載紫杉醇重組高密度脂蛋白微球的制備和抗胃癌作用研究

王青 楊覓

在我國，大多胃癌患者初診即為Ⅳ期，5年生存率低于5%[1]。而現(xiàn)今的胃癌化療面臨諸多難題：首先，現(xiàn)有化學(xué)藥物治療對腫瘤無靶向性；其次，抗腫瘤療效與藥物劑量相關(guān)，全身給藥途徑不能使藥物局部濃度增加，因而效果不盡人意。載藥納米微球可通過在特定的組織細胞中駐留并緩慢釋放藥物而發(fā)揮靶向治療作用，從而達到較好的治療效果[2-4]。目前，美國食品藥品監(jiān)督管理局已批準(zhǔn)鹽酸阿霉素脂質(zhì)體等多種抗腫瘤納米藥物上市，大量抗腫瘤納米藥物也已處于臨床試驗階段[5-6]。重組高密度脂蛋白（rHDL）是一種理想的藥物載體，它與人體內(nèi)源性高密度脂蛋白（HDL）類似，可轉(zhuǎn)運疏水性藥物，具有良好的生物相容性和長循環(huán)特征，其表面的載脂蛋白Apo A-I可特異性識別靶細胞表面的受體SR-B1，通過內(nèi)吞機制將藥物靶向投遞到特定類型的細胞[7-9]。研究者們發(fā)現(xiàn)SR-B1廣泛存在于多種惡性腫瘤細胞表面，包括乳腺癌、肝癌以及卵巢癌等[10-13]。

紫杉醇（PTX）是目前常用的治療胃癌的化療藥物，但臨床使用時常伴有嚴(yán)重的毒性反應(yīng)，如骨髓抑制、超敏反應(yīng)等[14]。本研究采用一種新型無毒制備工藝進行載紫杉醇重組高密度脂蛋白（PTX-rHDL）微球的合成，觀察其理化性質(zhì)及存放穩(wěn)定性，并通過細胞及動物實驗觀察其體內(nèi)外抗腫瘤療效，以期為PTX-rHDL微球的臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.2 主要試劑 PTX原藥（批號：WS-20170913，江蘇紅豆杉藥業(yè)有限公司）；大豆卵磷脂（批號：160lPC-77，日本 TCI公司）；Apo A-Ⅰ（批號：GP20180563，美國Sigma公司）；NBD-PE（批號：171022，美國 Avati Polar Lipids公司）；胎牛血清（FBS，批號：160903，蘭州民海生物有限公司）；RPMI 1640培養(yǎng)液（批號：1900-141，美國Gibco公司）；四亞基偶氮唑藍（MTT）（批號：09052345，美國Amersco公司）；十二烷基硫酸鈉（批號：0B7103256，北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司）；四甲基二乙胺（TEMED）（批號：13M00163，北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司）；過硫酸銨（批號：0AA10211，北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司）；三羥甲基氨基甲烷（Tris）（批號：DH35-3.1，北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司）；甲叉雙丙烯酰胺（批號：0B410295，北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司）；丙烯酰胺（批號：0BD109101，北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司）；磷脂膜染料（NBD-PE）（批號：60025，美國Biotium公司）；兔抗SR-B1抗體（批號：GR149558-14，美國NOVUS Biologicals公司）；辣根過氧化物酶HPR標(biāo)記的羊抗兔IgG（批號：4413，美國Cell Signaling公司）；β-actin（批號：4970，美國Cell Signaling公司）；RIPA裂解液（批號：P0013，碧云天生物技術(shù)公司）；BCA試劑盒（批號：KGP902，南京凱基公司）；截留分子量為8 000-10 000透析袋（批號：201600307，南京大治生物科技有限公司），人胃癌細胞株MKN-45和SGC-7901（中科院上海細胞生物研究所）；乙腈（批號：PX24235D，德國 Merck公司）；鹽酸（批號：201601190，天津市大茂化學(xué)試劑廠）、無水乙醇（批號：201610530，天津市大茂化學(xué)試劑廠），水為去離子水。

1.3 實驗方法

1.3.1 PTX-rHDL微球的制備 取10mg大豆卵磷脂和1mg PTX加入2ml乙醇溶液中，攪拌5min使其完全溶解，30℃恒溫下用真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（型號：DZF-6092，上海一恒科學(xué)儀器有限公司）將溶劑吹干，制成均勻的脂質(zhì)薄膜，干燥1h；加入0.01M磷酸鹽緩沖液（PBS）（pH 7.4）10ml，水浴超聲（型號：KH-500B，昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）5h，水溫持續(xù)控制在48℃以下，形成脂質(zhì)懸液；加入0.05mg Apo A-Ⅰ，上述溶液以4℃保存過夜，再將該溶液置入透析袋，放置于以PBS中透析24h制備的微球4℃保存。通過透析法將合成的微球與游離PTX及大豆卵磷脂分離?？瞻准{米粒子的制備除去不加藥物外其余過程同上。

