青梅組分抗食源性致病菌活性分析

宋 爽 王興娜 高志紅*

（1 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院 南京210095

2 江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所 南京210014）

青梅（Prunusmume Sieb.Et Zucc）為薔薇科植物。我國是青梅的原產(chǎn)地，也是世界上適合生長(zhǎng)青梅地域最廣的國家[1]。青梅果具有很高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，可以制成咸水梅、梅胚、果醬、果醋、果酒等產(chǎn)品[2-5]。青梅果還具有很高的藥用價(jià)值。據(jù)報(bào)道，青梅具有抑菌[6]、抗腫瘤、驅(qū)蟲、解毒、抗氧化[7-8]、抗骨質(zhì)疏松[8]、抑制黑色素生成[9]、抗疲勞、抗過敏等生理作用。在我國傳統(tǒng)醫(yī)藥中，青梅的炮制品烏梅被國家衛(wèi)生部正式列為藥、食兩用制品[10]。

由于青梅酸度很高，所以不能用于鮮食，限制了青梅產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。為促進(jìn)青梅加工業(yè)的發(fā)展，必須研究其活性部位和成分，以便于深加工。目前有大量研究表明，青梅炮制品烏梅具有很好的抗菌活性，能夠抑制30多種細(xì)菌，其中包括金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、假單胞菌、熒光假單胞菌、李斯特菌、沙門氏菌、變形桿菌、蠟樣芽胞桿菌等食源性致病菌[11-16]。此外，青梅果汁對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌[17]、副溶血性弧菌[18]、鼠傷寒沙門桿菌[19]也有顯著的抑制作用。目前深入研究青梅的抗菌活性部位、組分、成分的文章較少。本文對(duì)青梅的抗菌活性組分和成分進(jìn)行了初步研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

青梅新鮮果實(shí)，采自國家果梅種質(zhì)資源圃（南京），品種為大葉青；供試菌種為甘油冷凍保存的腸沙門氏菌（Salmonella enterica，簡(jiǎn)寫S.enterica）、單增李斯特菌（Listeria monocytogenes，簡(jiǎn)寫L.monocytogenes）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，簡(jiǎn)寫S.aureus）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis，簡(jiǎn)寫B(tài).subtilis）、大腸桿菌（Escherichia coli，簡(jiǎn)寫E.coli），中國工業(yè)微生物菌種保存管理中心。營(yíng)養(yǎng)肉湯（Nutrient Broth，NB）、瓊脂粉，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司。二甲亞砜、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇均為國產(chǎn)分析純級(jí)，中國國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；甲醇、醋酸為色譜純級(jí)，美國sigma公司。

1.2 設(shè)備與儀器

立式壓力蒸汽滅菌鍋（LDZX-50KBS），上海申安醫(yī)療器械廠；數(shù)顯電熱培養(yǎng)箱（HPX-9162MBE），上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；桌上式潔凈工作臺(tái)（HD-650型），蘇州凈化設(shè)備有限公司；高效液相色譜及質(zhì)譜聯(lián)用儀（Agilent1100 LC/MSD VL），美國安捷倫公司；電子天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；pH計(jì)，上海康儀儀器有限公司；8道移液槍，寧波群安實(shí)業(yè)有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 青梅不同組分的制備 將新鮮青梅果實(shí)于75%乙醇中浸泡一段時(shí)間，將浸出液濃縮后加蒸餾水充分混勻，依次用氯仿、乙酸乙酯、正丁醇分別萃取3次，分別得氯仿（組分1）、乙酸乙酯（組分2）、正丁醇（組分3）、水液（組分4）及原液（組分5）5個(gè)組分。取青梅組分1，2，3，4，5各0.5 g，溶于4.5mL的85%二甲亞砜溶液，即樣品1～5質(zhì)量濃度為111.1 g/L的溶液。

