嗜熱真菌單寧酶的克隆表達及在柿子汁中的應(yīng)用

黃 蕾 盧海強 谷新晰 李 晨 康紅艷 王妙姝 田洪濤，2*

（1 河北農(nóng)業(yè)大學食品科技學院 河北保定071000

2 國家北方山區(qū)農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究中心 河北保定071000

3 河北新希望天香乳業(yè)有限公司 河北保定071030）

單寧酶（Tannase EC 3.1.1.20），又稱鞣酸酶，是一種單寧酰基水解酶，可以水解單寧中的酯鍵與縮酚羧鍵，生成葡萄糖、沒食子酸及其相應(yīng)的醇類等化合物[1-2]。單寧酶廣泛分布在自然界中，如動物、植物及微生物，目前，生產(chǎn)用單寧酶主要來自微生物的曲霉屬[3]。美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）已將單寧酶作為一種安全的食品添加劑[4]，并被茶、飲料以及釀酒工程中用來澄清液體[5-6]等。此外，其還被應(yīng)用于化工、醫(yī)藥及飼料等工業(yè)領(lǐng)域。

目前，單寧酶的生產(chǎn)成本限制了單寧酶的實際應(yīng)用[7]。利用生物技術(shù)提高單寧酶的產(chǎn)量是降低生產(chǎn)成本的可行途徑。1996年，Hatamoto等[8]首次對米曲霉中的單寧酶進行異源表達。到目前為止，共有4種來源的單寧酶實現(xiàn)了克隆表達，包括真菌來源的米曲霉[9]和黑曲霉[10]，原核微生物來源的植物乳桿菌[11]和葡萄球菌[12]。尚未報道有嗜熱真菌來源的單寧酶被表達。單寧酶的產(chǎn)量較低的問題仍未有效解決。采用基因工程技術(shù)提高單寧酶產(chǎn)量具有重要意義。

柿樹在我國山區(qū)種植廣泛，是當?shù)剞r(nóng)民重要的經(jīng)濟來源。柿子營養(yǎng)豐富，具有很高的食用和藥用價值。然而，目前柿子加工品種單調(diào)，主要是鮮食或經(jīng)初級加工的柿餅。限制其無法深加工的重要原因是：柿子中含有較高的單寧，利用單寧酶降解單寧已成為公認的有效方法，然而采用單寧酶來加工生產(chǎn)的柿子汁中的抗氧化活性是否會受到影響，并無相關(guān)研究。

本研究以課題組前期分離獲得的一株產(chǎn)單寧酶的嗜熱煙曲霉菌株A.fumigates.HBFH5為研究對象，克隆該菌單寧酶基因并在巴斯德畢赤酵母（P.pastoris）GS115中進行高效表達，通過對重組AfTanA的酶學性質(zhì)分析及其在柿子汁中的應(yīng)用試驗，探討重組單寧酶AfTanA在柿子汁中的應(yīng)用潛力，為單寧酶在柿飲料行業(yè)中的應(yīng)用提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

嗜熱真菌HBFH5分離自濃香型大曲中，保藏于本實驗室；巴斯德畢赤酵母GS115和質(zhì)粒pPIC9k，本實驗保存；大腸桿菌感受態(tài)細胞Trans I-T1，北京全式金生物技術(shù)有限公司；質(zhì)粒pMDTM19-T，Easy Taq DNA聚合酶，dNTPs（2.5 mmol/L），T4 DNA連接酶和限制性內(nèi)切酶Spe I，Not I和Sal I，TaKaRa公司；根據(jù)畢赤酵母表達手冊制備最小葡萄糖（MD）瓊脂板、緩沖復合甘油培養(yǎng)基（BMGY）和緩沖復合甲醇培養(yǎng)基（BMMY）；其它化學試劑為進口或國產(chǎn)分析純級；引物合成和核酸測序由上海生工生物工程股份有限公司完成。

1.2 儀器與設(shè)備

Biometra Tprofessional PCR儀，德國Biometra公司；DYY-6C型電泳儀，北京六一儀器廠；JY04S-3E型凝膠成像系統(tǒng)，君意電泳；TU-1810紫外分光光度計，北京普析通用儀器有限公司；Sigma 3K15高速臺式離心機，德國Sigma公司。

