高速逆流色譜分離純化裂壺藻油脂中的DHA

吳兵兵 榮 輝 楊賢慶 陳勝軍 吳燕燕 鄧建朝 胡 曉

（1 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所 國家水產(chǎn)品加工技術(shù)研發(fā)中心農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)品加工重點實驗室 廣州510300

2 上海海洋大學(xué)食品學(xué)院 上海201306）

二十二碳六烯酸（docosahexenoic acid，DHA），俗稱腦黃金，是ω-3系長鏈多不飽和脂肪酸，是人體大腦的重要組成部分，對于神經(jīng)系統(tǒng)具有重要功能[1-2]。1972年英國Michel[3]教授提出，缺乏DHA等多不飽和脂肪酸，將會造成大腦發(fā)育的障礙。有研究表明，DHA可以促進嬰幼兒視力以及腦細胞的發(fā)育，顯著提高嬰幼兒的智力發(fā)育水平，提高青少年記憶力[4-6]。此外，DHA對成年人也具有重要的保健作用。它能夠降血壓、降血脂、降膽固醇，延緩衰老，同時在預(yù)防老年癡呆、抗癌、抑制腫瘤、抗炎癥等方面也有明顯的作用[7-9]。DHA相關(guān)研究越來越受到人們的關(guān)注。目前DHA的來源主要是魚油和微藻油。天然魚油中DHA以甘油三酯形式存在，由于含量偏低，約12%，因此工業(yè)上大多采用轉(zhuǎn)酯化的方法將魚油轉(zhuǎn)酯化成魚油乙酯以豐富魚油中DHA的含量[10-11]。另外，魚油通常具有較難去除的魚腥味，使一些人不愛食用。目前作為生產(chǎn)DHA原料的藻種有隱甲藻、裂壺藻等。這些天然微藻中DHA也是以甘油三酯的形式存在，含量較高，其中裂壺藻DHA含量高達40%以上[12]。微藻油沒有腥味，部分微藻中脂肪酸組成較為簡單，有利于DHA的進一步分離純化。相關(guān)產(chǎn)油微藻的篩選及培養(yǎng)、油脂提取以及微藻油的分離純化成為人們的研究熱點[13-14]。

美國Ito教授在上世紀八十年代初發(fā)明了高速逆流色譜（High-speed countercurrent chromatography，HSCCC）[15-16]，很快便被廣泛應(yīng)用在生物化學(xué)、醫(yī)藥學(xué)、食品、地質(zhì)、環(huán)境、農(nóng)業(yè)、材料、化工、海洋生物等眾多領(lǐng)域。HSCCC采用的固定相和流動相均為液體，沒有不可逆吸附，物質(zhì)的分離是依據(jù)其在互不相溶的兩相液體中的分配系數(shù)的差異而實現(xiàn)，具有分離純度高，樣品回收率高，適用范圍廣等優(yōu)點[17]。近年來隨著儀器、設(shè)備的不斷改進和完善，相關(guān)研究的不斷深入，HSCCC被應(yīng)用到大分子物質(zhì)的分離純化中，如蛋白質(zhì)、脂肪酸、色素等[18-19]。Cao等[20]利用HSCCC對葡萄籽中的油脂成分進行分離，最終得到純度達99%的亞油酸；孫磊等[21]利用HSCCC技術(shù)對共軛亞油酸（CLA）及其異構(gòu)體進行分離，采用的溶劑系統(tǒng)為正己烷-乙腈（1∶1，V/V），最終得到的共軛亞油酸的比例分別高達97.05%和97.73%。由此可見，利用HSCCC可對脂肪酸進行分離純化。本研究利用HSCCC分離純化裂壺藻中DHA，為其的進一步開發(fā)利用提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料和設(shè)備

裂壺藻：由本實驗室利用松花粉垂釣法對采自廣州南沙紅樹林腐爛樹葉進行分離純化獲得，經(jīng)鑒定為裂壺藻，保存于本實驗室藻種庫中。

正庚烷、甲醇、乙酸乙酯、乙醚、硫酸、甲酸均為分析純級，乙腈為色譜純級，廣州華嶼欣實驗器材有限公司；DHA標(biāo)準(zhǔn)品，美國Nu-chekperp有限公司；所用水均為超純水。

