藜蒿葉中1，4-雙咖啡?？鼘幩岬蔫b定及雙咖啡?？鼘幩犷惢衔矬w外抑制黃嘌呤氧化酶和抑制尿酸鈉誘導IL-1β的構(gòu)效關(guān)系

曹偉偉 吳 婷 方雅靜 程玉鑫 潘思軼 徐曉云

（華中農(nóng)業(yè)大學食品科學技術(shù)學院 武漢430070）

黃嘌呤氧化酶（XOD）是嘌呤代謝過程中的關(guān)鍵酶，主要催化次黃嘌呤和黃嘌呤為尿酸。過高的XOD活性會導致尿酸的生成過多，進而誘發(fā)高尿酸血癥、痛風等多種常見代謝性疾病[1]。當尿酸在機體的水平超過其飽和濃度時，導致其以尿酸鈉（MSU）晶體形式沉積于組織中，進而引起促炎因子白細胞介素1β（IL-1β）的分泌等痛風炎癥反應(yīng)[2]。常見的XOD抑制劑別嘌醇和緩解痛風炎癥藥物秋水仙堿是臨床上常用的降尿酸和抗痛風炎癥的藥物，然而，這些藥物具有胃腸不適、肝腎損傷等副作用[3-4]。而天然植物化合物由于在抑制XOD活性和MSU介導的炎癥方面具有雙重效果、副作用小等優(yōu)勢而受到越來越多的關(guān)注[5-6]。篩選并評價天然膳食化合物對于XOD和痛風炎癥的抑制具有重要意義。

藜蒿（Artemisia selengensis Turcz）屬于菊科蒿屬植物，是一種主要種植在我國南方區(qū)域的蔬菜，嫩莖常供食用。藜蒿富含多酚和三萜等活性成分，古籍中報道其可用于治療發(fā)熱、風濕病和肝炎等多種疾病[7]。近年的研究表明，藜蒿具有抑制XOD[8]、炎癥因子白細胞介素6（IL-6）分泌[9]等多種藥理活性。雙咖啡酰奎寧酸（di-CQA）是一類常見的存在于咖啡、茶葉、蔬菜等植物中的多酚類化合物[10-12]，由于咖啡酸的取代位置不同，共有6種同分異構(gòu)體[13]（結(jié)構(gòu)如圖1所示）。目前，已有關(guān)于藜蒿葉中的1，3-diCQA、3，4-diCQA、3，5-diCQA和4，5-diCQA抑制XOD的活性報道[14]，然而藜蒿葉中是否存在其它結(jié)構(gòu)的di-CQA，以及不同的di-CQA化合物抑制XOD活性的結(jié)構(gòu)特征尚未見系統(tǒng)報道。

本研究首次從藜蒿葉中鑒定出1，4-diCQA，與其它di-CQA相比，1，4-diCQA在植物中分布較少，僅在朝鮮薊（Cynara scolymus L.）[15]、蓖齒蒿（Artemisia pectinate）[16]等少數(shù)植物中有報道。目前1，4-diCQA僅有抑制黑色素生成的報道[17]，而其它的活性研究鮮有報道。

研究表明di-CQA化合物具有抗炎活性。從藜蒿葉中分離的1，3-diCQA可抑制腫瘤壞死因子（TNF-α）刺激的MG-63細胞分泌IL-6[9]。富含3，4-diCQA、3，5-diCQA和4，5-diCQA的苦丁茶提取物可抑制脂多糖（LPS）誘導的RAW264.7巨噬細胞的炎癥反應(yīng)[18-19]?，F(xiàn)有關(guān)于di-CQA的抗炎研究中，炎性的誘導方式、引發(fā)的炎癥反應(yīng)與MSU引起的炎癥因子IL-1β并不相同。痛風炎癥因子IL-1β的分泌由兩條信號通路共同調(diào)節(jié)：首先，脂多糖（LPS）或者其它NF-κB激活劑作為第1刺激信號激活NF-κB通路；其次，MSU作為第2刺激信號激活NLRP3炎癥小體，將pro-IL-1β前體蛋白切割成分泌的IL-1β[20]。目前di-CQA單體能否抑制MSU誘導的IL-1β分泌尚不清楚，其相關(guān)抑制作用的構(gòu)效關(guān)系研究亦未見報道，這限制了膳食中di-CQA在降尿酸和抗痛風炎癥方面的應(yīng)用。