1.3.2 菌懸液的制備 取以甘油冷凍保存的腸沙門氏菌腸亞種、單增李斯特菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌的菌種保藏液各100μL于50 mL滅菌后的NB液體培養(yǎng)基中活化，于37℃下培養(yǎng)24 h，得菌懸液，備用。使用時(shí)將其稀釋到106～107。

1.3.3 打孔法測(cè)定抑菌圈 取備用的NB固體培養(yǎng)基融化后倒入一次性培養(yǎng)皿中，待冷卻凝固后，每皿各取備用的菌懸液50μL，以滅菌后的涂布棒均勻涂布，用經(jīng)滅菌的打孔器在培養(yǎng)基上打孔，直徑為6mm。將其中的瓊脂塊取出，每個(gè)孔在酒精燈火焰下烤10 s，封底。此過程時(shí)間不能過長(zhǎng)，以免過熱融化培養(yǎng)基而產(chǎn)生過多冷凝水。之后，在每孔內(nèi)注入待檢組分溶液100μL，同時(shí)每皿設(shè)置一個(gè)溶劑對(duì)照，即85%二甲亞砜溶液，每處理重復(fù)3次，放入恒溫培養(yǎng)箱中，于37℃下培養(yǎng)24 h，拍照，以直尺測(cè)量抑菌圈直徑，采用十字交叉法測(cè)量，同一抑菌圈取橫、豎兩個(gè)值的均值記錄為數(shù)據(jù)。

1.3.4 二倍梯度稀釋法測(cè)定最小抑菌濃度 將96孔板孔中分別加入腸沙門氏菌腸亞種、單增李斯特菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌及金黃色葡萄球菌菌懸液各100μL，第1行加樣液各100μL，用85%二甲亞砜溶液作為對(duì)照，每個(gè)處理重復(fù)3次。用移液槍吹打混勻第1行的樣液與菌液，吸取100μL，加入第2行中吹打混勻，再吸取100μL加入第3行。以此類推，當(dāng)?shù)?行吹打混勻后，吸取100μL棄去。至此，可形成8個(gè)梯度的樣液濃度。將96孔板置于恒溫培養(yǎng)箱中，于37℃下培養(yǎng)24 h后，觀察每個(gè)孔中是否產(chǎn)生渾濁，記錄。以肉眼觀察沒有渾濁的最高稀釋倍數(shù)所對(duì)應(yīng)的樣液濃度值為該樣品對(duì)于該菌種的最小抑菌濃度。

1.3.5 LC-MS分析 將青梅組分1～5進(jìn)行LCMS分析，用1%醋酸-甲醇溶液（D）梯度洗脫，洗脫程序見表1。色譜柱：安捷倫Eclipse XDB-C18柱（4.6mm×250mm，5μm），流速0.6mL/min，控制柱溫35℃，采用DAD檢測(cè)器。質(zhì)譜條件：電噴霧離子源（ESI），控制霧化氣（N2）氣壓為206 850 Pa；干燥氣（N2）流量為9 L/min；毛細(xì)管溫度350℃，毛細(xì)管電壓3.0 kV，采用負(fù)離子模式檢測(cè)，質(zhì)譜測(cè)定范圍m/z 100～1 000。

表1 LC-MS分析梯度洗脫溶劑變化Table1 Changes of solvents in gradient elution by LC-MS

2 結(jié)果與分析

2.1 青梅不同極性組分抑菌活性

根據(jù)表2不同組分對(duì)同一種菌抑菌活性方差分析，組分1～5對(duì)大腸桿菌的抑菌活性，從高到低為組分2＞組分4、5＞組分1＞組分3＞對(duì)照；對(duì)枯草芽孢桿菌的抑菌活性，從高到低為組分2＞組分1、3、5＞組分4＞對(duì)照；對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌活性，從高到低為組分2、5＞組分4＞組分1＞組分3＞對(duì)照；對(duì)腸沙門氏菌腸亞種抑菌活性，從高到低為組分1、組分2＞組分3＞組分5＞組分4＞對(duì)照；對(duì)單增李斯特菌抑菌活性，從高到低為組分2＞組分1、3＞組分5＞組分4＞對(duì)照。