TBE-300B高速逆流色譜儀，上海同田生物技術(shù)有限公司；LC-20AD高效液相色譜儀，日本島津公司；GCMS-QP2010 Plus氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，日本島津公司；UV1000紫外-可見光檢測器，上海三為科學(xué)儀器有限公司；HWS-24電熱恒溫水浴鍋，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；EYELAN-1000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，日本EYELA有限公司；SQ510C立式壓力蒸汽滅菌器，日本YAMATO公司；ZQTY-70F臺式全溫震蕩培養(yǎng)箱，上海知楚儀器有限公司；Avanti J-26XP高效離心機，貝克曼庫爾特有限公司；SW-CJ-1FD超凈工作臺，蘇州凈化設(shè)備有限公司；Alpha1-4冷凍干燥機，德國Christ有限公司；DC-0506低溫恒溫水槽，南京舜瑪儀器有限公司。

1.2 裂壺藻的培養(yǎng)和收集

培養(yǎng)基（1L）：葡萄糖25 g，酵母提取物5 g，細菌學(xué)蛋白胨10 g，海水晶30 g。

培養(yǎng)條件：溫度28℃，轉(zhuǎn)速180 r/min，培養(yǎng)時間96 h，pH 6.8。

將培養(yǎng)液在8 000 r/min，溫度4℃的條件下離心10min，收集底部藻泥，在-20℃條件下預(yù)凍12 h，然后利用冷凍干燥機在-45℃條件下處理24 h，得到裂壺藻藻粉。

1.3 微藻油的提取和皂化處理

稱量5 g裂壺藻干藻粉，采用氯仿-甲醇法[22]提取油脂。

稱量500mg裂壺藻油，加入25mL 0.5mol/L氫氧化鉀-甲醇溶液在70℃下水浴處理1.5 h，用體積分數(shù)為20%的硫酸水溶液調(diào)pH值至3，得到酸性混合液[23]。用等體積的乙醚萃取酸性混合液3次，收集乙醚相，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙醚，用20mL兩相溶劑（上、下相比例為1∶1）溶解得到脂肪酸粗品，待HSCCC分離。同時取少量脂肪酸粗品進行HPLC分析。

1.4 HSCCC溶劑體系的選擇

應(yīng)用HPLC測定目標(biāo)組分DHA在兩相溶劑體系中的分配系數(shù)K值，根據(jù)K值來選擇合適的溶劑體系。將DHA標(biāo)準(zhǔn)品溶解在兩相溶劑體系中，取上相和下相分別進行HPLC檢測。以上相中DHA峰面積與下相中DHA峰面積比計算K值。待測溶劑體系為正庚烷-乙酸乙酯-甲醇-水（5∶1∶5∶1，8∶1∶8∶1，10∶1∶10∶1，12∶1∶12∶1，15∶1∶15∶1，V/V/V/V），正庚烷-甲醇-水（5∶3∶1，5∶4∶1，5∶5∶1，5∶6∶1，5∶7∶1，V/V/V）。

1.5 HSCCC分離純化DHA

以10mL/min速度將上相泵入螺線管，充滿后，將螺線管的轉(zhuǎn)速調(diào)到正轉(zhuǎn)900 r/min，以2mL/min泵入下相，平衡后，取少量DHA標(biāo)準(zhǔn)品溶于溶劑體系中作為樣品，經(jīng)進樣閥注入螺線管，采用紫外檢測器在210 nm處檢測，確定DHA的出峰時間。參考1.3節(jié)對油脂進行皂化處理。在一定的參數(shù)條件下利用HSCCC進行分離，將與DHA標(biāo)準(zhǔn)品出峰時間一致的峰所對應(yīng)的物質(zhì)收集后進行HPLC檢測，確定其純度和回收率。隨后，將收集的樣品利用HSCCC進行二次分離，進一步提高其純度。收集后利用HPLC檢測確定其純度和回收率。

1.6 單因素條件對DHA純度的影響

通過單因素試驗考察各因素（固定水平溫度15℃、流速3mL/min、轉(zhuǎn)速900 r/min、進樣量180 mg）對DHA純度的影響。各因素設(shè)置為：溫度：5，10，15，20，25℃；流速：2，2.5，3，3.5，4mL/min；轉(zhuǎn)速：800，850，900，950，1 000 r/min；進樣量：36，108，180，252，360mg。通過外接低溫恒溫水槽控制溫度。研究某一單因素時，其余因素均取固定水平值，以HPLC檢測收集DHA的純度作為試驗指標(biāo)。

