益生菌對(duì)大鼠腎功能缺失性腸屏障損傷的修復(fù)作用

張?bào)懔?王希璠 肖婭琳 邱青璐 趙 亮，3*

（1 食品營養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院 北京100083

2 教育部功能乳品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院 北京100083

3 河北省畜產(chǎn)食品工程技術(shù)研究中心 河北三河065200）

流行病學(xué)調(diào)查顯示，中國成人慢性腎病患病率高達(dá)10.8%，約有1.2億成人患有慢性腎臟病，因此控制慢性腎病的發(fā)展和惡化成為目前亟待解決的問題[1]。慢性腎臟病中的腎功能損傷主要表現(xiàn)為腎臟纖維化、腎小球硬化和腎小球?yàn)V過率下降等[2]。腎功能損傷會(huì)導(dǎo)致血液中毒素?zé)o法被腎臟代謝，滯留在體內(nèi)，而累積的毒素通過血液循環(huán)流至全身各處，造成機(jī)體腸道屏障[3-4]、心臟和腦部損傷[5]，最終引發(fā)心腦血管疾病和貧血癥等并發(fā)癥。其中腸道屏障受損會(huì)加重機(jī)體炎癥反應(yīng)，大大提高了腎病患者心腦血管疾病的發(fā)生率[6-8]。

腸道上皮屏障由黏液層、腸上皮細(xì)胞和腸細(xì)胞間的緊密連接組成。黏液層能夠保護(hù)腸道上皮細(xì)胞免受病原微生物的侵襲，同時(shí)是腸道蠕動(dòng)的潤滑劑。腸細(xì)胞頂端的等離子膜控制著物質(zhì)跨細(xì)胞膜的主動(dòng)和被動(dòng)運(yùn)輸，緊密連接用來防止腸腔內(nèi)物質(zhì)的細(xì)胞旁滲透[9]。正常情況下，腸道上皮的緊密連接能夠有效阻止有害物質(zhì)和抗原（胃腸道內(nèi)的細(xì)菌、細(xì)菌毒素、細(xì)菌副產(chǎn)物、消化酶、被降解的食物）的滲透，然而當(dāng)慢性腎臟病患者的腸道屏障尤其是緊密連接受損時(shí)，腸道中的微生物及其副產(chǎn)物就會(huì)通過受損的腸屏障進(jìn)入機(jī)體，引發(fā)機(jī)體炎癥反應(yīng)，加重腎臟及其他器官的損傷，使更多的毒素在體內(nèi)積累，從而進(jìn)一步加重腸道屏障損傷，形成惡性循環(huán)[10-11]。

目前治療腸道屏障損傷的主要手段有服用藥物，補(bǔ)充益生菌制劑和膳食纖維等營養(yǎng)成分。有大量研究表明益生菌有修復(fù)腸道屏障的功能[12-15]，主要修復(fù)機(jī)制包括促進(jìn)黏蛋白和免疫球蛋白sIgA的分泌，共同增強(qiáng)黏液層抵抗腸道微生物入侵的功能；分泌抗菌因子如短鏈脂肪酸和細(xì)菌素等，阻止病原微生物入侵腸道上皮細(xì)胞；提高緊密連接蛋白表達(dá)量等[16]。體外實(shí)驗(yàn)表明乳酸菌能夠有效增加黏蛋白MUC2的分泌量[17]，降低腸道環(huán)境pH值，抑制大腸桿菌的生長[18]，促進(jìn)免疫球蛋白sIgA分泌[19]，然而，益生菌修復(fù)腸道屏障的能力存在菌株特異性，并且缺乏體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證據(jù)。

動(dòng)物雙歧桿菌A6分離自廣西巴馬長壽老人腸道，之前研究表明含有A6菌株的混合益生菌粉能夠有效抵御抑制病原微生物的生長，改善小鼠腸道免疫功能[20]。本文采用5/6腎切除大鼠模型，連續(xù)灌胃混合益生菌粉10周，研究該益生菌修復(fù)腎功能缺失性腸道屏障損傷的功能，探討菌株緩解慢性腎臟病炎癥反應(yīng)的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SD大鼠39只，雄性，SPF級(jí)，6周齡，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。

