南昌330047）

根據(jù)美國(guó)食品與農(nóng)業(yè)組織（FHO）及世界衛(wèi)生組織（WHO）的定義，益生菌是一類當(dāng)達(dá)到足夠數(shù)量時(shí)對(duì)宿主產(chǎn)生益處的活性微生物[1]，具有調(diào)節(jié)胃腸，提高機(jī)體免疫力，促進(jìn)鈣的吸收等功能[2-3]。在食品和病理學(xué)應(yīng)用中廣泛使用的乳桿菌屬還可以通過(guò)預(yù)防或減少病原體的發(fā)病率來(lái)增強(qiáng)食品安全和消費(fèi)者的健康[4]。根據(jù)Shah等[5]的建議，食品中益生菌含量至少要達(dá)到106CFU/g才能發(fā)揮其活性，達(dá)到有益效果。然而，即使這類食品在被食用前滿足這一要求，進(jìn)入機(jī)體后，在低pH的腸、胃以及高膽鹽條件下益生菌的存活率仍然是一個(gè)問(wèn)題[6-8]。近年來(lái)，采用微膠囊技術(shù)來(lái)提高益生菌在加工儲(chǔ)存及機(jī)體攝入過(guò)程中的存活率成為科研工作者的一個(gè)研究熱點(diǎn)[9]。

微膠囊技術(shù)是通過(guò)添加糖類、蛋白類或其它物質(zhì)形成物理屏障，使益生菌得到保護(hù)，以避免物理?yè)p傷而失活的一種最新的高效保持益生菌活力的方法，在食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域得到非常廣泛的應(yīng)用[10]。之前，有大量文獻(xiàn)報(bào)道制作益生菌微膠囊的方法，包括冷凍干燥、噴霧干燥、真空干燥和流化床干燥，這些方法都在一定程度上提高了菌種的存活率[11]。益生菌微膠囊生產(chǎn)的傳統(tǒng)方法主要是通過(guò)冷凍干燥，該方法需要相對(duì)較長(zhǎng)的時(shí)間且耗能高[4]。利用噴霧干燥將樣品加工成粉末的方法已經(jīng)成為生產(chǎn)活性菌粉的熱點(diǎn)[12]。相關(guān)報(bào)道發(fā)現(xiàn)，與冷凍干燥相比，細(xì)菌和酵母經(jīng)噴霧干燥后生存率可高達(dá)80%～100%，并且噴霧干燥的成本相對(duì)較低[13-14]。由于噴霧干燥塔的設(shè)計(jì)問(wèn)題，所以研究塔內(nèi)液滴的干燥歷程有較大難度，單液滴干燥（single droplet drying，SDD）是目前唯一一種可對(duì)液滴至顆粒轉(zhuǎn)化過(guò)程進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控與定量測(cè)量的研究工具[15]，可實(shí)現(xiàn)對(duì)液滴形貌變化全過(guò)程監(jiān)控及對(duì)液滴干燥動(dòng)力學(xué)的準(zhǔn)確測(cè)量，使干燥過(guò)程中所發(fā)生的狀態(tài)變化變?yōu)橥该骰痆16]。本試驗(yàn)中利用SDD技術(shù)，采用不同DE值糖漿，不同熔點(diǎn)棕櫚油包埋植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum），對(duì)其進(jìn)行微膠囊化前處理，對(duì)其單一液滴的干燥歷程進(jìn)行研究，以期對(duì)該材料在噴霧干燥壁材配方優(yōu)化中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum），中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心；糖漿（DE25，DE18），江西恒頂食品有限公司；棕櫚油，杭州旺源科技有限公司；MRS肉湯培養(yǎng)基，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；其它化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純級(jí)。

1.2 儀器與設(shè)備

微量進(jìn)樣器5μL，寧波市鎮(zhèn)海三愛(ài)有限公司；高壓滅菌鍋，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；無(wú)菌工作臺(tái)，蘇凈集團(tuán)安泰公司；單液滴干燥設(shè)備，南通東概念材料有限公司；空壓機(jī)，江蘇岱洛醫(yī)療科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種的活化及培養(yǎng) 將保存在甘油中的菌種接入已滅菌的MRS液體培養(yǎng)基中，于37℃厭氧培養(yǎng)24 h，以體積分?jǐn)?shù)2.5%轉(zhuǎn)接于新鮮的MRS液體培養(yǎng)基（已滅菌）中37℃厭氧培養(yǎng)24 h，獲得處于穩(wěn)定期的植物乳桿菌。將菌液以4 000 r/min，4℃離心20min，棄上清液，收集菌體，用0.85%的無(wú)菌生理鹽水洗滌，再次離心，棄上清液，收集菌泥。

