灰樹花中改善脂質(zhì)代謝活性組分的篩選及其提取工藝優(yōu)化

周文斌 洪家麗 李 路 李 燕 黃梓芮 郭偉靈 倪 莉 饒平凡 劉 斌 呂旭聰，3，*

（1 福建農(nóng)林大學食品科學學院 福州350002

2 福建農(nóng)林大學 國家菌草工程技術(shù)研究中心 福州350002

3 福建農(nóng)林大學生命科學學院 福州350002

4 福州大學食品科學技術(shù)研究所 福州350108）

近年來，不良的生活習慣使得肥胖和脂質(zhì)代謝紊亂在人群中的發(fā)生比例越來越高[1]。脂質(zhì)代謝紊亂與高血壓、Ⅱ型糖尿病、缺血性心腦血管疾病等慢性病的發(fā)病緊密相關(guān)[2]，不僅影響生活質(zhì)量，而且會危及生命。雖然目前臨床上有許多降脂藥物被廣泛應用，但長期服用此類藥物會產(chǎn)生依賴性及明顯的副作用。挖掘安全、有效的天然食源性活性物質(zhì)來改善脂質(zhì)代謝紊亂已成為食品營養(yǎng)學領(lǐng)域的研究熱點[3-4]。

灰樹花又名栗子蘑，貝葉多孔菌，蓮花菌，日本稱之為舞茸[5]。其香味濃郁，質(zhì)地脆嫩，口感極佳，營養(yǎng)價值高，人體氨基酸含量高，維生素及礦物質(zhì)含量豐富，在民間有悠久的食用歷史，是一種食、藥兼用的珍稀食用菌[6-7]?；覙浠ㄖ泻写罅康幕钚晕镔|(zhì)，具有抗癌，抑制高血壓，抑制肥胖癥，預防動脈硬化，促進肝功能增強，改善脂質(zhì)代謝等多種生理活性[8-9]。然而，灰樹花中具體是哪些組分具有改善脂質(zhì)代謝作用至今尚未明確。改善脂質(zhì)代謝活性組分的體外篩選方法主要有體外模擬膽汁膠束法、脂肪酶抑制劑篩選法、細胞內(nèi)膽固醇流出法和基于肝臟X受體激活劑的細胞篩選模型等[10-11]。細胞內(nèi)膽固醇流出法和肝臟X受體激活劑這兩種方法均需要進行細胞培養(yǎng)和造模，不僅費時費力，而且生物重現(xiàn)性有待提高。體外模擬膽汁膠束法和脂肪酶抑制劑篩選法具有靈敏可靠、簡單易行、實用性強的優(yōu)點[12]。

本文旨在尋找灰樹花中具有改善脂質(zhì)代謝紊亂的活性組分。采用順序溶劑提取不同極性的灰樹花提取物，然后通過模擬膽汁膠束和脂肪酶抑制兩種體外篩選方法，快速篩選灰樹花中具有改善脂質(zhì)代謝的活性提取物，最后利用單因素以及響應面法進一步優(yōu)化提取工藝[13]，并通過UPLCQTOF-MS/MS方法對灰樹花活性提取物進行組分鑒定[14]。本研究結(jié)果對于灰樹花及其活性產(chǎn)物的應用推廣具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

灰樹花，購于井岡山井祥菌草生態(tài)科技股份有限公司；膽酸鹽，上海源葉生物科技有限公司；總膽汁酸和脂肪酶測試盒，南京建成生物工程研究所（貨號分別為E003、A054）；己烷、氯仿、乙酸乙酯、甲醇、無水乙醇、無水碳酸鈉等，國藥集團化學試劑有限公司，純度為國藥分析純級。