根據(jù)表3同一種處理對(duì)不同菌抑菌活性的方差分析，組分1對(duì)大腸桿菌等5種細(xì)菌的抑菌活性從高到底為：大腸桿菌、腸沙門氏菌＞金黃色葡萄球菌＞單增李斯特菌＞枯草芽孢桿菌；組分2對(duì)大腸桿菌等5種細(xì)菌的抑菌活性從高到底為：大腸桿菌＞腸沙門氏菌＞單增李斯特菌＞金黃色葡萄球菌＞枯草芽孢桿菌；組分3對(duì)大腸桿菌等5種細(xì)菌的抑菌活性從高到底為大腸桿菌、腸沙門氏菌、單增李斯特菌＞金黃色葡萄球菌＞枯草芽孢桿菌；組分4對(duì)大腸桿菌等5種細(xì)菌的抑菌活性從高到底為大腸桿菌＞金黃色葡萄球菌＞枯草芽孢桿菌＞腸沙門氏菌、單增李斯特菌；組分5對(duì)大腸桿菌等5種細(xì)菌的抑菌活性從高到底為大腸桿菌＞金黃色葡萄球菌＞單增李斯特菌＞腸沙門氏菌＞枯草芽孢桿菌。

由以上數(shù)據(jù)可見，組分2對(duì)5種食源性致病菌的抑制效果最好。

表2 不同組分對(duì)同一種菌抑菌圈直徑方差分析（單位：mm）Table2 Inhibitory zone diameters'SPSS analysis of various extracts against one bacteria（unit：mm）

表3 同一組分對(duì)不同細(xì)菌抑菌圈直徑方差分析（單位：mm）Table3 Inhibitory zone diameters’SPSS analysis of one extract against various bacteria（unit：mm）

2.2 最小抑菌濃度

由最小抑菌濃度測(cè)定結(jié)果可知，組分2對(duì)大腸桿菌、枯草芽胞桿菌、金黃色葡萄球菌、李斯特菌、沙門氏菌的抑制效果最好。組分3對(duì)沙門氏菌的抑制效果最好，組分2次之。

總體而言，組分2對(duì)5種菌的抑制效果最好。

表4 青梅組分1～5的最小抑菌濃度（g·L-1 ）Table4 Minimal inhibitory concentrations of components 1-5（g·L-1 ）

2.3 乙酸乙酯組分LC-MS分析

對(duì)乙酸乙酯（組分2）進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，在波長(zhǎng)320 nm處共有12個(gè)主要峰。質(zhì)譜結(jié)果：組分2中互為同分異構(gòu)體的成分多，其中相對(duì)分子質(zhì)量為354的有3個(gè)峰，相對(duì)分子質(zhì)量為368的有4個(gè)峰，相對(duì)分子質(zhì)量為336的有3個(gè)峰。參考已分離得到的化合物，推測(cè)峰1～12分別為表5所示化合物。

圖1 波長(zhǎng)320nm處青梅乙酸乙酯組分的液相圖譜Fig.1 HPLC spectra of ethyl acetate component at320nm

圖2 峰1～12質(zhì)譜圖Fig.2 MS spectra of Peak 1-12

液-質(zhì)譜聯(lián)用測(cè)定結(jié)果表明，乙酸乙酯萃取相中的化合物大多是咖啡酰莽草酸及其衍生物，相對(duì)分子質(zhì)量分別為336，354，368，382，相對(duì)分子質(zhì)量之間相差14，18，都是由阿魏酸/咖啡酸與奎尼酸/莽草酸（見圖3）?；纬?，是植物體在有氧呼吸過程中經(jīng)莽草酸途徑產(chǎn)生的一類苯丙素類化合物。分子質(zhì)量之間的差異是由于阿魏酸/咖啡酸之間相差14，奎尼酸/莽草酸之間相差18引起的。