1.3.2 植物乳桿菌菌懸液的制備 將一定量的水和磷酸氫二鉀水浴加熱，當(dāng)溫度30～40℃時(shí)加入酪蛋白酸鈉，加熱并不停攪拌至酪蛋白酸鈉全部溶解，分別加入DE25和DE18糖漿，攪拌使之完全溶解。另將不同熔點(diǎn)的棕櫚油和一定量的乳化劑（單甘脂、硬脂酸鈉）加熱攪拌使之熔化。

將制得的油相物料邊攪拌邊緩慢注入水相物料中，繼續(xù)攪拌30～45min，得到4種O/W乳液，分別為DE25糖漿/高熔點(diǎn)棕櫚油（HMP），DE25糖漿/低熔點(diǎn)棕櫚油（LMP），DE18糖漿/高熔點(diǎn)棕櫚油（HMP），DE18糖漿/低熔點(diǎn)棕櫚油（LMP）（以下簡(jiǎn)稱DE25/HMP、DE18/HMP、DE25/LMP、DE18/LMP），然后將1.3.1節(jié)獲得的菌泥加入制得的乳液中，通過(guò)高速剪切分散機(jī)10 000 r/min分散2 min，再經(jīng)20MPa高壓均質(zhì)機(jī)處理制得菌懸液，待用。

1.3.3 單液滴干燥試驗(yàn) 單滴干燥儀由空氣供應(yīng)系統(tǒng)和液滴干燥系統(tǒng)兩個(gè)系統(tǒng)組成?？諝夤?yīng)系統(tǒng)用于壓縮空氣，調(diào)節(jié)成具有可控溫度、速度和濕度的氣流，液滴可以懸掛在特制玻璃絲的尖端，在調(diào)節(jié)氣流的過(guò)程中進(jìn)行干燥。液滴干燥系統(tǒng)包含3個(gè)液滴懸掛模塊，每個(gè)模塊包含專門設(shè)計(jì)用于干燥過(guò)程中測(cè)量液滴參數(shù)的懸浮玻璃絲，在相同的干燥條件下使用不同懸掛模塊測(cè)量液滴相應(yīng)的參數(shù)[17-19]。單液滴干燥儀試驗(yàn)裝置示意圖見圖1。

圖1 單滴干燥儀試驗(yàn)裝置示意圖Fig.1 Schematic diagram of drying experimental set-up of the single droplet

在單滴干燥試驗(yàn)中先使用微量注射器在干燥室外生成體積為3μL的液滴并掛于玻璃絲小球末端上，掛定后開始記錄干燥視頻。單液滴干燥試驗(yàn)的具體參數(shù)設(shè)定見表1。干燥不同的時(shí)間（0，30，60，90，120，150，180，210，240 s）后，分別用盛有1 mL的0.85%無(wú)菌生理鹽水溶解不同干燥時(shí)間的半干顆粒，然后采用十位稀釋法，稀釋到一定稀釋度。取20μL涂布培養(yǎng)平板中，37℃厭氧培養(yǎng)48 h，記錄菌落生成數(shù)。使用熱電偶測(cè)量液滴干燥期間溫度的變化，并用測(cè)溫軟件得到的數(shù)據(jù)繪制曲線圖。在干燥過(guò)程中，利用長(zhǎng)玻璃絲的位移獲得液滴質(zhì)量數(shù)據(jù)。首先，在相同干燥條件下懸浮不同質(zhì)量的橡皮泥顆粒，記錄玻璃絲的相應(yīng)位移，繪制校準(zhǔn)曲線，然后在特定干燥條件下測(cè)量樣品液滴。液滴質(zhì)量使用圖像處理軟件Image J分析圖片棧得到，試驗(yàn)結(jié)果為3次試驗(yàn)平均值。液滴失水量用Xn表示，計(jì)算公式如下：

