HIF-1α和HIF-2α蛋白在宮頸癌中的表達(dá)及與預(yù)后的關(guān)系

劉艷梅 楊琪 王賽賽 應(yīng)申鵬

宮頸癌是女性第三大惡性腫瘤，病死率在世界女性癌癥中位居第四[1]。在我國(guó)，雖然隨著衛(wèi)生條件的不斷改善，宮頸癌的發(fā)病率及死亡率呈明顯下降趨勢(shì)，但是據(jù)前幾年統(tǒng)計(jì)，每年平均仍新增病例約13萬(wàn)例，占現(xiàn)有病例數(shù)的三分之一，每年因?qū)m頸癌死亡的人數(shù)有6萬(wàn)之多[2]。所以，如何提高宮頸癌的治愈率，是目前需要解決的重要課題。目前，局部晚期宮頸癌患者的標(biāo)準(zhǔn)治療模式為同步放化療，該模式雖然能使患者5年生存率提高6%，但仍有接近三分之一的患者會(huì)出現(xiàn)局部復(fù)發(fā)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。

缺氧誘導(dǎo)因子（hypoxia inducible factor，HIF）是一種異二聚體轉(zhuǎn)錄因子，由結(jié)構(gòu)同源的α亞基和共同的β亞基組成。研究發(fā)現(xiàn)，哺乳動(dòng)物中HIF主要有3種亞基（HIF-1α、HIF-2α 和 HIF-3α），而目前對(duì)于 HIF-1α 和HIF-2α蛋白研究較多。Li等[3]研究報(bào)道，缺氧環(huán)境會(huì)激活HIF，而HIF通過(guò)激活靶基因來(lái)促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及耐藥。筆者團(tuán)隊(duì)前期研究結(jié)果也提示HIF-1α和HIF-2α蛋白在宮頸癌中呈高表達(dá)[4]。本研究將進(jìn)一步探究了宮頸癌中HIF-1α和HIF-2α蛋白的表達(dá)特點(diǎn)及其與疾病預(yù)后的關(guān)系。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象 將2010年1月至2015年12月本院放療科收治的宮頸癌患者68例設(shè)為實(shí)驗(yàn)組，年齡37～90歲，平均（68.10±15.27）歲；以本院 2013年 1月至 2015年12月收治的30例宮頸良性病變患者作為對(duì)照組，年齡28～43歲，平均（35.2±4.31）歲。每例患者治療前均經(jīng)宮頸活檢留取3塊組織，以10%甲醛溶液固定，石蠟包埋，用于免疫組化檢測(cè)。所有患者取樣前均經(jīng)病理學(xué)檢查明確診斷，且未經(jīng)過(guò)放療或化療。

1.2 主要試劑 HIF-α多克隆抗體購(gòu)于Abcam公司（批號(hào)：BA09541）；免疫組化相關(guān)試劑盒及二抗均購(gòu)于北京中杉金橋公司；實(shí)驗(yàn)其他相關(guān)試劑均購(gòu)于溫州長(zhǎng)豐生物科技有限公司。

1.3 免疫組化檢測(cè)HIF-1α和HIF-2α蛋白表達(dá) 所有蠟塊標(biāo)本均行4μm切片，68℃烘烤2h，先后經(jīng)過(guò)抗原修復(fù)、封閉，依次加入一抗50～100μl（HIF-1α蛋白抗體稀釋比例1:100、HIF-2α蛋白抗體稀釋比例1:250），二抗 40～50μl，37℃孵育 1h，顯色、復(fù)染、脫水，封片后顯微鏡下觀察，由本院2位有經(jīng)驗(yàn)的病理科醫(yī)師讀片。HIF-1α和HIF-2α蛋白表達(dá)陽(yáng)性為細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核中呈棕黃色顆粒，綜合陽(yáng)性細(xì)胞所占比例及著色強(qiáng)度得出最終評(píng)分。評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)：（1）陽(yáng)性細(xì)胞評(píng)分：＜1%為0分，1%～10%為1分，11%～50%為2分，51%～80%為3分，＞80%為4分；（2）著色強(qiáng)度計(jì)分：0分（未染色），1分（弱染色），2分（中染色），3分（強(qiáng)染色）。兩個(gè)分值相加為最終評(píng)分：0～1 分（-）、2～3 分（+）、4～5 分（++）、6～7 分（+++），其中（++）和（+++）記為陽(yáng)性。