1.3 方法

1.3.1 單寧酶基因的克隆 嗜熱真菌HBFH5孢子接種于200mL PDB培養(yǎng)基中，45℃培養(yǎng)48 h，離心收集菌體，采用CTAB法提取HBFH5總基因組DNA。參照已報道單寧酶基因序列信息（XP_746534.1），設(shè)計單寧酶（afTanA）表達引物：afTan A-PF：5′-GGACTAGTGCATCTCTCG CTGACGTGTGC-3′（Spa I）；afTanA-PR：5′-GCGGCCGCTCAGTAGACAG GGACCTTGAAAGC-3′（Not I）。

PCR反應(yīng)體系（50μL）：基因組1μL，引物各1μL，Easy Taq DNA聚合酶1μL，10×Buffer 5 μL，dNTP 4μL，ddH2O 37μL。PCR反應(yīng)參數(shù)：95℃5min；95℃30s，55℃30 s，72℃2min，30個循環(huán)；72℃10min。

參照膠回收試劑盒說明書步驟回收PCR產(chǎn)物，將目的基因連接到pMDTM19-T上，并轉(zhuǎn)化至TransI-T1感受態(tài)中。采用通用引物（M13F和M13R）對克隆子進行菌液PCR，將陽性克隆子送至上海生工生物工程股份有限公司測序。

1.3.2 序列信息分析 通過對測序基因序列進行分析，用含陽性基因序列的質(zhì)粒做后續(xù)試驗。使用Vector NTI軟件分析測序結(jié)果，使用BLAST工具（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）進行序列一致性分析，使用ExPASy（http：//web.expasy.org/protparam/）預(yù)測單寧酶的分子質(zhì)量和等電點，使用SignalP 4.1 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）進行信號肽預(yù)測，使用NetNGlyc 1.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/）服務(wù)器預(yù)測可能的N-糖基化位點。蛋白二級結(jié)構(gòu)利用Predict protein工具進行分析（https：//www.predictprotein.org/），使用I-TASSER預(yù)測單寧酶Af-TanA的3D結(jié)構(gòu)，C-score對預(yù)測模型排序，選擇最優(yōu)模型。

1.3.3 重組菌株的構(gòu)建 對質(zhì)粒pMDTM19T-af-TanA和pPIC-9k進行雙酶切，利用膠回收試劑盒對目的酶切產(chǎn)物進行回收，并進行afTanA和pPIC-9k的連接反應(yīng)，構(gòu)建重組質(zhì)粒pPIC9k-af-TanA。采用5’AOX和3’AOX通用引物對轉(zhuǎn)化子進行驗證，將陽性轉(zhuǎn)化子送至上海生工生物工程股份有限公司測序。

利用質(zhì)粒提取試劑盒，提取質(zhì)粒pPIC9k-af-TanA，使用限制性酶Sal I將pPIC9k-afTanA線性化，電轉(zhuǎn)化至GS115感受態(tài)，參照畢赤酵母表達手冊進行陽性克隆子的篩選。

1.3.4 重組菌株誘導表達及SDS-PAGE分析挑取單陽性轉(zhuǎn)化子至50mL YPD培養(yǎng)基中，30℃，250 r/min培養(yǎng)12 h。以1%的接種量接種于200mL BMGY中，在搖床中30℃，250～300 r/min生長至OD600值2～6（16～18 h），室溫8 000 g離心5min，收集細胞，去除上清，100mL BMMY重懸細胞，放入搖床繼續(xù)培養(yǎng)至48 h，維持甲醇終含量為0.5%，離心收集發(fā)酵液，即粗酶液，測定其活力，進行SDS-PAGE分析。

1.3.5 單寧酶酶學性質(zhì)分析 單寧酶酶活測定參考Sharma的方法[13]并加以改進。取100μL適當稀釋酶液與400μL沒食子酸丙酯溶液（1.25mmol/L，pH5.0）混勻，反應(yīng)10min，加入300μL羅丹寧終止反應(yīng)，加入200μL KOH（0.5mol/L）顯色。對照組則在加入KOH后補加100μL稀釋酶液，顯色穩(wěn)定后在520 nm處測定吸光值。

酶活單位（IU）：每分鐘生成1μmol沒食子酸所需酶量為一個酶活力單位（IU）。

1.3.5.1 pH對重組酶AfTanA的影響 分別在pH 3.0～7.0條件下，測定重組酶AfTanA的酶活力，分析其最適作用pH值。將重組酶AfTanA在pH 2.0～12.0的條件下37℃處理1 h，對照為未處理的酶，按照標準酶活力測定方法測定酶活力，分析其pH耐受性。緩沖液為pH2.0～7.0的100 mmol/L檸檬酸-檸檬酸三鈉和pH8.0～12.0的100 mmol/L甘氨酸-NaOH。