本文采用HPLC-Q/TOF-MS對藜蒿葉提取物中的di-CQA進行定性、定量分析，同時，研究了di-CQA抑制XOD和抑制MSU誘導的IL-1β的結(jié)構(gòu)特征。本研究為藜蒿及其它膳食中分布廣泛的di-CQA應(yīng)用于預(yù)防高尿酸血癥和痛風提供了借鑒。

圖1 不同di-CQA的結(jié)構(gòu)Fig.1 Structures of different di-CQAs

1 材料和方法

1.1 試驗材料及試劑

藜蒿葉由武漢荷香源農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司提供。藜蒿葉經(jīng)50℃烘箱干燥12 h后，用粉碎機粉碎，所得粉末樣品于-20℃下保存。

XOD、黃嘌呤、LPS和佛波酯（PMA），美國Sigma-Aldrich公司；RPMI-1640培養(yǎng)基，美國Hyclone公司；別嘌醇（純度＞98%），上海源葉生物科技有限公司。乙腈和甲酸（色譜級），Thermo Fisher公司。3，4-diCQA、3，5-diCQA、4，5-diCQA和1，5-diCQA標準品（純度＞98%），上海源葉生物科技有限公司。IL-1β的酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）試劑盒，欣博盛生物科技有限公司。

1.2 主要儀器及設(shè)備

HPLC-Q/TOF-MS，美國Agilent公司；MULTISKAN GO多功能酶標儀，美國Thermo Fisher公司；R-1001VN旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，鄭州長城科工貿(mào)有限公司；KQ-300DA超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵，鄭州長城科工貿(mào)有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 藜蒿葉提取物的制備 藜蒿葉用50%乙醇（料液比1∶15）在室溫下超聲提取2次，然后真空濃縮，將濃縮提取物依次用石油醚、乙酸乙酯進行萃取分離，棄石油醚相，保留乙酸乙酯相，將其在真空條件下蒸發(fā)完全，然后冷凍干燥即得藜蒿葉提取物。

1.3.2 藜蒿葉提取物di-CQA的定性、定量分析 采用HPLC-Q/TOF-MS對藜蒿葉提取物中的di-CQA進行定性、定量分析。色譜柱：安捷倫Zorbax SB-C18柱（250mm×4.6mm，5μm）；柱溫：25°C，流速：1mL/min。流動相：0.1%（體積分數(shù)）甲酸/水A和乙腈B。洗脫方法：0～10min，10%B；10～15min，15%B；15～17min，18%B；17～37min，18%B；37～42 min，50%B；42～48 min，65%B；48～52 min，80%B；52～58min，80%B；58～62min，10%B，檢測波長：325 nm，進樣體積：8μL。根據(jù)1，5-diCQA標準曲線（y=107x-91633，R2=0.9997），藜蒿葉提取物中各di-CQA的含量均用1，5-diCQA物質(zhì)的量表示。

負離子模式下采集質(zhì)譜數(shù)據(jù)，參數(shù)如下：質(zhì)荷比m/z：100～1 100；毛細管電壓：3.5 kV；霧化器壓力：3.4×105Pa；干燥氣流：10.0 L/min；去溶劑溫度：325℃；碎裂電壓：175V；碰撞能量：10～40 V。

1.3.3 細胞培養(yǎng)和加藥處理 THP-1細胞（購于上海細胞庫）生長所需的完全培養(yǎng)基為含10%FBS、1%雙抗和50μmol/Lβ-巰基乙醇的RPMI-1640培養(yǎng)基，將細胞在37°C，5%CO2條件下培養(yǎng)。藥物處理組：藥物處理前，先用100ng/mL的PMA處理12 h誘導THP-1細胞分化為巨噬細胞，去除非貼壁細胞，在完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，用不同的di-CQA單體（100μmol/L）預(yù)處理12 h，然后用LPS（1μg/mL）孵育細胞2 h，MSU（200μg/mL）繼續(xù)刺激4 h。對照組THP-1巨噬細胞不做藥物處理，模型組僅用MSU刺激LPS預(yù)孵育的THP-1巨噬細胞，不加di-CQA預(yù)處理。

1.3.4 細胞存活率的測定 參考李慧等[21]的方法，測定不同di-CQA對MSU刺激的LPS預(yù)孵育的THP-1巨噬細胞存活率的影響。按照1.3.3節(jié)所述步驟刺激后，將MTT（0.5mg/mL）加入細胞培養(yǎng)2 h，最后加入150μL二甲基亞砜溶解細胞中的甲臜，采用酶標儀測定波長490 nm處的吸光度。