1.4 患者隨訪 詳細(xì)登記每例患者的免疫組化結(jié)果，并在治療后完成規(guī)律隨訪，詳細(xì)記錄患者復(fù)查結(jié)果[5]。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示；計(jì)數(shù)資料以百分?jǐn)?shù)表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，HIF-1α和HIF-2α蛋白表達(dá)的相關(guān)性分析采用Spearman秩相關(guān)，生存分析采用Kaplan-Meier繪制生存曲線。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HIF-1α和HIF-2α蛋白在宮頸癌和正常宮頸組織中的表達(dá) 免疫組化檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖1。實(shí)驗(yàn)組中HIF-1α及HIF-2α蛋白的陽(yáng)性率均明顯高于對(duì)照組（均P＜0.01），見(jiàn)表 1。

圖1 HIF-1α和HIF-2α蛋白在宮頸癌和正常宮頸組織中的表達(dá)（a:HIF-1α蛋白在正常宮頸組織中的表達(dá)；b：HIF-1α蛋白在宮頸癌組織中的表達(dá)；c：HIF-2α蛋白在正常宮頸組織中的表達(dá)；d：HIF-2α蛋白在宮頸癌組織中的表達(dá)；免疫組化染色，×200）

表1 兩組患者宮頸癌組織中HIF-1α和HIF-2α蛋白表達(dá)間比較[例（%）]

2.2 宮頸癌組織中HIF-1α和HIF-2α蛋白表達(dá)的相關(guān)性 68例宮頸癌組織HIF-1α和HIF-2α蛋白表達(dá)雙陽(yáng)性31例，雙陰性的9例，HIF-1α蛋白陽(yáng)性而HIF-2α蛋白陰性11例，HIF-1α蛋白陰性而HIF-2α蛋白陽(yáng)性17例，兩者表達(dá)無(wú)明顯相關(guān)性（r=0.89，P＞0.05）。

2.3 HIF-1α和HIF-2α蛋白表達(dá)與宮頸癌患者臨床病理特征的關(guān)系 HIF-1α和HIF-2α蛋白表達(dá)與宮頸癌患者的年齡、腫瘤大小、鱗狀細(xì)胞癌（squamous cell carcinoma，SCC）抗原水平均無(wú)關(guān)（均 P ＞0.05）；但與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及放療前貧血均有關(guān)（均P＜0.05），另外，HIF-2α蛋白表達(dá)與腫瘤分期亦有關(guān)（P＜0.05），見(jiàn)表2。

2.4 宮頸癌患者HIF-1α和HIF-2α蛋白表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系 截止2018年6月，HIF-1α蛋白陰性者的中位無(wú)病生存期（DFS）和總生存期（OS）分別為 79.53和80.23個(gè)月，長(zhǎng)于HIF-1α蛋白陽(yáng)性者的50.7和49.23個(gè)月，其中OS具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。HIF-2α蛋白陰性者的中位DFS和OS分別為70.57和72.77個(gè)月，長(zhǎng)于HIF-2α蛋白陽(yáng)性者的50.7和49.63個(gè)月，但均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（均P＞0.05），見(jiàn)圖2。進(jìn)一步根據(jù)HIF-1α和HIF-2α蛋白表達(dá)不同組合進(jìn)行分組比較，結(jié)果均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（均 P＞0.05），見(jiàn)表3、圖3。