1.3.5.2 溫度對重組酶AfTanA的影響 在最適pH值，溫度0～70℃條件下測定重組酶AfTanA的酶活力，分析其最適反應(yīng)溫度。將重組酶在50，60，70℃下孵育0，5，10，20，30min和60min后，測定酶活力，分析其熱穩(wěn)定性。

1.3.5.3 金屬離子對重組酶AfTanA的影響 在標準反應(yīng)條件下分別測定終濃度為1mmol/L和5mmol/L的金屬 離子（Fe3+、Cu2+、K+、Zn2+、Na+、Mg2+、Ca2+、Li+和Mn2+）條件下的單寧酶酶活力。

1.3.5.4 單寧酶反應(yīng)動力學分析 配制底物濃度分別為0.2，0.4，0.6，0.8，1.0mmol/L的PG溶液，在最適條件下反應(yīng)5min，測定520 nm處的吸光值，計算酶活性和反應(yīng)速率，利用米氏方程雙倒數(shù)法求得Km及Vmax值。

1.3.6 柿汁及其單寧酶水解產(chǎn)物的抗氧化性檢測

按照柿子∶水=1∶4的質(zhì)量比壓榨，經(jīng)膠體磨處理得柿子汁樣品。

DPPH自由基清除率的測定[14]：取2 mL DPPH-乙醇溶液（0.2mmol/L），分別與2mL重組酶AfTanA酶解前、后的柿汁混勻，室溫條件下避光反應(yīng)30min，以95%乙醇調(diào)零，測定5l7 nm處的吸光值A(chǔ)x。以蒸餾水代替樣品溶液作為空白對照得A0，以無水乙醇調(diào)零。

DPPH自由基清除率（%）=（A0－Ax）/A0×100

ABTS自由基清除率的測定[15]：于0.1mL柿汁中加入1.9mL ABTS工作液，震蕩混勻，避光反應(yīng)6min，測定734 nm處的吸光度Ax。以0.1mL的蒸餾水代替樣品作為空白對照得A0，蒸餾水調(diào)零。

ABTS自由基清除率（%）=（A0－Ax）/A0×100

OH·清除率的測定[16]：于試管中加入1mL FeSO4（2.25mmol/L）、1mL水楊酸-乙醇（9mmol/L）溶液、1mL柿汁和1mL 8.8mmol/L H2O2，37℃反應(yīng)30min，在波長510 nm處測其吸光度Ax；用水代替柿汁，測空白A0；再用2mL水代替水楊酸-乙醇和H2O2，測柿汁本底值A(chǔ)x0。

OH·清除率（%）=［A0-（Ax-Ax0）］/A0×100

1.3.7 數(shù)據(jù)分析及處理 每次試驗平行測定3次，利用spss19.0軟件對結(jié)果進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單寧酶基因重組菌株的構(gòu)建

2.1.1 單寧酶afTanA基因序列分析 煙曲霉（A.fumigatus.HBFH5）來源的單寧酶afTanA基因由1 767 bp核苷酸組成，無內(nèi)含子，編碼588個氨基酸和一個終止密碼子。理論分子質(zhì)量為63.64 ku，等電點為4.86，含有由18個氨基酸組成的前體信號肽。氨基酸組成分析發(fā)現(xiàn)，AfTanA中帶電氨基酸含量26.22%，酸性氨基酸含量9.79%，堿性氨基酸含量6.12%，極性氨基酸含量35.66%，疏水氨基酸含量30.42%。經(jīng)I-TASSER服務(wù)器三維結(jié)構(gòu)建模，獲得1個模型，其質(zhì)量評估系數(shù)值為0.13，結(jié)構(gòu)相似度系數(shù)為0.73±0.11，建模數(shù)據(jù)可用。重組單寧酶AfTanA存在1個Kex2酶切位點（Lys315-Arg316），位于Lid Domain區(qū)域的Loop中，預(yù)測其催化活性位點為Ser202、Asp455和His501。其α螺旋結(jié)構(gòu)占21.9%，β折疊結(jié)構(gòu)占10.02%，Loop結(jié)構(gòu)占68.08%。經(jīng)序列一致性分析，單寧酶Af-TanA氨基酸序列與米曲霉來源的單寧酶（XP_001826685.1）一致性為80%，與黑曲霉GH1（AKM52312）一致性為77%，與青霉屬來源的單寧酶基因一致性為80%～75%。