1.1.2 試劑 磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、氯化鉀、氯化鈉、吐溫-80、檸檬酸氫二銨、磷酸氫二鉀、無水乙醇、二甲苯、濃鹽酸（分析純），北京化工廠；甲醛溶液（分析純），國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；無水乙醚、氫氧化鈉，西隴化工；甘氨酸，上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司；中性樹脂，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；BCA試劑盒、脂多糖試劑盒、C反應(yīng)蛋白酶聯(lián)免疫試劑盒、rabbit anti-claudin-1抗體、rabbit anti-occludin抗體和rabbit anti-ZO-1抗體，賽默飛世爾科技（中國）有限公司；Western及IP細(xì)胞裂解液（無抑制劑）、苯甲基磺酰氟溶液和辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG（H+L），上海碧云天生物技術(shù)有限公司；TNF-α、IL-6、IL-10和IL-13酶聯(lián)免疫試劑盒，北京華英生物技術(shù)研究所；標(biāo)準(zhǔn)大小鼠維持飼料（無菌、不含OVA），北京華阜康生物科技股份有限公司。

1.1.3 儀器與設(shè)備 AR1140電子分析天平，梅特勒托利多儀器上海有限公司；DELTA 320 pH計(jì)，梅特勒托利多儀器上海有限公司；Vert.A1倒置顯微鏡，德國ZEISS集團(tuán)；Infinite M2000Pro多功能酶標(biāo)儀，瑞士TECAN公司；ZW-A微量振蕩器，江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司；TDL-5-A低速離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；LGJ-18真空冷凍干燥機(jī)，北京松源華興科技發(fā)展有限公司；Centrifuge 5418R小型臺(tái)式高速離心機(jī)，芬蘭Eppendorf公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 受試菌株的制備 動(dòng)物雙歧桿菌A6菌粉，菌量為3×1010CFU/mL，由北京和益源生物技術(shù)有限公司提供。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組、造模及灌胃方式 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物權(quán)利及倫理安全委員會(huì)批準(zhǔn)，6周齡雄性SD大鼠被置于（25±2）℃SPF級(jí)動(dòng)物房喂養(yǎng)，燈光日夜輪換。適應(yīng)性喂養(yǎng)5 d后，隨機(jī)分組（每組13只），即假手術(shù)組、模型組和益生菌組。分別于第0，7天進(jìn)行5/6腎切除手術(shù)，其中假手術(shù)組僅麻醉備皮后，切開縫合。于第22天灌胃，益生菌組大鼠每天灌胃2mL 0.9%滅菌NaCl菌粉懸液，模型組和假手術(shù)組大鼠則每天灌胃2mL 0.9%滅菌NaCl溶液。

1.2.3 血清中脂多糖的測(cè)定 采用眼眶內(nèi)眥采血的方法采集大鼠血液，靜置2 h后，3 000×g離心15min，吸取血清，將上清以12 000 r/min、4℃離心5min，留取血清。使用賽默飛鰲試劑盒測(cè)定血清中脂多糖的含量。

1.2.4 大鼠結(jié)腸組織切片及病理染色 結(jié)腸用10%福爾馬林溶液固定，常規(guī)石蠟包埋切片，進(jìn)行蘇木精和曙紅（H&E）染色，觀察結(jié)腸隱窩深度和黏膜厚度，進(jìn)行PAS染色，觀察結(jié)腸杯狀細(xì)胞數(shù)量的變化。

1.2.5 Western-Blot分析 將大鼠結(jié)腸放入組織研磨器中，置于冰上，加入細(xì)胞裂解液和PMSF后勻漿，在冰上孵育30min，直至充分裂解。組織勻漿中的蛋白含量通過BCA試劑盒測(cè)定。蛋白提取完成后，通過4%～10%的SDS-PAGE電泳，將樣品中不同分子質(zhì)量的蛋白分開，初始電壓為80 V，進(jìn)入10%的分離膠后電壓調(diào)整為120 V，電泳時(shí)間為90min，其中每個(gè)樣品中總蛋白含量為50μg。電泳完成后，將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜。轉(zhuǎn)膜后，將每個(gè)蛋白對(duì)應(yīng)的PVDF膜分別放在包含rabbit anti-claudin-1抗體、rabbit anti-occludin抗體、rabbit anti-ZO-1抗體或rabbit anti-actin antibodies抗體溶液中，抗體含量分別為1∶100，1∶5 000、1∶250和1∶1 000，孵化過夜。將孵化好的PVDF膜放入辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG（H+L）溶液中繼續(xù)孵化2 h，抗體含量為1∶1 000，孵化完成后用凝膠成像儀成像。

1.2.6 大鼠免疫蛋白因子的測(cè)定 按照上述方法分離得到大鼠血清，使用ELISA試劑盒測(cè)定血清中CRP、TNF-α、IL-6、IL-10和IL-13的含量。

1.3 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行One-Way ANOVA分析。樣本均數(shù)之間差異性采用Duncan檢驗(yàn)判斷，P＜0.05存在顯著性差異。