1.7 HSCCC分離條件的響應(yīng)面分析

根據(jù)Box-Benhnken的中心組合試驗原理[24]，采用響應(yīng)面法在三因子三水平上對裂壺藻油中DHA的HSCCC分離純化條件進行優(yōu)化，試驗因子和水平見表1。

1.8 HPLC檢測分析

收集分離純化后的DHA樣品進行HPLC檢測，采用面積歸一法確定其純度。HPLC色譜柱為Athena C18-WP，100A（4.6mm×250 mm）分析色譜柱，流動相A為超純水（含0.05%的甲酸），流動相B為乙腈。洗脫方法為先用50%乙腈梯度洗脫20min至l00%，再用100%乙腈洗l5min。溫度35℃，紫外檢測波長210 nm，進樣量20μL，流速1 mL/min。

1.9 脂肪酸的GC-MS分析

GC條件：DB-5MS色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25μm）；進樣口溫度230℃；升溫程序：110℃保持4min，以10℃/min升溫到160℃，保持1min，最后以5℃/min升到240℃，保持15min；載氣為氦氣，流量為1.52mL/min；采用恒線速度，分流比為1∶30；進樣量1μL。

MS條件[25]：離子源溫度200℃；電子能量70 eV；質(zhì)量掃描范圍m/z 40～550；溶劑延長時間3 min。

1.10 回收率的測定

以DHA標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)定脂肪酸粗品中的DHA含量，計算HSCCC分離得到的DHA的回收率[26]。

式中，Sn——脂肪酸粗品液相中DHA的峰面積（mAU）；Se——DHA標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積（mAU）；Ce——DHA標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)液相的進樣質(zhì)量濃度（μg/mL）；Cn——脂肪酸粗品對應(yīng)液相的進樣質(zhì)量濃度（μg/mL）；SS——經(jīng)HSCCC分離純化的DHA樣品對應(yīng)液相的DHA的峰面積（mAU）；CS——經(jīng)HSCCC分離純化的DHA樣品的質(zhì)量濃度（μg/mL）；VS——HSCCC分離所得DHA樣品的體積（mL）；Vn——一次進樣的脂肪酸粗品體積（mL）；Pn——DHA的回收率（%）。

1.11 數(shù)據(jù)處理

每組試驗做3次，數(shù)據(jù)以平均值表示。用Excel 2010軟件繪制表格，響應(yīng)面實驗設(shè)計及分析用Design Expert 8.0.6軟件。

2 結(jié)果與討論

2.1 裂壺藻的收集及藻油的提取和皂化

將裂壺藻培養(yǎng)96 h后，離心，收集底部藻泥，真空冷凍干燥后獲藻粉200 g。采用氯仿-甲醇法提取油脂，由5 g裂壺藻粉提取的油脂量為2.08 g，含油率為41.7%。所提油脂經(jīng)皂化后進行HPLC分析，結(jié)果見圖1。與DHA標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC圖譜進行對比，確定保留時間為17.29 min的峰是DHA峰。將1 000mg微藻油經(jīng)皂化處理除乙醚，得到脂肪酸粗品，約180mg。

圖1 脂肪酸粗品的HPLC分析圖Fig.1 HPLC spectrum of fatty acids extracts

2.2 HSCCC溶劑體系的選擇

由于脂肪酸極性較弱，因此選擇正庚烷-水這一弱極性基本溶劑體系。同時在上、下兩相中加入極性位于正庚烷和水之間的惰性溶劑來調(diào)節(jié)溶劑系統(tǒng)的極性。參考曹學(xué)麗[20]和Bousquet[27]的方法，選擇的兩相溶劑體系為正庚烷-乙酸乙酯-甲醇-水和正庚烷-甲醇-水，測定不同體積比下的K值，見表2。有研究表明K值合適的范圍為0.5～2[27]。選擇正庚烷-乙酸乙酯-甲醇-水（體積比15∶1∶15∶1）為第1步HSCCC的兩相溶劑體系，K值為0.84；正庚烷-甲醇-水（5∶6∶1，體積比）為第2步HSCCC的兩相溶劑體系，K值為0.88。