1.3.2 PTX-rHDL微球表征觀察 （1）穩(wěn)定性：制備的微球以4℃保存，在設(shè)定的時間點分別取出1ml微球，用動態(tài)光散射儀（型號：NanoBrook 90plus，美國Brookheave公司）測量粒徑的變化，評估穩(wěn)定性，所有結(jié)果均測定3次。（2）載藥及包封率：PTX-rHDL載藥量和包封率由高效液相色譜（型號：1260，德國Agilent公司）測定，色譜柱為Zorbax C18 柱，流動相為乙腈/水（52/48，v/v），PTX的保留時間為5.5min，測定波長為227nm，按照中國藥典固體脂質(zhì)納米包封率及載藥量公式計算。載藥率（DLC）=PTX質(zhì)量/（PTX-rHDL微球質(zhì)量）×100%。包封率（EE）=PTX實際質(zhì)量/PTX的投料量（mg）×100%。（3）PTX-rHDL微球的粒徑和形態(tài)學(xué)通過透射電鏡（型號：JEM-2010，日本電子株式會社）和動態(tài)光散射儀觀察。

1.3.3 藥物體外釋放觀察 將6ml PTX-rHDL微球置入透析袋（截留分子量為8 000～10 000Da），透析袋完全浸沒置入 80ml PBS[含 0.5%（w/v）Tween-80]，在 37℃條件下，特定的時間點（30min 及 1、4、12、50、72、96h）取出4ml釋放介質(zhì)，并替換相同體積的新的緩沖液。釋放介質(zhì)中的PTX含量由高效液相色譜法分析得，每個獨立樣本重復(fù)3次。

1.3.4 不同胃癌細胞株蛋白表達檢測 采用Western blot法。人胃癌細胞株SGC-7901和MKN-45培養(yǎng)于含有10%FBS的1640培養(yǎng)液中，置于含5%CO2的37℃培養(yǎng)箱（型號：MCO-15AC，日本 SANYO公司），加入RIPA裂解液提取蛋白質(zhì)，收集上清液后使用BCA試劑盒測定蛋白濃度。經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺電泳（Mini Protean 3 Cell，美國Bio-Rad公司），轉(zhuǎn)印于NC膜，先后加入一抗及二抗，應(yīng)用成像系統(tǒng)檢測蛋白表達（Odyssey雙色紅外熒光成像系統(tǒng)，美國LI-COR公司）。其中一抗采用兔抗SR-B1抗體，二抗采用辣根過氧化物酶HPR標(biāo)記的羊抗兔IgG。

1.3.5 細胞攝取實驗 取10mg大豆卵磷脂溶解在2ml乙醇溶液中，加入0.01%NBD-PE，攪拌5min使其完全溶解，30℃恒溫下用真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將溶劑吹干制成均勻的脂質(zhì)薄膜，干燥 1h。加入 0.01M PBS（pH 7.4）10ml，水浴超聲5h（水溫控制在48℃以下）形成脂質(zhì)懸液，加入0.05mg Apo A-Ⅰ，上述溶液4℃保存過夜。再將該溶液置入透析袋浸入PBS中透析24h。以上操作均避光進行。將人胃癌細胞株SGC-7901和MKN-45以105密度接種在六孔板中（每孔8 000個細胞），在37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h后，去除培養(yǎng)液，每個孔加入200μl上述熒光微球孵育4h，PBS沖洗3次后在熒光顯微鏡（型號：BX-51，日本Olympus公司）下觀察攝取情況。

1.3.6 細胞毒性實驗 采用MTT法評估PTX裸藥、rHDL、PTX-rHDL微球?qū)GC-7901及MKN-45細胞生長抑制作用。具體步驟為：細胞以5 000個細胞/孔的密度接種于96孔中，在37℃5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，每孔再分別加入100μl濃度為8.75μg/ml的PTX裸藥、PTX-rHDL微球、以及含有相同量大豆卵磷脂的rHDL空白微球，每個濃度設(shè)3個復(fù)孔。以加入0.9%氯化鈉溶液（NS）為對照組。與藥物作用48h后，每個孔中加入20μl 5mg/ml MTT，繼續(xù)置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h，棄去上清液，每孔加入二甲基亞砜（DMSO）200μl，置震蕩儀上震蕩10min充分混勻，采用酶標(biāo)儀（型號：ELX800，美國Biotek公司）630nm為參考波長，檢測490nm下吸光度（OD）。細胞的存活率（%）=（各實驗組OD值/對照組OD值）×100%。樣本重復(fù)3次。