2 結(jié)果與討論

2.1 益生菌對(duì)慢性腎臟病大鼠血清中脂多糖含量的影響

脂多糖是革蘭陰性菌外膜的主要成分，正常情況下腸道中細(xì)菌及脂多糖無法穿過腸道屏障，而當(dāng)腸道緊密連接受損時(shí)，從病原體中釋放的脂多糖可通過受損的腸道屏障進(jìn)入血液，之后血液中脂多糖會(huì)引發(fā)機(jī)體先天免疫反應(yīng)，來防止免疫系統(tǒng)受到進(jìn)一步感染[21-23]。若脂多糖沒有被機(jī)體免疫系統(tǒng)有效的控制和清除，則會(huì)引發(fā)敗血性休克綜合癥[6]。

由圖1可知，與假手術(shù)組相比，模型組大鼠血清中脂多糖含量顯著升高（P＜0.05），說明模型組大鼠的腸道屏障確實(shí)存在受損情況，血清中的脂多糖升高有可能會(huì)引發(fā)機(jī)體的炎癥反應(yīng)。益生菌灌胃后，大鼠血清中的脂多糖含量明顯下降（P＜0.05），這說明益生菌阻斷了血清中脂多糖的來源，在修復(fù)腸屏障上有一定作用。

圖1 慢性腎病大鼠血清中脂多糖含量Fig.1 Total LPS in serum of CKD rats

2.2 慢性腎臟病大鼠結(jié)腸黏膜的隱窩深度、黏膜厚度及杯狀細(xì)胞含量的變化

圖2 慢性腎病大鼠結(jié)腸隱窩深度和黏膜厚度Fig.2 Crypt depth and mucosal thickness in colon of CKD rats

腸道黏膜的主要功能是吸收營養(yǎng)物質(zhì)，分泌廢物，作為屏障防止廢物吸收和腸腔內(nèi)的微生物及其有害副產(chǎn)物進(jìn)入人體內(nèi)部環(huán)境[24-25]。

根據(jù)圖2中大鼠結(jié)腸H&E染色結(jié)果可知，與假手術(shù)組相比，模型組結(jié)腸組織的隱窩深度和黏膜厚度均明顯降低（P＜0.05）；而與模型組相比，益生菌組的隱窩深度和黏膜厚度顯著升高（P＜0.05），說明灌胃益生菌后，結(jié)腸黏膜的形態(tài)有一定恢復(fù)。

圖3 慢性腎病大鼠結(jié)腸上皮中杯狀細(xì)胞含量Fig.3 The number of goblet cells in colonic epithelia of CKD rats

杯狀細(xì)胞能夠在腸道中特異性地分泌黏蛋白，而這些黏蛋白會(huì)在黏膜表面聚集成水合凝膠，形成一層黏膜屏障，阻止腸道中的大顆粒物如細(xì)菌等物質(zhì)直接接觸腸上皮層[10，26-27]。當(dāng)黏膜屏障被破壞后，腸道中的大顆粒物會(huì)刺激腸道上皮的免疫細(xì)胞，激活免疫屏障，保護(hù)機(jī)體不受異物的損害[9，26-27]。

根據(jù)圖3中大鼠結(jié)腸組織PAS染色結(jié)果可知，與假手術(shù)組相比，模型組結(jié)腸組織的杯狀細(xì)胞數(shù)量明顯降低（P＜0.05）。灌胃益生菌后，與模型組相比，益生菌組的杯狀細(xì)胞數(shù)量顯著升高（P＜0.05）。由此推斷，灌胃益生菌后結(jié)腸中被破壞的黏膜屏障得到修復(fù)，修復(fù)后的黏膜屏障能夠阻止腸道中異物進(jìn)入腸上皮，抑制腸道免疫細(xì)胞的活性。

2.3 益生菌對(duì)慢性腎臟病大鼠結(jié)腸上皮緊密連接蛋白的影響

腸道緊密連接結(jié)構(gòu)由跨膜蛋白和胞質(zhì)蛋白組成：①跨膜蛋白能夠緊密連接周圍的肌動(dòng)蛋白和肌球蛋白環(huán)，通過調(diào)節(jié)緊密連接的結(jié)構(gòu)和通透性，來調(diào)控細(xì)胞旁通透性；②胞內(nèi)蛋白與肌動(dòng)蛋白結(jié)合，調(diào)控緊密連接結(jié)構(gòu)的組成和定位?？缒ぞo密連接蛋白包括occludin、claudin蛋白家族和連接粘附因子-A，胞內(nèi)蛋白包括ZO蛋白家族，其中ZO-1是關(guān)鍵蛋白。ZO-1能夠結(jié)合跨膜蛋白和環(huán)狀肌動(dòng)蛋白，在緊密連接組裝和功能上發(fā)揮必要作用[6，9]。