1.2 儀器與設備

紫外-可見分光光度計（UV-1800），上海美譜達儀器有限公司；電子天平（AL204），梅特勒-托利多儀器有限公司；離心機（SL-3612），科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（R201），上海申生科技有限公司；超聲波清洗器（KQ-500VDE），昆山市超聲儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 灰樹花中改善脂質(zhì)代謝活性組分的提取方法 稱取50 g灰樹花粉末，分別用己烷、氯仿、乙酸乙酯、甲醇和去離子水對灰樹花粉末依次進行溶劑提取。加入500mL己烷，在室溫下懸浮振搖（200 r/min）2 h，混合液離心沉淀后，取上清液真空抽濾，殘渣晾干后加入下一個溶劑重復上訴步驟，收集濾液獲得己烷提取物（HE）、氯仿提取物（CE）、乙酸乙酯提取物（EAE）、甲醇提取物（ME）和水提取物（WE）。上述有機提取物經(jīng)真空旋轉(zhuǎn)濃縮，所得濃縮液于37℃烘干至恒重，WE凍干并稱重。HE、CE、EAE用二甲基亞砜（DMSO）溶解，ME、WE用去離子水溶解待測。

稱取50 g灰樹花粉末，利用不同濃度的乙醇溶液提取灰樹花，分別與500 mL乙醇溶液（體積分數(shù)分別為100%，80%，60%，40%，20%，0%）在40℃，400W超聲提取30min，依次獲得100%EE、80%EE、60%EE、40%EE、20%EE、0%EE濾液，真空濃縮至膏狀，凍干并稱重。用二甲基亞砜（DMSO）溶解待測。

1.3.2 模擬膽汁膠束法體外篩選 TBA酶標儀微板測定法：將相應的膽酸鹽溶于生理鹽水中制成濃度為2μmol/mL的膽酸鹽溶液。吸取0.5mL 80 mg/mL的各組分提取物，加入1 mL鹽酸溶液（0.01mol/L）于37℃恒溫振蕩消化1 h，再加入0.1mL氫氧化鈉溶液（0.1mol/L），混勻，加入5mL膽酸鹽溶液（含10mg/mL的胰酶），密封，置于37℃振蕩培養(yǎng)1 h，10 000 r/min離心10min，取上清液待測。

使用總膽汁酸（TBA）測試盒（貨號：E003，酶比色法，南京建成）。按試劑盒說明書操作，配制試劑1應用液（試劑B液倒入試劑A液中，VA液∶VB液=9∶1，混勻），將30μL樣品加入240μL試劑一應用液，混勻，37℃培養(yǎng)3～5min，在波長505 nm處讀取吸光度（A1）。加入60μL試劑2，混勻，37℃培養(yǎng)5min，在波長505 nm處讀取吸光度（A2）。

△A=A2-A1

游離TBA含量C（μmol/L）=△A測定/△A標準×標準品濃度（μmol/L）

結(jié)合率=[10（μmol）-C（μmol/L）×6.6（mL）]/10（μmol）

1.3.3 脂肪酶抑制體外篩選 利用0.1 mol/L KH2PO4-K2HPO4緩沖液（pH7.4）配制0.5 mg/mL胰脂肪酶。采用南京建成的脂肪酶試劑盒，貨號為A054。取底物溶液在37℃預熱5min，加入4mg/mL樣品，立即混勻，10min后加入胰脂肪酶溶液，快速混勻，在波長420 nm處讀取吸光度值A(chǔ)1。將此比色液于37℃水浴10min，在波長420 nm處讀取吸光度值A(chǔ)2。求出2次測定的吸光度的差值（△A1=A1-A2）。

脂肪酶活力（U/L）=△A/As×標準品濃度（454 μmol/L）×反應液體積（205μL）/取樣量（5μL）/反應時間（10min）

抑制率（%）=（1-△A2/△A1）×100

△A1=A1-A2，△A2=A3-A4

式中：A1、A2、A3、A4與As分別為空白組（只有底物）、無抑制劑組（酶和底物）、對照組（抑制劑和底物）、加抑制劑組（酶、底物和抑制劑）和標準品在波長420 nm處的吸光度。