7.定期總結(jié)，將同一類型的錯題做好歸類，要學(xué)會使用標(biāo)簽或符號，給相似類型的題、相關(guān)類型的題等做好標(biāo)記，以便于以后分專題復(fù)習(xí)，很多學(xué)生最缺乏的就是這一步驟。其實在每周、每月、每季度、每年的定期整理歸納時，可以專門留出錯題本的前幾頁，方便后續(xù)做一個歸類整理的目錄，這樣，在翻錯題本時就不至于茫然失措了。

1.3.7 小鼠建模及分組 在小鼠右側(cè)腋下皮下注射SGC-7901細胞培養(yǎng)液0.5ml含2×106個細胞，使用游標(biāo)卡尺測量腫瘤長短徑，按照如下公式計算腫瘤體積：V=長徑×短徑2/2。當(dāng)大部分小鼠腫瘤體積達到100～300mm3，分組評估PTX-rHDL較傳統(tǒng)化療藥物PTX是否有更好的抗腫瘤療效，以及空白rHDL是否具有抑瘤作用及生理毒性。將荷瘤小鼠隨機分為PTX-rHDL組、PTX組、NS組、rHDL組，每組5只。分別于瘤周皮下給藥0.2ml PTX-rHDL微球（含PTX濃度為10mg/kg）、0.2ml PTX（10mg/kg）、0.2ml0.9%氯化鈉溶液、0.2m空白rHDL（空白微球濃度為100mg/kg）。每3d給藥1次，共5次。

1.3.8 體內(nèi)抗腫瘤評價 在第1、4、8、11、19天測量腫瘤長短徑，并稱量小鼠體重，計算相對腫瘤體積和相對小鼠重量。相對腫瘤體積=V/V0（V是測量時腫瘤絕對體積；V0是第1天該組腫瘤平均體積）；相對小鼠體重=W/W0（W是測量時小鼠體重；W0是第1天該組小鼠平均重量）。第19天小鼠被處死，腫瘤取出稱重，并對各組小鼠的器官如心肝脾肺腎取出進行石蠟包埋后HE染色作病理檢查，評估毒性。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件。計量資料采用表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PTX-rHDL微球的合成和表征 大豆卵磷脂與PTX配比為質(zhì)量比10∶1時，PTX-rHDL微球的穩(wěn)定性最高，粒徑在8d內(nèi)無明顯變化，見圖1。PTX-rHDL微球是直徑為（60.41±1.81）nm 球形粒子，見圖 2、3。載藥率和包封率分別為（3.86±0.90）%和（95.59±0.09）%。

圖1 不同比重大豆卵磷脂/PTX微球的穩(wěn)定性

圖3 PTX-rHDL粒徑分布

2.2 PTX-rHDL微球體外釋放動力學(xué) PTX-rHDL微球呈現(xiàn)先突釋后緩釋藥物的特征，在初始的4h內(nèi)釋放了17.55%，在24h內(nèi)共釋放了約25.00%的藥物含量，由此可以發(fā)現(xiàn)，載入微球的PTX具有延遲釋放的效果，見圖4。

圖4 PTX-rHDL的藥物釋放曲線

2.3 不同胃癌細胞株SR-B1蛋白表達 SR-B1蛋白在人胃癌SGC-7901細胞株高表達，在MKN-45細胞株低表達，見圖5。

圖5 MKN-45和SGC-7901的SR-B1蛋白表達的電泳圖

2.4 胃癌細胞株對PTX-rHDL微球的攝取 SR-B1表達陽性的胃癌SGC-7901細胞株攝取大量的熒光微球，而MKN-45細胞株不攝取，見圖6（插頁）。

2.5 細胞毒性試驗 SGC-7901和MKN-45細胞株的細胞毒性試驗結(jié)果見表1，SGC-7901細胞中PTX-rHDL組的細胞存活率低于PTX組、rHDL微球組及NS組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。對于MKN-45細胞中PTX組的細胞存活率低于PTX-rHDL組、rHDL微球組及NS組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。由表1可以看出：（1）對SR-B1表達陽性或者陰性細胞株的生存，rHDL無明顯影響；（2）PTX-rHDL微球?qū)Ω弑磉_SR-B1的細胞株的毒性強于低表達SR-B1的細胞株，并且比PTX裸藥殺傷作用更強。