根據(jù)圖4可知，灌胃益生菌后，大鼠結(jié)腸中的ZO-1和Claudin-1蛋白的含量顯著回升（P＜0.05），說明益生菌能夠在一定程度上修復(fù)被破壞的腸道緊密連接，減少腸道中有害物質(zhì)和抗原進(jìn)入機(jī)體，抑制機(jī)體的免疫反應(yīng)。

2.4 混合益生菌對(duì)慢性腎臟病大鼠血清中細(xì)胞因子的影響

圖4 各組大鼠結(jié)腸上皮緊密連接蛋白的表達(dá)量Fig.4 Abundance of intestinal barrier proteins in colonic epithelia of rats

C-反應(yīng)蛋白是評(píng)價(jià)慢性腎病患者炎癥情況的指標(biāo)，在臨床上廣泛使用[28-30]。TNF-α屬于TNF類細(xì)胞因子，連接先天性免疫和獲得性免疫，能夠激活吞噬細(xì)胞殺死病原體，并誘導(dǎo)單核細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌趨化因子、IL-1和IL-6等促炎因子，引起細(xì)胞因子的級(jí)聯(lián)反應(yīng)[28-31]。IL-6由Th2細(xì)胞、單核細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞等產(chǎn)生，有促炎活性，能夠加重慢性腎病大鼠的動(dòng)脈粥樣硬化，增加慢性腎病患者的死亡率[28，31]。IL-13主要由Th2細(xì)胞產(chǎn)生，有研究表明IL-13和IL-10均能夠抑制單核細(xì)胞的抗原呈遞功能和IL-1和TNF-α等細(xì)胞因子的釋放[32-33]。此外，還有證據(jù)說明IL-10能夠調(diào)節(jié)腎病患者體內(nèi)紊亂的細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)[31]。

圖5 血清中C-反應(yīng)蛋白、TNF-α、IL-6、IL-10、IL-13的含量Fig.5 Total CRP，TNF-α，IL-6，IL-10，IL-13 production in serum

由圖5可知，與假手術(shù)組相比，模型組大鼠血清中C-反應(yīng)蛋白含量顯著升高，說明模型組大鼠出現(xiàn)全身炎癥現(xiàn)象，這種現(xiàn)象有可能是腸道屏障受損后，腸道中脂多糖進(jìn)入機(jī)體所致。灌胃益生菌后，與模型組大鼠相比，益生菌組大鼠血清中C-反應(yīng)蛋白含量顯著降低，說明本益生菌產(chǎn)品能夠有效抑制腎病大鼠體內(nèi)的炎癥反應(yīng)。結(jié)合之前的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，益生菌干預(yù)后，腎功能缺失性腸屏障損傷得到修復(fù)，益生菌有可能通過改善受損腸屏障來減少腸道中微生物及其它異物進(jìn)入體內(nèi)，從而減輕腎病大鼠體內(nèi)的炎癥現(xiàn)象。此外，與假手術(shù)組相比，模型組大鼠血清中促炎因子TNF-α（P＜0.05）和IL-6（P＞0.05）含量升高，抗炎因子IL-10（P＜0.05）和IL-13（P＜0.05）含量顯著下降，說明慢性腎病大鼠體內(nèi)的先天性免疫系統(tǒng)被激發(fā)，與C-反應(yīng)蛋白的結(jié)果一致，而在灌胃益生菌后，與模型組大鼠相比，益生菌組大鼠血清中促炎因子TNFα（P＜0.05）和IL-6（P＞0.05）含量下降，抗炎因子IL-10（P＜0.05）和IL-13（P＜0.05）含量顯著升高，說明益生菌通過調(diào)節(jié)血清中促炎因子和抗炎因子的水平，來改善大鼠體內(nèi)的免疫失衡和炎癥反應(yīng)。

3 結(jié)論

通過灌胃益生菌產(chǎn)品能夠顯著降低慢性腎臟病大鼠血清中脂多糖含量，有效改善大鼠腎功能缺失性腸屏障損傷，增加隱窩深度和黏膜厚度，提高腸道上皮中杯狀細(xì)胞的數(shù)量，修復(fù)腸上皮細(xì)胞間的緊密連接，阻止腸道中微生物、毒素及異物進(jìn)入機(jī)體內(nèi)環(huán)境，從而減輕慢性腎臟病大鼠體內(nèi)的系統(tǒng)炎癥現(xiàn)象。