在HSCCC溶劑體系中，固定相的保留率一般應(yīng)大于50%[28]。本研究第1步HSCCC兩相溶劑體系的保留率為71.43%，第2步HSCCC兩相溶劑體系的保留率為66.07%，均符合要求。

表2 DHA在不同體積比溶劑體系的K值Table2 The K values of DHA in different solvent systems

2.3 單因素試驗結(jié)果及分析

2.3.1 溫度對DHA純度的影響 溫度對DHA純度的影響見圖2。當(dāng)溫度小于15℃時，隨著溫度的升高，分離所得DHA純度不斷增高，隨后再升高溫度，DHA純度下降。這是因為對于HSCCC來說，分離溫度越高，固定相保留率越高，分離效果越好，而分離溫度過高時，導(dǎo)致溶劑的黏度降低，使分離效果變差。選擇合適溫度15℃。

2.3.2 流速對DHA純度的影響 圖3顯示流速對DHA純度的影響。當(dāng)流速在2～3mL/min范圍逐漸遞增時，分離所得DHA純度提高，隨后繼續(xù)增大流速，DHA純度降低。這是因為流速低，固定相保留率高，有利于分離，出峰時波動較小，而當(dāng)流速過低時，使目標(biāo)物質(zhì)的洗脫時間長，導(dǎo)致流動相的消耗量增大。當(dāng)流速高時，固定相的保留率降低，不利于分離，而分離時間縮短，減弱峰的擴散作用，因此也可能實現(xiàn)目標(biāo)物質(zhì)的分離。綜合實驗結(jié)果等選擇合適的流速為3mL/min。

圖2 溫度對DHA純度的影響Fig.2 Effect of temperature on the purity of docosahexenoic acid

圖3 流速對DHA純度的影響Fig.3 Effect of flow velocity on the purity of docosahexenoic acid

2.3.3 轉(zhuǎn)速對DHA純度的影響 轉(zhuǎn)速對DHA純度的影響如圖4所示。當(dāng)轉(zhuǎn)速在800～900 r/min范圍逐漸升高時，分離所得DHA純度提高；隨后再提高轉(zhuǎn)速，DHA純度降低。這是因為轉(zhuǎn)速越高，固定相保留率越高，分離效果越好。然而轉(zhuǎn)速過高時，使儀器損耗較大，從而影響分離效果。選擇合適轉(zhuǎn)速900 r/min。

2.3.4 進樣量對DHA純度的影響 取一定量的裂壺藻油脂按1.3節(jié)方法進行皂化處理。分別稱取36，108，180，252，360 mg的脂肪酸粗品用20 mL溶劑體系溶解得到一定濃度脂肪酸粗品，然后利用HSCCC進行DHA的分離純化。進樣量與分離所得DHA純度關(guān)系如圖5所示。進樣量與分離所得DHA純度的關(guān)系不顯著。當(dāng)進樣量低于108 mg，即皂化油脂量小于300mg時，紫外檢測器的響應(yīng)值較低，峰高較小，峰較為平滑；當(dāng)進樣量大于360mg，即皂化油脂量大于1 000mg時，紫外檢測器響應(yīng)值較高，峰高較大，超出紫外檢測器的檢測范圍，峰尖出現(xiàn)水平線。為了便于后續(xù)相關(guān)試驗，選擇進樣量為180mg，即500mg油脂皂化后溶于20mL溶劑體系中進行相關(guān)試驗。

圖4 轉(zhuǎn)速對DHA純度的影響Fig.4 Effect of revolution speed on the purity of docosahexenoic acid

圖5 進樣量對DHA純度的影響Fig.5 Effect of sample size on the purity of docosahexenoic acid

2.4 響應(yīng)面分析

2.4.1 響應(yīng)面試驗結(jié)果 依據(jù)Box-Benhnken中心組合試驗原理，以溫度、流速、轉(zhuǎn)速為自變量，DHA的純度為因變量，進行響應(yīng)面試驗，所得結(jié)果見表3。

表3 響應(yīng)面分析試驗結(jié)果Table3 Experiment results of response surface methodology

2.4.2 回歸方程及參數(shù)分析 利用Design Expert 8.0.6對表2數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合分析，得到二次回歸模型：Y=89.22-2.86A+1.82B+2.43C-1.64AB+2.75AC+1.86BC-3.77A2-5.97B2-6.42C2。