2.6 PTX-rHDL微球的體內(nèi)抗腫瘤作用 采用人胃癌細胞株SGC-7901小鼠皮下瘤模型來評價PTX-rHDL微球的體內(nèi)抗腫瘤作用。在第1、4、8、11、19天測量腫瘤長短徑，根據(jù)上文公式計算相對腫瘤體積，并繪制腫瘤生長曲線。第19天時，PTX組相對腫瘤體積為6.32，NS組相對腫瘤體積為10.32，PTX-rHDL微球組相對腫瘤體積為9.14。PTX-rHDL微球組與NS組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），PTX組與NS組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，這可能是因為本研究中使用了較小劑量的PTX以及采用間隔給藥模式，見圖7。而在小鼠體重上，PTX組、PTX-rHDL微球組與NS組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，見圖8。

表1 不同藥物作用于SGC-7901和MKN-45細胞株后細胞存活率（%）

圖7 4組小鼠的腫瘤體積曲線

圖8 4組小鼠體重變化曲線

所有小鼠在第19天被處死，每組的平均瘤重也被記錄并統(tǒng)計作為相對腫瘤體積的補充。PTX-rHDL微球組平均瘤重為（0.73±0.24）g，明顯小于NS組的（1.68±0.40）g（P＜0.05），以及 rHDL 組（1.56±0.25）g（P＜0.05）。PTX組平均瘤重為（1.46±0.32）g，低于 rHDL 組和 NS 組，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05），見圖9。小鼠瘤重結(jié)果與小鼠相對腫瘤體積結(jié)果一致。

圖9 4組小鼠瘤重比較（注：與PTX-rHDL比較，*P＜0.05）

小鼠心、肝、脾、肺、腎組織切片HE染色結(jié)果顯示，無明顯的病理變化，見圖10（插頁）。初步證實了PTX-rHDL微球的體內(nèi)安全性。

3 討論

PTX作為廣譜抗癌藥物具有良好的抗腫瘤活性，但溶解度低這個特性限制了PTX的應(yīng)用。rHDL在結(jié)構(gòu)上、性質(zhì)上與人體內(nèi)源性HDL相似，具有粒徑小、生物相容性高、可與脂蛋白受體特異性結(jié)合等特點，引起研究者們的廣泛關(guān)注，rHDL可以作為良好的藥物運輸載體，搭載各類型的化療藥物、小干擾核糖核酸（siRNAs）、光敏劑和顯像劑等。

本實驗采用無毒無害的原料和方法制備了PTX-rHDL微球，形態(tài)規(guī)整，粒徑在60nm左右，具有良好的穩(wěn)定性，容易保存。該大小粒徑的微球易在組織內(nèi)擴散，穿透血管內(nèi)皮進入腫瘤細胞。體外釋放試驗顯示所制備的微球具有長時的緩釋作用。SR-B1廣泛表達于多種惡性細胞表面，促進其增殖和轉(zhuǎn)移。通過對SR-B1蛋白不同表達的細胞株進行細胞攝取實驗，揭示該微球可以被SR-B1高表達的細胞株攝取，細胞毒性實驗中，PTX-rHDL微球?qū)Ω弑磉_SR-B1的SGC-7901殺傷作用是裸藥PTX的1.5倍，而在SR-B1不表達的MKN-45細胞株，PTX-rHDL微球?qū)ζ錃饔眯∮赑TX裸藥，這證實了該微球的靶向性。動物體內(nèi)實驗也證實了PTX-rHDL微球可以明顯延緩腫瘤生長。研究者們發(fā)現(xiàn)SR-B1可以作為一個潛在的生物標(biāo)志物，即不包裹任何化療藥物，也可以減緩腫瘤的生長，對腫瘤細胞有一定的殺傷作用[15]。在本研究的細胞毒性試驗中也發(fā)現(xiàn)rHDL組對細胞殺傷作用強于NS組，說明空白rHDL微球也有抗腫瘤趨勢，然而差異無統(tǒng)計學(xué)意義。PTX-rHDL微球有良好的抑瘤效果，且不良反應(yīng)并無明顯增加，這符合當(dāng)代惡性腫瘤的治療理念。

隨著生物化學(xué)、蛋白組學(xué)等學(xué)科的進一步發(fā)展，后續(xù)可將本實驗室腫瘤穿透肽iRGD通過化學(xué)修飾到微球表面實現(xiàn)雙靶向，或者聯(lián)合放療研究有無協(xié)同增效等進行更深入的探索。重組高密度脂蛋白微球作為藥物載體顯示出廣闊的應(yīng)用前景，為研究者們提供新思路和新方法。