2.1.2 單寧酶afTanA工程菌株的構(gòu)建 對質(zhì)粒pMDTM19T-afTanA和質(zhì)粒pPIC-9k分別進行雙酶切，使用T4 DNA連接酶連接雙酶切產(chǎn)物，熱激轉(zhuǎn)化大腸桿菌TransⅠ-T1感受態(tài)細胞，構(gòu)建重組質(zhì)粒pPIC9k-afTanA。用pPIC9k-afTanA質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化巴斯德畢赤酵母GS115產(chǎn)生139個陽性克隆子。經(jīng)對陽性克隆子誘導表達，篩選出3株高產(chǎn)菌株，分別為AfTanA-13、AfTanA-21和AfTanA-39。

2.2 重組菌的AfTanA基因誘導表達及其產(chǎn)物的SDS-PAGE分析

圖1 使用I-TASSER構(gòu)建的AfTanA分子模型Fig.1 Molecular model of the AfTanA constructed using the I-TASSER server

將含重組菌株按1.3.4節(jié)方法進行培養(yǎng)和誘導表達后，對細胞發(fā)酵液進行酶活檢測，結(jié)果顯示，發(fā)酵液中單寧酶酶活為678 U/mL。對重組菌發(fā)酵液進行SDS-PAGE蛋白電泳檢測，結(jié)果見圖2。

發(fā)酵產(chǎn)物在45～55 ku處出現(xiàn)顯著蛋白條帶，而這與AfTanA的蛋白理論分子質(zhì)量（63.64 ku）存在一定的差異，很可能與巴斯德畢赤酵母GS115菌株所分泌Kex2蛋白酶降解有關(guān)。由三維結(jié)構(gòu)模型分析可知，該氨基酸序列存在“Lys-Arg”酶切位點，這使得AfTanA蛋白分子被切割成兩個片段：AfTanA-C亞基和AfTanA-N亞基，其大小分別是31.7 ku和30.4 ku。該產(chǎn)物經(jīng)去糖基化酶Endo H處理后，在30ku附近出現(xiàn)兩個片段，這與理論分子質(zhì)量相符。經(jīng)NetNGlyc 1.0分析，單寧酶Af-TanA中具有8個潛在的N-糖基化位點（37 NGTL，57 NSTS，79 NVTV，155 NGSI，262 NATI，330 NGTV，409 NVTY，534 NTTV），表明單寧酶AfTanA的糖基化修飾使得其分子質(zhì)量明顯增大。

圖2 重組單寧酶AfTanA SDS-PAGE電泳分析Fig.2 Sodium dodecy sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis（SDS-PAGE）analysis of recombinant AfTanA

2.3 重組單寧酶AfTanA酶學特性分析

由圖3a和3b可知，重組酶AfTanA的最適反應(yīng)pH 5.0，在pH 2.0和pH 9.0～12.0分別處理1 h，酶活力基本喪失；在pH 7.0～8.0處理1 h，AfTanA酶活性損失50%左右；而在pH3.0～6.0分別處理1 h，AfTanA酶活性基本不變。綜上，重組酶AfTanA在pH 3.0～6.0條件下穩(wěn)定。

由圖3c和3d可知，重組酶AfTanA的最適反應(yīng)溫度為40℃，隨著處理時間的延長，酶活性逐漸降低。在30℃處理1 h，AfTanA相對酶活損失30%；40℃處理1 h后，酶活損失約50%；50℃處理1 h后，AfTanA幾乎失活。

2.4 金屬離子對酶活力的影響及動力學參數(shù)

圖3 溫度和pH值對重組單寧酶AfTanA的影響Fig.3 Effect of temperature and pH on recombinant tannase AfTanA

由表1可知，不同的離子濃度對酶活力的影響存在差異，且離子種類也存在較大差異。在低濃度（1mmol/L）條件下，F(xiàn)e3+和Cu2+對重組AfTanA活性具有較強的抑制作用，K+、Na+、Mg2+、Ca2+、和Mn2+對AfTanA活性具有輕微促進作用；Zn2+對Af-TanA活性具有較強的促進作用；Li+對AfTanA的活性基本無影響。在高濃度（5mmol/L）條件下，金屬離子Cu2+和Fe3+對AfTanA活性完全抑制；Zn2+對AfTanA活性具有較強的抑制作用；K+、Na+、Mg2+、Ca2+、Li+和Mn2+對AfTanA活性具有促進作用。