1.3.4 灰樹花乙酸乙酯EAE提取物的提取工藝單因素試驗 取灰樹花粉末按1∶10的料液比加入己烷，室溫懸浮振搖（200 r/min）2 h，混合液經(jīng)真空過濾，殘渣晾干后加入氯仿，重復上述步驟，晾干殘渣備用。

1.3.4.1 料液比對提取物得率的影響 準確稱取上述殘渣，各加入料液比1∶5、1∶10、1∶20、1∶25、1∶50（g/mL）的乙酸乙酯，在400W功率下超聲提取5min，于20℃200 r/min搖床懸浮2 h，將混合物真空抽濾，收集濾液。有機濾液真空濃縮，于37℃烘干至恒重。

1.3.4.2 超聲時間對提取物得率的影響 準確稱取50 g上述殘渣，加入500mL乙酸乙酯，在400 W功率下超聲提取0，10，20，40，60min，于20℃200 r/min搖床懸浮2 h，將混合物真空抽濾，收集濾液。有機濾液真空濃縮，于37℃烘干至恒重。

1.3.4.3 提取溫度對提取物得率的影響 準確稱取50 g上述殘渣，加入500mL乙酸乙酯，在400 W功率下超聲提取5min，分別于20，30，40，50℃200 r/min搖床懸浮2 h，將混合物真空抽濾，收集濾液。有機濾液真空濃縮，于37℃烘干至恒重。

1.3.5 灰樹花乙酸乙酯提取物（EAE）的提取工藝響應面優(yōu)化設計 根據(jù)1.3.4節(jié)單因素試驗結(jié)果，分別選取料液比（A）、超聲時間（B）、提取溫度（C）3個因素為自變量，以提取率作為響應值，利用Design-Expert8.0軟件中的Box-Behnken Design進行灰樹花EAE提取工藝的響應面優(yōu)化分析設計。設計的因素水平見表1。

1.3.6 灰樹花乙酸乙酯提取物（EAE）中組分的LC-MS/MS分析鑒定 色譜條件：BEH C18色譜柱（2.1mm×100mm，1.7μm）；流動相為0.05%甲酸水溶液（A）和乙腈（B）。采用梯度洗脫程序：0～0.5min 98%A～90%A，0.5～3min 90%A～75%A，3～18min 75%A～65%A，18～27min 65%A～98%A，最后用98%A持續(xù)3min；柱溫45℃，流速0.6mL/min。

表1 響應面設計因素水平表Table1 Factors and levels of the response surface design

質(zhì)譜條件：離子源：ESI；檢測方式：負離子電噴霧模式；掃描范圍50～1 200 u，掃描時間：0.10 s；毛細管電壓3.0 kV，錐孔電壓25 V；去溶劑氣N2，去溶劑氣溫度450℃；源溫度120℃；去溶劑氣流速500 L/h；低碰撞能量掃描的碰撞能量為2 V，高碰撞能量掃描的碰撞能量為30～70 V。質(zhì)譜儀和UPLC系統(tǒng)由MassLynx 4.1軟件（美國Waters公司）控制。

2 結(jié)果與分析

2.1 灰樹花不同溶劑提取物得率

灰樹花經(jīng)上述方法提取，分別得到11種組分，各提取組分的得率見表2。其中，水提物的得率最大，為25.18%；灰樹花EAE的得率最低，僅0.30%。2種提取方法普遍出現(xiàn)溶劑極性越高，得率越高的現(xiàn)象。