表5 青梅乙酸乙酯萃取物中的化合物Table5 Compounds in ethyl acetate extractant of Prunus mume

圖3 阿魏酸、咖啡酸、奎尼酸、莽草酸結(jié)構(gòu)圖Fig.3 Structures of ferulic acid，caffeic acid，quinic acid and shikimic acid

Zhang等[21]從青梅中分離得到一個(gè)相對(duì)分子質(zhì)量為336的化合物，即3-O-咖啡酰莽草酸，而在液-質(zhì)譜聯(lián)用圖譜上顯示相對(duì)分子質(zhì)量為336的化合物有3個(gè)。這是因?yàn)榭Х弱ＣР菟峄衔镏锌Х人岬?個(gè)羥基都易與莽草酸形成酯鍵，而且3個(gè)同分異構(gòu)體（峰7，8，10）極性相似，所以推測(cè)另兩個(gè)相對(duì)分子質(zhì)量為336的化合物為4-O-咖啡酰莽草酸和5-O-咖啡酰莽草酸。

Xia[6]和Shi等[24]從青梅的花和種子里都分離到相對(duì)分子質(zhì)量為354的3-O-咖啡?？崴帷?-O-咖啡?？崴帷?-O-咖啡?？崴?。Yan等[8]從果實(shí)中分離得到3-O-咖啡酰奎尼酸甲酯、4-O-咖啡?？崴峒柞?、5-O-咖啡酰奎尼酸甲酯。相對(duì)分子質(zhì)量為354的同分異構(gòu)體一般認(rèn)為是3-O-咖啡?？崴帷?-O-咖啡?？崴?、5-O-咖啡?？崴?。

從青梅中分離到5個(gè)相對(duì)分子質(zhì)量為368的化合物[21]，分別為3-O-阿魏?？崴?、5-O-阿魏?？崴帷?-O-咖啡?？崴峒柞ァ?-O-咖啡酰奎尼酸甲酯、5-O-咖啡酰奎尼酸甲酯。由于液相和質(zhì)譜圖譜顯示，相對(duì)分子質(zhì)量368的峰分別對(duì)應(yīng)4，6，9，12峰，因4，6峰極性相近，9，12峰極性相近，故推測(cè)4，6峰是極性較大的3-O-阿魏?？崴?、5-O-阿魏?？崴幔?、12峰是極性較小的3-O-咖啡?？崴峒柞?、4-O-咖啡?？崴峒柞?、5-O-咖啡?？崴峒柞ブ械膬蓚€(gè)，至于是哪兩個(gè)，有待進(jìn)一步表征。

3 討論

經(jīng)LC-MS分析乙酸乙酯組分，除一個(gè)小分子脂肪酸（辛酸）外，大部分化合物屬于咖啡酰莽草酸類化合物。由于阿魏酸/咖啡酸的羧基與奎尼酸/莽草酸脂環(huán)上3個(gè)羥基都容易?；?，因而同分異構(gòu)體特別豐富。由于阿魏酸/咖啡酸上的羧基也比較活潑，在環(huán)境中容易與活潑的醇類化合物形成甲酯/乙酯等酯類化合物，所以導(dǎo)致該類化合物的衍生物非常多。這在青梅乙酸乙酯萃取物中得到充分的體現(xiàn)。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，青梅乙醇提取物具有較好的抗食源性致病菌活性，其中萃取的乙酸乙酯組分抗菌活性比乙醇提取液活性強(qiáng)?？Х弱ＣР菟犷惢衔锸乔嗝芬宜嵋阴ポ腿∥镏械奶卣鞒煞?。提示咖啡酰莽草酸類化合物可能具有較好的抗菌活性，此有待于進(jìn)一步的驗(yàn)證。