表1 單液滴干燥條件Table1 The drying conditions of single droplet

式中：X0——液滴最初質(zhì)量（mg）；Xm——干燥一定時(shí)間的液滴質(zhì)量（mg）。

1.3.4 掃描電子顯微鏡（SEM）觀察 將干燥5 min的單個(gè)液滴顆粒從懸浮的玻璃絲上取下，每個(gè)樣品至少取3個(gè)干燥顆粒，將其破碎并固定，立即噴金，在加速電壓5 kV下用掃描電子顯微鏡觀察樣品的微觀結(jié)構(gòu)。

1.3.5 乳狀液的熱穩(wěn)定性分析 取1.3.2節(jié)制得的4種O/W乳狀液，在同一干燥條件下干燥后收集10mg，置于差示熱量掃描儀（Differential scanning calorimeter，DSC）專用鋁盒中，樣品盤升溫速率為5℃/min，升溫范圍為0～100℃。

1.3.6 數(shù)據(jù)分析 試驗(yàn)數(shù)據(jù)均為3個(gè)獨(dú)立平行樣的平均值，采用Origin9.1作圖，SPSS16.0軟件處理數(shù)據(jù)，分析其顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同DE值糖漿／不同熔點(diǎn)棕櫚油對(duì)植物乳桿菌菌活的影響

圖2、圖3分別為90℃和110℃干燥條件下植物乳桿菌的失活過(guò)程。圖2a為90℃干燥條件下植物乳桿菌的活菌細(xì)胞濃度變化?？梢杂^察到，在單液滴干燥的前150 s，4個(gè)樣品活菌濃度基本無(wú)顯著變化，液滴干燥至180 s時(shí)，DE25、DE18/LMP的兩個(gè)樣品中活菌濃度開始急劇下降，下降量分別約為1.60 lg（CFU/mL）、1.63 lg（CFU/mL）；而含HMP的樣品中植物乳桿菌活菌濃度在210 s才開始明顯下降。當(dāng)液滴干燥150 s后，HMP的兩個(gè)樣品液滴活菌濃度始終高于含LMP的兩個(gè)樣品，尤其是DE25/HMP包覆的植物乳桿菌其活菌濃度在干燥后期始終高于其它3個(gè)樣品，并且整個(gè)干燥過(guò)程中只下降約2 lg（CFU/mL）。在110℃干燥條件下4個(gè)樣品的活菌濃度（圖3a）有同樣的變化趨勢(shì)。由圖3a可以看出，與90℃干燥條件相比，活菌濃度開始大幅度下降的時(shí)間提前且不同樣品間下降趨勢(shì)有所不同。這可能是因?yàn)樵谳^高溫度條件下液滴溫度和濕度的快速變化對(duì)細(xì)菌細(xì)胞造成多重壓力，包括熱損傷、滲透壓力以及氧化應(yīng)激能力，從而對(duì)多個(gè)細(xì)胞結(jié)構(gòu)部位造成損害，使得菌細(xì)胞滅活過(guò)程變得更為復(fù)雜[4，20]。在干燥后期同樣可以觀察到含HMP的液滴植物乳桿菌菌活濃度高于LMP液滴（圖3a）。根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)[21]～[23]報(bào)道稱，細(xì)胞膜外側(cè)的糖類物質(zhì)對(duì)細(xì)胞膜起到較好的保護(hù)作用，并且糖類保護(hù)劑可以降低相變溫度，使細(xì)胞液晶相不易向凝膠相轉(zhuǎn)變。結(jié)合本試驗(yàn)中圖2a及圖3a可以發(fā)現(xiàn)，在單一液滴的干燥過(guò)程中不同熔點(diǎn)的棕櫚油比不同DE值糖漿對(duì)植物乳桿菌的存活率影響更大。