表2 不同溶劑提取的灰樹花活性組分得率Table2 The yields of active components from Grifola frondosa

2.2 灰樹花不同溶劑提取物對膽酸鹽結(jié)合的能力

活性組分對脫氧膽酸鈉和膽酸鈉結(jié)合越多，越能降低機體的脫氧膽酸鈉和膽酸鈉含量，促進膽固醇向膽汁酸的轉(zhuǎn)化，從而降低肝臟中的膽固醇累積，促進血液中膽固醇向肝臟中轉(zhuǎn)移，達到降血脂的效果。灰樹花不同溶劑提取物（質(zhì)量濃度80mg/mL）對脫氧膽酸鈉的結(jié)合能力見圖1。不同提取物（質(zhì)量濃度80mg/mL）對脫氧膽酸鈉的結(jié)合能力分別為EAE＞CE＞HE＞ME＞100%EE＞80%EE＞60%EE＞0%EE＞40%EE＞20%EE＞W(wǎng)E。其中，灰樹花EAE的結(jié)合量最高，達24.59μmol/100mg。

灰樹花不同溶劑提取物（濃度80mg/mL）對膽酸鈉的結(jié)合能力見圖2。不同提取物（質(zhì)量濃度80mg/mL）對膽酸鈉的結(jié)合能力分別EAE＞CE＞100%EE＞HE＞ME＞80%EE＞60%EE＞20%EE＞W(wǎng)E＞40%EE＞0%EE。其中，灰樹花EAE的結(jié)合量最高，達22.19μmol/100mg。

2.3 灰樹花不同溶劑提取物對胰脂肪酶的抑制活性

由圖3可知，作為目前市場上最成功的胰脂肪酶抑制劑-奧利司他在相同試驗條件下對胰脂肪酶抑制效果最好，其抑制率達96.84%。不同灰樹花提取物（質(zhì)量濃度4mg/mL）對胰脂肪酶的抑制效果最好，其抑制率達96.84%。不同灰樹花提取物（質(zhì)量濃度4mg/mL）對胰脂肪酶的抑制能力相差很大，為EAE＞HE＞40%EE＞100%EE＞0%EE＞ME＞80%EE＞W(wǎng)E＞20%EE＞CE＞60%EE。其中EAE抑制脂肪酶的活性最高，達73.15%。

圖1 微板法灰樹花不同溶劑提取物與脫氧膽酸鈉的結(jié)合能力Fig.1 The binding of sodium deoeycholate of different extracts from Grifola frondosa by microplate method

圖2 微板法灰樹花不同溶劑提取物與膽酸鈉的結(jié)合能力Fig.2 The binding of sodium cholate of different extracts from Grifola frondosa by microplate method

2.4 灰樹花乙酸乙酯提取物（EAE）的提取工藝的單因素試驗

由于篩選的灰樹花活性組分乙酸乙酯EAE提取物提取率很低，所以對其進行單因素和響應面優(yōu)化試驗，確定其最佳工藝條件，以提高其得率。

2.4.1 料液比的選擇 料液比是利用物質(zhì)在固相和液相之間存在的濃度差，即其在兩相間的傳質(zhì)推動力，影響物質(zhì)的提取率。適當增大液料比，增大兩相間的濃度差時，可促進固相中物質(zhì)向液相中釋放和擴散。如圖4所示，液料比在5∶1到25∶1之間，隨著溶劑的增大，提取率逐漸增大。當溶劑液料比超過25∶1時，提取中溶劑增加得率不再增大。最終選擇液料比為25∶1（mL/g）。

2.4.2 超聲時間的選擇 如圖5所示，當超聲時間40min時EAE提取物得率達到最大值。超聲波可促進物料分子振動加劇，增大組織的破碎程度，使有效成分溶出增加。當超聲時間超過40min時，得率緩慢下降。最終選擇40min作為最佳提取時間。

圖3 灰樹花不同溶劑提取物對胰脂肪酶活性的抑制率Fig.3 Inhibitory rates of pancreatic lipase by extracts from Grifola frondosa with different solvent

圖4 料液比對灰樹花EAE提取物得率的影響Fig.4 Influence of liquid-to-solid ratio on the yield of EAE from Grifola frondosa