回歸與方差分析結(jié)果見表4。模型的P值＜0.0001，表明該回歸模型極顯著；失擬項（P=0.8309＞0.05）不顯著，表明未知因素對試驗結(jié)果的干擾較小。該模型R2=0.9765，R2Adj=0.9464，這表明可以解釋響應(yīng)值DHA純度的變化，模型的擬合程度良好，試驗誤差小，能較好地反映DHA純度與溫度、轉(zhuǎn)速、流速之間的關(guān)系，可用此模型進行分析和預(yù)測。根據(jù)表3中的F值得到各因素對DHA純度的影響排序為A＞C＞B。根據(jù)P值變化可知B2、C2對DHA純度的影響極顯著，AC、BC、A2對DHA純度的影響顯著。

表4 回歸方程方差分析表Table4 Analysis of Regression equation variance table

2.4.3 響應(yīng)面優(yōu)化及分析 一般來說，HSCCC流動相流速越低，轉(zhuǎn)速越高，分離溫度越高，固定相的保留率越高，分離效果越好。然而，轉(zhuǎn)速過高時對儀器的損耗較大，耗能高，影響儀器壽命。低轉(zhuǎn)速雖然可以使固定相的保留率較高，但會使目標(biāo)物質(zhì)的洗脫時間過長，流動相消耗量高。分離溫度過高會使溶液的黏度降低，從而影響分離效果。

用Design-expert 8.0.6對表3數(shù)據(jù)進行二次多元回歸擬合，交互作用顯著的響應(yīng)面圖見圖6～8。對比分析曲線的陡峭及平滑程度，可知，溫度對DHA純度的影響大于流速（圖6）。由圖7可知，溫度對DHA純度的影響大于轉(zhuǎn)速。由圖8可知，轉(zhuǎn)速對DHA純度的影響大于流速，這和方差的分析結(jié)果相符合。

圖6 溫度和流速的交互作用對DHA純度影響的響應(yīng)面圖Fig.6 Response surface plot of interactiion between column temperature and flow velocity

圖7 溫度和轉(zhuǎn)速的交互作用對DHA純度的影響Fig.7 Response surface plot of interactiion between column temperature and flow velocity

圖8 流速和轉(zhuǎn)速的交互作用對DHA純度的影響Fig.8 Response surface plot of interactiion between flow velocity and revolution speed

根據(jù)模型分析，確定HSCCC分離純化DHA的最佳條件為溫度13.1℃、流速3.23mL/min、轉(zhuǎn)速907 r/min，在此條件下DHA純度的預(yù)測值為90.13%。實際條件為：溫度13℃、流速3mL/min、轉(zhuǎn)速910 r/min。

2.5 HSCCC分離純化DHA

2.5.1 第1步HSCCC分離純化DHA 將皂化處理后所得脂肪酸粗品在上述優(yōu)化條件下進行第1步HSCCC分離純化，結(jié)果如圖9所示。通過與DHA標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時間相比對，確定第1個峰為目標(biāo)物DHA。收集DHA組分，進行液相檢測，結(jié)果如圖10所示。通過面積歸一法計算其HPLC純度為90.06%，依據(jù)本文1.9節(jié)方法計算回收率為95.27%。

圖9 第1步HSCCC分離DHA色譜圖Fig.9 Separation profiles of DHA by the first step HSCCC

圖10 第1步HSCCC分離獲得DHA的HPLC色譜圖Fig.10 HPLC analysis of DHA separated by the first step HSCCC

2.5.2 第2步HSCCC分離純化DHA 影響HSCCC分離純化裂壺藻油脂中DHA的主要干擾物質(zhì)為液相圖譜中在23.54min出峰的物質(zhì)。通常情況下目標(biāo)物質(zhì)的分配系數(shù)K值與干擾物質(zhì)的K值的比值α應(yīng)大于1[27]，才能對目標(biāo)物質(zhì)進行較好的分離純化。通過HPLC檢測確定23.54min位置的物質(zhì)在第2步溶劑體系中的K值為2.32。第2步HSCCC分離所得峰1與峰2的K值的比值α=2.64，符合要求。將第1步收集到的DHA樣品用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀去除溶劑，然后用20mL第2步中的溶劑體系（上、下相體積比1∶1）溶解，過濾后進行第2次HSCCC分離，結(jié)果如圖11所示。收集第2個峰組分，進行液相檢測，結(jié)果如圖12所示。通過面積歸一法計算其HPLC純度為99.61%，依據(jù)1.9節(jié)方法計算回收率為93.81%。