植物乳酸菌在干燥過(guò)程中的失活與液滴的溫度及失水有關(guān)。干燥過(guò)程中液滴的質(zhì)量變化如圖2b及圖3b所示。4個(gè)樣品的質(zhì)量變化即失水速率變化趨勢(shì)基本相同。圖3b與圖2b相比，溫度更高的情況下，液滴質(zhì)量下降速率明顯更快；然而，在不同干燥條件下，壁材為DE25糖漿的樣品在干燥后期液滴質(zhì)量的變化速率均比DE18糖漿的小，可能是由于DE25/DE18糖漿都是低轉(zhuǎn)化糖漿，并且糖漿DE值越高黏度越大，阻止了水分的蒸發(fā)。在干燥過(guò)程中4個(gè)樣品的液滴溫度存在一定的差異，如圖2c所示，90℃干燥條件下，HMP液滴在干燥前50 s溫度均高于LMP液滴，從50 s直到干燥結(jié)束，含HMP的液滴溫度均低于LMP液滴；在110℃干燥條件下可以觀察到整個(gè)干燥過(guò)程中HMP液滴溫度都比LMP液滴溫度低（圖3c）。Chen X D等[24]發(fā)現(xiàn)益生菌在噴霧干燥時(shí)溫度高于65℃就開始大量死亡，可能是由于65℃是菌體中核糖體開始解體的溫度。液滴達(dá)到65℃的時(shí)間越長(zhǎng)，菌體的存活率越高。由圖2c和圖3c可以發(fā)現(xiàn)HMP的液滴到達(dá)65℃時(shí)所消耗的時(shí)間均比含LMP的液滴短。結(jié)合圖2a和圖3a的菌活變化情況，HMP液滴中菌體存活率高，推斷出干燥過(guò)程中液滴的溫度是影響菌活的主要原因。

圖2 90℃干燥條件下植物乳桿菌的菌活量及干燥參數(shù)變化Fig.2 Inactivation histories of L.plantarum and corresponding Drying kinetics during single droplet drying at 90℃

圖3 110℃干燥條件下植物乳干菌的菌活量及干燥參數(shù)變化Fig.3 Inactivation histories of L.plantarum and corresponding drying kinetics during single droplet drying at 110℃

2.2 植物乳桿菌失活與液滴干燥參數(shù)的相關(guān)性

圖4顯示90，110℃干燥過(guò)程中液滴失水量與植物乳桿菌存活率的關(guān)系。在噴霧干燥過(guò)程中益生菌脫水也是導(dǎo)致其失活的一個(gè)重要因素[25]。用N/N0（N為干燥一定時(shí)間后的菌活濃度，N0為初始菌活濃度）表示植物乳桿菌存活率是為了避免初始菌活濃度不一致導(dǎo)致的誤差（圖4，圖5）。圖4顯示：隨著Xn的逐漸增大，液滴的水分含量逐漸減小。由圖4a和圖4b可以看出，不同溫度干燥條件下各樣品間Xn與N/N0的趨勢(shì)存在差異。90℃干燥后期HMP液滴中植物乳桿菌存活率明顯高于LMP液滴（圖4a），說(shuō)明在低水分含量液滴中棕櫚油對(duì)植物乳桿菌存活量起關(guān)鍵作用。由圖4b觀察到在干燥后期當(dāng)液滴Xn相同時(shí)，以DE25糖漿為壁材的液滴中植物乳桿菌存活率大于DE18液滴。在最終階段，HMP液滴菌活仍高于LMP樣品。糖漿與棕櫚油對(duì)液滴水分含量的作用受到外界干燥條件的影響，對(duì)植物乳桿菌菌活的影響效果不一。

圖4 干燥過(guò)程中液滴失水量與植物乳干菌存活率的關(guān)系Fig.4 The relationship between the decrease in droplet moisture content and the survival rate of L.plantarum during single droplet drying

圖5 干燥過(guò)程中液滴溫度與植物乳干菌存活率的關(guān)系Fig.5 The relationship between the droplet temperature and the survival rate of L.plantarum during single droplet drying.

干燥過(guò)程中液滴溫度與植物乳桿菌存活率關(guān)系如圖5所示。由圖5a觀察到，含LMP的樣品在液滴溫度達(dá)到70℃后植物乳桿菌菌活開始大幅度下降。這與Chen X D等[24]研究發(fā)現(xiàn)噴霧干燥過(guò)程中益生菌在65℃開始大量死亡的結(jié)果相一致。而HMP液滴中植物乳桿菌菌活在液滴溫度80℃左右才出現(xiàn)顯著下降。在110℃干燥條件下（圖5b），由于外界溫度的升高，液滴的干燥歷程更加復(fù)雜化[20]。與90℃干燥條件相比，110℃條件下影響植物乳桿菌菌活的因素多。雖然圖5b中觀察到液滴溫度對(duì)植物乳桿菌菌活的影響差異變小，但在所有樣品的液滴溫度達(dá)到100℃后，仍能觀察到當(dāng)植物乳桿菌的活菌濃度相同時(shí)，HMP的液滴溫度始終低于LMP液滴。