2.4.3 提取溫度的選擇 如圖6所示，在一定溫度范圍，得率隨著浸提溫度的升高而增加，在溫度為40℃時得率達到最高值。浸提溫度的升高有助于加快活性成分的布朗運動，有利于活性成分在提取溶劑中的溶出。因本試驗所用提取溶劑為乙酸乙酯，溫度過高溶劑易揮發(fā)而損失，故得率下降。最終選擇40℃為最適宜的浸提溫度。

圖5 超聲時間對EAE提取物得率的影響Fig.5 Influence of ultrasound time on the yield of EAE from Grifola frondosa

圖6 提取溫度對EAE提取物得率的影響Fig.6 Influence of extraction temperature on the yield of EAE from Grifola frondosa

2.5 灰樹花乙酸乙酯提取物（EAE）的提取工藝的響應面優(yōu)化分析

2.5.1 響應面試驗設計及結(jié)果 依據(jù)2.4節(jié)單因素試驗結(jié)果，根據(jù)表1的因素水平表對灰樹花EAE提取進行響應面優(yōu)化設計。以提取物的提取率（%）為響應值，采用Box-Benhnken中心組合，對料液比、超聲時間、提取溫度3個因素，做三因素三水平優(yōu)化設計試驗。利用Design Expert8.0軟件對表3試驗結(jié)果做回歸分析，擬合模型后得到灰樹花EAE提取得率（Y）對料液比（A）、超聲時間（B）、提取溫度（C）的多元二次回歸方程：

Y=0.43+0.024A-0.029B+0.011C-0.012AB+0.023AC+0.019BC-0.037A2-0.00565B2+0.098C2

對回歸模型進行方差分析和系數(shù)顯著性檢驗，結(jié)果見表4。灰樹花EAE得率響應面模型的F值為18.27，P＜0.01差異極顯著；失擬項的F值為5.38，P=0.0689＞0.05，差異不顯著，這說明該模型的擬合性較好，數(shù)據(jù)沒有異常點，可忽略由不確定因素所帶來的影響。模型的決定系數(shù)R2=0.9592，說明提取率的變化有95.92%來源于所選3個變量。該模型中一次項中A、B對該模型的影響達到極顯著（P＜0.01）水平，C對該模型的影響不顯著。

從顯著性來看，對響應值（即提取率）的影響因素的主次順序為B＞A＞C，即超聲時間＞料液比＞提取溫度。經(jīng)響應面模擬的回歸模型優(yōu)化，獲得最優(yōu)提取條件：液料比29.03∶1（mL/g），超聲時間30 min，浸提溫度50℃。在該條件下灰樹花乙酸乙酯提取物（EAE）的理論得率為0.568%。

表3 響應面優(yōu)化設計結(jié)果Table3 Experiment results of Box-Benhnken design

（續(xù)表3）

表4 灰樹花乙酸乙酯提取物（EAE）提取得率回歸模型方差分析Table4 Analysis of variance for quadric regression model of experiment of EAE from Grifola frondosa

2.5.2 交互項作用對灰樹花乙酸乙酯提取物（EAE）得率的影響 根據(jù)回歸模型繪制響應曲面的直觀3D圖（圖7）所示：以曲面坡度的平緩和陡峭程度作為因素對提取物得率的響應靈敏度反映指標。從圖7和表4可以可看出，3個因素的交互作用都不顯著，說明沒有交互作用。

圖7 各交互因素對灰樹花乙酸乙酯提取物（EAE）得率的響應面3D圖Fig.7 3D modle graphs for the effects of interaction on the extraction ratio of EAE from Grifola frondosa

2.6 最優(yōu)提取條件的驗證

為了方便實際操作，將2.5節(jié)中得到的提取條件作修正，即：液料比29：1（mL/g），超聲時間30min，浸提溫度50℃。測得3組平行驗證試驗的實際得率平均值為0.565%，與理論值基本相符。后續(xù)試驗中均以實際操作條件為準。具體數(shù)據(jù)見表5。