2.6 分離獲得DHA的GC-MS分析

將HSCCC分離獲得的高純度DHA樣品進行GC-MS分析，所得質(zhì)譜圖13。利用GC-MS軟件中NIST0.5譜庫數(shù)據(jù)庫進行檢索，通過與標(biāo)準(zhǔn)譜圖比較，確定分離所得物質(zhì)為DHA。

2.7 討論

圖11 第2步利用HSCCC分離DHA色譜圖Fig.11 Separation profiles of DHA by the second step HSCCC

圖12 第2步利用HSCCC分離獲得的DHA的HPLC色譜圖Fig.12 HPLC analysis of DHA separated by the second step HSCCC

圖13 HSCCC分離獲得的DHA的GC-MS圖Fig.13 GC-MS profiles of DHA separated by HSCCC

采用裂壺藻作為DHA的生產(chǎn)原料，是因為裂壺藻油脂的脂肪酸組成較為簡單，DHA含量高。該藻種對環(huán)境要求不高，生長迅速，發(fā)酵后獲得的生物量高。裂壺藻的篩選培養(yǎng)以及發(fā)酵生產(chǎn)的研究較為成熟，均已工業(yè)化生產(chǎn)。呂小義等[29]對裂壺藻的發(fā)酵生產(chǎn)進行了研究，最終獲得藻體濕重達200 g/L，說明裂壺藻是適宜的DHA生產(chǎn)原料。

目前，脂肪酸分離純化方法有溶劑萃取法、低溫結(jié)晶法、尿素包合法、分子蒸餾法、超臨界二氧化碳萃取法、脂肪酶濃縮法等[30-32]。本研究利用HSCCC兩步分離純化DHA。HSCCC分離純化DHA相較于以上的方法具有以下優(yōu)點：操作簡單，可直接進樣，所得DHA純度高，能在線檢測，可直接和質(zhì)譜儀或紅外色譜儀聯(lián)用進行分析，應(yīng)用范圍廣。利用HSCCC分離純化化合物的關(guān)鍵點在于溶劑體系的選擇。張榮勁[33]對HSCCC分離純化天然物質(zhì)進行綜述，按照溶劑體系的極性不同進行分類，對溶劑體系的選擇有一定的指導(dǎo)意義。本研究采用正庚烷-乙酸乙酯-甲醇-水（體積比15∶1∶15∶1）作為第1步HSCCC溶劑體系，采用正庚烷-甲醇-水（體積比5∶6∶1）作為第2步溶劑體系，并用響應(yīng)面分析法優(yōu)化HSCCC分離純化DHA的關(guān)鍵參數(shù)。最終得到DHA純度分別為90.06%，99.61%，回收率分別為95.27%，93.81%。

因氣相色譜檢測需進行甲脂化處理，無法與HSCCC相連進行在線檢測。查閱相關(guān)文獻，因脂肪酸在210 nm處有吸收[34]，故本試驗采用紫外檢測器在210 nm處檢測，樣品無需進行衍生處理，可直接檢測。通過紫外檢測器和HPLC聯(lián)用可以檢測樣品的純度和計算回收率。

3 結(jié)論

兩步HSCCC分離純化裂壺藻油脂中的DHA，經(jīng)篩選，第1步的溶劑體系為正庚烷-乙酸乙酯-甲醇-水（15∶1∶15∶1，V/V/V/V），第2步溶劑體系為正庚烷-甲醇-水（5∶6∶1，V/V/V）。采用單因素試驗和響應(yīng)面分析法對HSCCC分離純化DHA的關(guān)鍵參數(shù)進行優(yōu)化，得到最佳條件為：進樣量180mg、溫度13℃、流速3mL/min、轉(zhuǎn)速910 r/min。在該條件下分離純化所得DHA純度分別為90.06%，99.61%，回收率分別為為95.27%，93.81%。本研究說明利用HSCCC可對DHA進行很好的分離純化，為DHA產(chǎn)品的進一步開發(fā)利用提供支持。