經(jīng)測定，動力學曲線回歸方程為y=6.6648x+0.6251，R2=0.9952。由回歸方程計算得：Km為10.662mmol/L，Vmax為1.600mmol/（L·min）。

2.5 重組單寧酶對柿子汁的抗氧化性的影響

由圖4可知，經(jīng)重組單寧酶AftanA水解的柿子汁的自由基清除能力強于原柿子汁。其中，DPPH清除率改變最為明顯，由原來的50%左右提高至67%；ABTS清除率約提升12.7%，其清除率為45%?！H清除率約增加3.4%，為33%。由此可見，在柿子汁中添加重組單寧酶AftanA，能夠?qū)⑵渲械拇蠓肿訂螌幗到鉃樾》肿拥膯螌幩?，從而顯著增強柿子汁的抗氧化能力。

表1 金屬離子對AfTanA活力的影響Table1 Effects of Metalions on the activity of AfTanA

圖4 柿汁水解前、后對DPPH、ABTS自由基和·OH的清除效果Fig.4 The effect of Persimmon juice before and after hydrolysis on DPPH，ABTS free radicals and hydroxyl radicals

3 結(jié)論

目前，商品化的單寧酶主要是從野生型菌株中發(fā)酵分離獲得，而來自工程菌株的單寧酶較少[17-19]。本研究對大曲中獲得的嗜熱真菌A.fumigatus.HBFH5中的單寧酶基因進行克隆及異原表達，經(jīng)測定重組酶AfTanA活力為678U/mL，是黑曲霉GH1的重組單寧酶活力的1 000倍左右，單寧酶的高效表達，將有助于降低生產(chǎn)成本。重組酶AfTanA最適pH 5.0，在pH 5.0～6.0之間穩(wěn)定，這與已報到單寧酶性質(zhì)相類似。AfTanA最適溫度為40℃，而本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，嗜熱煙曲霉中的單寧酶的最適反應(yīng)溫度為60℃，分析其可能的原因主要是酶蛋白分子在不同的宿主中翻譯后修飾存在差異，繼而使得性質(zhì)存在差異[20]。當前的基因工程菌宿主如酵母菌、大腸桿菌和芽孢桿菌全部是常溫菌，因此開發(fā)嗜熱菌的宿主菌，對于解決嗜熱酶基因的表達及性質(zhì)的保持具有一定的現(xiàn)實意義。

我國是柿樹第一種植大國，其柿子產(chǎn)量占世界總量的91%，接近200萬t[21]。然而，柿子中含有大量的單寧和果膠物質(zhì)，造成柿子加工產(chǎn)品十分單調(diào)。采用單寧酶來對柿子中的單寧進行降解，是解決柿子單寧含量過高的最有效方法。Isabela等[22]報道單寧酶可有效降解葡萄果渣中的單寧，顯著提高其總酚含量和抗氧化性。羅昱等[5]也利用單寧酶脫除刺梨果汁中的單寧，總單寧脫除率達76.07%。然而，添加單寧酶是否對柿子汁果汁中的抗氧化活性物質(zhì)產(chǎn)生影響，還不清楚。本研究將重組酶單寧酶AfTanA作用于柿汁，利用福林酚法測定重組酶AfTanA作用于柿子汁前、后的總酚含量，結(jié)果顯示：處理后總酚含量顯著提高，并且酶解后的柿子汁中DPPH、ABTS自由基和·OH清除率較原柿汁均有不同程度的增強，其原因是果汁中的大分子單寧物質(zhì)被單寧酶降解為單寧酸等小分子物質(zhì)，而這類物質(zhì)具有較強的抗氧化活性[23]。

本研究從1株嗜熱真菌A.fumigates.HBFH5克隆獲得1單寧酶基因afTanA，并實現(xiàn)了afTanA在巴斯德畢赤酵母GS115中的高效表達。重組單寧酶AfTanA最適反應(yīng)溫度為40℃，最適pH 5.0，酶活力為678U/mL。同時研究發(fā)現(xiàn)將重組單寧酶AfTanA作用于柿子汁后，該酶不僅可以降解果汁的單寧，而且柿子果汁其抗氧化性顯著提高。本研究為單寧酶在果汁飲料中的應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)。