2.7 灰樹花乙酸乙酯提取物（EAE）中組分的UPLC-QTOF-MS/MS分析鑒定結(jié)果

灰樹花乙酸乙酯提取物（EAE）中各組分在UPLC液相洗脫中被有效分離，各色譜峰對應的質(zhì)譜結(jié)果見圖8。

表5 最優(yōu)提取條件驗證結(jié)果Table5 The verification results in the optimal extraction conditions

圖8 灰樹花乙酸乙酯提取物（EAE）的UPLC-QTOF-MS總離子流色譜圖Fig.8 The UPLC-QTOF-MS chromatograms of ethyl acetate extract（EAE）of Grifola frondosa

圖9 灰樹花乙酸乙酯提取物（EAE）組分的質(zhì)譜鑒定Fig.9 The mass spectrum of ethyl acetate extract（EAE）of Grifola frondosa

根據(jù)各色譜峰所對應的質(zhì)譜信息進行比對分析，主要對比其分子質(zhì)量信息，通過Phenol-Explorer多酚數(shù)據(jù)庫（http：//phenol-explorer.eu/）及文獻信息進行化合物的定性分析，可初步判斷灰樹花乙酸乙酯提取物（EAE）中的主要成分是：野靛黃素（Pseudobaptigenin）[http：//phenol-explorer.eu/metabolites/882]、矢車菊素-3-O-蕓香糖苷（Cyanidin 3-O-xylosyl-rutinoside）[http：//phenol-explorer.eu/compounds/62]。其中，野靛黃素屬于異黃酮類是灰樹花乙酸乙酯提取物（EAE）中最主要的成分，矢車菊素-3-O-蕓香糖苷屬于花青苷類。對于其它5個峰未在Phenol-Explorer多酚數(shù)據(jù)庫中匹配上，可能是這5個物質(zhì)不屬于多酚類化合物。

表6 灰樹花乙酸乙酯提取物（EAE）的UPLC-TOF-MS鑒定結(jié)果Table6 The identification results of ethyl acetate extract（EAE）of Grifola frondosa by UPLC-TOF-MS

3 結(jié)論

本研究共提取到11種灰樹花提取物，利用模擬膽汁膠束法、脂肪酶抑制進行體外篩選，結(jié)果表明：灰樹花乙酸乙酯提取物（EAE）對脫氧膽酸鈉和膽酸鈉的結(jié)合能力是最高的，其中對脫氧膽酸鈉的吸附量為24.59μmol/100mg，對膽酸鈉的吸附量為22.19μmol/100mg；灰樹花乙酸乙酯提取物（EAE）對胰脂肪酶的抑制活性最高（達73.15%），僅次于陽性藥物奧利司他。

灰樹花乙酸乙酯提取物（EAE）活性組分的提取率較低。本研究通過單因素和響應面優(yōu)化試驗，確定了灰樹花乙酸乙酯提取物（EAE）活性組分的最佳提取工藝條件：液料比29∶1（mL/g），超聲時間30min，浸提溫度50℃。在此條件下做3組平行試驗驗證，得到3組實際得率的平均值為0.565%。

對灰樹花乙酸乙酯提取物（EAE）活性組分的LC-MS/MS鑒定結(jié)果：其主要成分是野靛黃素（Pseudobaptigenin）和矢車菊素-3-O-蕓香糖苷（Cyanidin 3-O-xylosyl-rutinoside）。其中，野靛黃素屬于異黃酮類，矢車菊素-3-O-蕓香糖苷屬于花青苷類。其它5個色譜峰未在Phenol-Explorer多酚數(shù)據(jù)庫中匹配上，可能是這5個物質(zhì)不屬于多酚類化合物。后續(xù)研究還有待采用其它化合物數(shù)據(jù)庫或核磁共振（NMR）等進行鑒定。