2.3 掃描電子顯微鏡觀察

圖6顯示植物乳干菌菌懸液?jiǎn)我旱胃稍? min后的2 000倍掃描電鏡下表面形態(tài)結(jié)構(gòu)?？梢钥闯觯瑯悠繁砻骐m未有游離的植物乳桿菌，但均出現(xiàn)微孔。出現(xiàn)這種現(xiàn)象主要是液滴在干燥過(guò)程中快速失水所致。其中圖6b和圖6d的干燥顆粒表面有突起，可能是由于DE值越低的糖漿在溫度升高時(shí)黏性越容易降低，從而導(dǎo)致分子間內(nèi)聚力變小，液滴在接觸到熱氣流時(shí)油脂較容易轉(zhuǎn)移到液滴表面[26]。由此推斷，糖漿的DE值越高越利于表面結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。同樣可以解釋圖2b及圖3b中以DE18糖漿為壁材的樣品在干燥后期質(zhì)量下降速率比DE25快，這是由于液滴表面結(jié)構(gòu)越不穩(wěn)定，水分蒸發(fā)速率越快。

圖6 干燥5m in后單液滴顆粒掃描電鏡圖Fig.6 SEM pictures of the droplets of L.plantarum suspension after 5min dried

2.4 乳狀液熱穩(wěn)定性質(zhì)分析

表2列出4種乳狀液的融化焓（△H）及在兩種干燥條件下與其對(duì)應(yīng)的植物乳桿菌的存活率關(guān)系。△H是乳液中結(jié)晶態(tài)棕櫚油在融化時(shí)需要的能量。當(dāng)乳狀液用高熔點(diǎn)油脂作芯材時(shí)，溫度升高，會(huì)在其融點(diǎn)附近出現(xiàn)顯著的吸熱峰[27-28]。由表2可以看出HMP的△H明顯高于LMP（P＜0.05）。干燥過(guò)程中當(dāng)液滴溫度達(dá)到結(jié)晶態(tài)棕櫚油融化溫度時(shí)能夠吸收部分熱，并且棕櫚油的熔點(diǎn)越高吸收的熱越多。植物乳桿菌經(jīng)棕櫚油和糖漿包埋后，在干燥過(guò)程中不同熔點(diǎn)的棕櫚油會(huì)吸收部分熱，降低其周圍溫度，使得植物乳桿菌熱損傷降低，菌活提高。由表2可知，在90℃及110℃的干燥條件下植物乳桿菌的存活率隨著棕櫚油熔點(diǎn)的增大而增高，并與其相對(duì)應(yīng)的△H之間呈正相關(guān)。Liu H等[29]研究結(jié)果與本試驗(yàn)結(jié)果一致，并且提出油脂在干燥過(guò)程中發(fā)生相變。在噴霧干燥試驗(yàn)中，干燥速率過(guò)快，因脫水導(dǎo)致的細(xì)菌細(xì)胞失活可忽略不計(jì)，故熱損傷是細(xì)菌細(xì)胞的主要失活機(jī)制[30-31]。

表2 不同DE值糖漿與不同熔點(diǎn)棕櫚油的乳狀液融化焓及植物乳干菌存活率Table2 Melting enthalpy（△H）of emulsions of syrup with different DE and palm oil with different melting points and the survival rate of L.plantarum

3 結(jié)論

本試驗(yàn)主要采用單液滴干燥技術(shù)模擬噴霧干燥條件，利用不同DE值糖漿和不同熔點(diǎn)棕櫚油包埋植物乳酸菌，研究在90℃及110℃的干燥條件下植物乳干菌的存活率情況。其中，含HMP的液滴菌活在兩種溫度干燥條件后期均明顯高于含LMP的樣品。相對(duì)于不同熔點(diǎn)棕櫚油而言，不同DE值糖漿對(duì)植物乳干菌的菌活無(wú)顯著影響。通過(guò)SEM觀察到干燥顆粒表面均無(wú)游離植物乳干菌，結(jié)合液滴的質(zhì)量變化推斷糖漿DE值越高越利于液滴干燥后表面結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。根據(jù)對(duì)液滴的干燥參數(shù)及乳狀液的熱穩(wěn)定性質(zhì)的分析，推斷出液滴的溫度是影響植物乳干菌菌活的主要因素。與LMP相比，干燥過(guò)程HMP可以吸收更多的熱使植物乳干菌受到的熱損傷低。