1.3.5 IL-1β的測定 細胞加藥處理結(jié)束后，收集細胞上清。按照ELISA試劑盒說明書，檢測上清液中IL-1β的含量。

1.4 統(tǒng)計分析

所有試驗均重復(fù)3次，結(jié)果用平均值±標準差（SD）表示。采用SPSS 16.0軟件的單因素方差分析進行顯著性檢驗，顯著性水平設(shè)置為P＜0.05。

2 結(jié)果和討論

2.1 藜蒿葉提取物di-CQA的定性、定量分析

通過與標準品的色譜保留時間、質(zhì)譜碎片信息比對的方法鑒定藜蒿葉中的di-CQA。由圖2和表1可知，藜蒿葉提取物中（峰2～5）4個峰的保留時間、最大紫外吸收波長、母離子[M-H]-、碎片離子及其相對豐度與3，4-diCQA、1，5-diCQA、3，5-diCQA和4，5-diCQA這4種di-CQA標準品一致，也與Zhang等[22]報道的藜蒿葉中的di-CQA質(zhì)譜信息一致，因此，藜蒿葉提取物中的這4種化合物（峰2～5）分別為3，4-diCQA、1，5-diCQA、3，5-diCQA和4，5-diCQA。

藜蒿葉提取物中峰1母離子[M-H]-為515.1224，其碎片離子m/z 203相對豐度為49%（以m/z 353為基峰），該碎片離子從未在以前關(guān)于藜蒿葉di-CQA結(jié)構(gòu)的鑒定研究中報道，與Clifford等[13]采用液-質(zhì)譜聯(lián)用鑒定的1，4-diCQA碎片離子的相對豐度接近，峰1也與1，4-diCQA標準品的保留時間、最大吸收波長、母離子和碎片離子信息一致，因此，藜蒿葉提取物中峰1對應(yīng)的化合物為1，4-diCQA。本研究首次報道了1，4-diCQA存在于藜蒿葉中。以上研究表明，藜蒿葉含有除1，3-diCQA外所有的di-CQA異構(gòu)體，藜蒿是多種di-CQA的膳食來源。

通過外標法測定了藜蒿葉提取物中di-CQA的含量。由表1可知，藜蒿葉提取物中不同di-CQA含量從高到低排序為3，5-diCQA（13.06%）＞1，5-diCQA（6.85%）＞4，5-diCQA（4.72%）＞3，4-diCQA（1.39%）＞1，4-diCQA（0.39%）。其中，1，4-diCQA含量顯著低于其余4種di-CQA，這也可能是以前關(guān)于藜蒿化學成分的研究未報道1，4-diCQA存在的原因。

圖2 藜蒿葉提取物和di-CQA標品的液相色譜圖（a）及5種di-CQA的二級質(zhì)譜圖（b-f）Fig.2 HPLC chromatogram of Artemisia selengensis Turcz leaf extract and five di-CQA standards（a），MS2 spectra of five di-CQA standards（b-f）

表1 藜蒿葉提取物中di-CQA的定性、定量分析Table1 Qualitative and quantitative analysis of di-CQAs in Artemisia selengensis Turcz leaf extract

2.2 di-CQA抑制XOD的定性構(gòu)效關(guān)系研究

由表2可知，6種di-CQA抑制XOD的IC50值的大小排序為：1，4-diCQA＞別嘌醇＞1，5-diCQA＞1，3-diCQA＞4，5-diCQA＞3，4-diCQA＞3，5-diCQA，其中4，5-diCQA抑制XOD的活性大于3，4-diCQA，該結(jié)果與Chen等[23]的報道一致。1，4-diCQA抑制XOD的活性顯著高于其余5種di-CQA和陽性藥別嘌醇，說明C1和C4取代對于提高di-CQA對XOD的抑制活性至關(guān)重要。通過比較相似結(jié)構(gòu)的化合物抑制XOD的活性，可以獲得有利于di-CQA抑制XOD的活性取代位置。如從1，3-diCQA＞3，4-diCQA＞3，5-diCQA抑制XOD的效果可以得到咖啡酸的C1取代＞C4取代＞C5取代；從1，4-diCQA＞1，5-diCQA＞1，3-diCQA抑制XOD的效果中可以得到咖啡酸的C4取代＞C5取代＞C3取代。定性構(gòu)效關(guān)系表明，di-CQA不同咖啡酸取代位置對其抑制XOD的大小排序為C1取代＞C4取代＞C5取代＞C3取代。

表2 不同di-CQA抑制XOD的IC50值Table2 The IC50 of different di-CQAs on XOD inhibition

2.3 di-CQA抑制MSU誘導的IL-1β的定性構(gòu)效關(guān)系研究

IL-1β是痛風炎癥發(fā)生過程中重要的炎癥因子[20]。采用MSU刺激的LPS預(yù)孵育的THP-1巨噬細胞模型研究了6種di-CQA單體在濃度100 μmol/L時對IL-1β分泌的影響。MTT結(jié)果（圖3a）表明，在濃度100μmol/L時，不同結(jié)構(gòu)的di-CQA處理MSU刺激的LPS預(yù)孵育的THP-1巨噬細胞的存活率與對照組無顯著性差異，表明不同結(jié)構(gòu)的di-CQA對THP-1巨噬細胞無細胞毒性。圖3b所示，1，3-diCQA和3，5-diCQA在濃度100μmol/L時對MSU誘導的IL-1β分泌無抑制效果，與其它di-CQA相比，1，4-diCQA和1，5-diCQA在該濃度下抑制MSU誘導的IL-1β分泌能力更強，然而二者的抑制能力無顯著性差異。4種di-CQA在濃度100μmol/L時對MSU誘導的IL-1β分泌的抑制率分別為：1，5-diCQA（52.25%）、1，4-diCQA（46.87%）、4，5-diCQA（36.30%）和3，4-diCQA（18.96%），這表明不同咖啡酸的取代位置會影響di-CQA對MSU誘導的IL-1β分泌的抑制作用。

通過比較MSU誘導IL-1β的抑制率大小，可以獲得有利于di-CQA抑制該活性的取代位置。從1，4-diCQA＞4，5-diCQA＞3，4-diCQA抑制MSU誘導的IL-1β效果可以得到C1取代＞C5取代＞C3取代；從1，4-diCQA=1，5-diCQA抑制IL-1β的效果可以得到C4取代=C5取代；從3，4-diCQA＞3，5-diCQA抑制IL-1β的效果可以得到C4取代＞C5取代。di-CQA的不同咖啡酸取代位置對其抑制IL-1β的大小排序為C1取代＞C5取代＞C3取代，C4取代≥C5取代。

圖3 不同di-CQA對細胞存活率（a）及MSU誘導的IL-1β分泌的影響（b）Fig.3 Effects of different di-CQAs on cell viability（a）and MSU-induced IL-1βsecretion（b）

2.4 di-CQA抑制XOD與抑制MSU誘導的IL-1β的相關(guān)性分析

由表3可知，di-CQA抑制XOD的IC50與對MSU誘導的IL-1β抑制率呈顯著負相關(guān)性（P＜0.01），皮爾遜相關(guān)系數(shù)為-0.674。這表明di-CQA抑制XOD的能力與其抑制MSU誘導的IL-1β活性正相關(guān)，提示di-CQA可能通過抑制XOD發(fā)揮抑制MSU誘導的IL-1β的活性。此外，MSU引起的IL-1β分泌與活性氧水平升高、NLRP3炎癥小體的激活相關(guān)[20]。di-CQA是否也可通過作用上述信號通路達到抑制MSU誘導的IL-1β，需進一步深入研究。

表3 di-CQA抑制XOD與IL-1β的相關(guān)性分析Table3 Correlation analysis of the XOD inhibitory activity and IL-1βinhibitory activity of di-CQAs

3 結(jié)論

本研究首次發(fā)現(xiàn)了1，4-diCQA存在于藜蒿葉中。定性構(gòu)效關(guān)系表明，不同咖啡酸取代位置對di-CQA抑制XOD的影響強弱為C1取代＞C4取代＞C5取代＞C3取代；對di-CQA抑制MSU誘導的IL-1β的影響強弱為C1取代＞C5取代＞C3取代，C4取代≥C5取代。同時，di-CQA抑制XOD的活性與抑制MSU誘導的IL-1β活性具有正相關(guān)性。本研究系統(tǒng)闡釋了di-CQA化合物抑制XOD和抑制MSU誘導的IL-1β的結(jié)構(gòu)特征，提示藜蒿作為食品具有降尿酸、抗痛風炎癥的潛在應(yīng)用價值。