表2 HIF-1α和HIF-2α蛋白表達(dá)與宮頸癌患者臨床病理特征的關(guān)系

3 討論

宮頸癌的發(fā)病率及死亡率仍然逐年攀升，嚴(yán)重威脅著女性的健康[6]。眾所周知，宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展是個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，有報(bào)道認(rèn)為氧化應(yīng)激（reactive oxygen species，ROS）在腫瘤的形成與發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[7]，腫瘤細(xì)胞均處于缺氧環(huán)境，為了維持自身繁殖，腫瘤細(xì)胞通過(guò)活化細(xì)胞信號(hào)通路以適應(yīng)缺氧狀態(tài)[8]。缺氧環(huán)境激活轉(zhuǎn)錄因子HIFs、生長(zhǎng)因子受體活化磷脂酰肌醇-3激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）等信號(hào)通路，從而使腫瘤細(xì)胞適應(yīng)缺氧環(huán)境，促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展及對(duì)治療的耐藥。筆者前期工作已初步證實(shí)，宮頸癌中HIF-1α與HIF-2α蛋白同時(shí)存在高表達(dá)，本研究在此基礎(chǔ)上，通過(guò)擴(kuò)大樣本量，深入分析它們的表達(dá)情況與宮頸癌患者臨床病理特征的關(guān)系，并進(jìn)一步分析其對(duì)宮頸癌患者預(yù)后的影響。

圖2 HIF-1α和HIF-2α蛋白陽(yáng)性與陰性表達(dá)宮頸癌患者的生存曲線

表3 HIF-1α和HIF-2α蛋白表達(dá)不同組合宮頸癌患者預(yù)后的比較

圖3 HIF-1α和HIF-2α蛋白表達(dá)不同組合宮頸癌患者的生存曲線

HIF是一組由同源的α亞基，以及共同的β亞基組成的異二聚體轉(zhuǎn)錄因子[9]，目前研究得較多的是HIF-1α和HIF-2α蛋白。HIFs可通過(guò)誘導(dǎo)腫瘤血管生成、細(xì)胞能量代謝等相關(guān)基因的表達(dá)而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生[10]。既往研究證實(shí)，大多數(shù)實(shí)體瘤中都存在HIFs高表達(dá)[11]。本研究結(jié)果顯示，宮頸癌組織中同時(shí)存在著HIF-1α和HIF-2α蛋白的高表達(dá)，再一次證實(shí)HIFs在實(shí)體瘤的發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用。HIF-1α和HIF-2α蛋白有著42%的相同氨基酸序列，但是兩者的作用機(jī)制仍然存在差別，HIF-1α蛋白主要調(diào)控血管新生，而HIF-2α蛋白主要調(diào)控血管功能。本研究再次證實(shí)了HIF-1α和HIF-2α蛋白在宮頸癌組織中的表達(dá)無(wú)相關(guān)性，與馬麗等[12]在胃癌中的研究結(jié)果一致，提示在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中，兩者可能具有不同的作用。同時(shí)，本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，HIF-1α蛋白高表達(dá)與宮頸癌患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及放療前貧血呈正相關(guān)，而與患者年齡、腫瘤大小、SCC抗原及FIGO分期等無(wú)相關(guān)關(guān)系；而HIF-2α蛋白的高表達(dá)除了與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及放療前貧血呈正相關(guān)，還與FIGO分期相關(guān)，這個(gè)結(jié)果再次提示HIFs在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中可能起著不同的作用。

除此之外，本研究還探討了HIFs的表達(dá)水平與宮頸癌患者預(yù)后的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)HIF-1α蛋白表達(dá)陽(yáng)性的患者中位DFS及OS均差于表達(dá)陰性的患者，同時(shí)OS具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。Zhang等[13]通過(guò)對(duì)236例胃癌的研究發(fā)現(xiàn)，HIF-1α蛋白在胃癌中高表達(dá)，尤其在復(fù)發(fā)的胃癌患者中表達(dá)水平較高，推測(cè)其是預(yù)后不良的指標(biāo)，可能促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展，這與本研究的結(jié)果類(lèi)似。Li等[14]在骨肉瘤中發(fā)現(xiàn)HIF-2α蛋白的高表達(dá)可能預(yù)示著預(yù)后不良，Yang等[15]對(duì)肝癌的研究卻得到了相反的結(jié)論，認(rèn)為HIF-2α蛋白的高表達(dá)與肝癌患者預(yù)后呈正相關(guān)。而本研究發(fā)現(xiàn)HIF-2α蛋白陽(yáng)性患者的DFS及OS均明顯短于陰性患者，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，這可能與本研究患者以局部晚期為主有關(guān)，下一步研究將擴(kuò)大樣本量，增加不同分期的患者再進(jìn)行分析。此外，本研究進(jìn)一步根據(jù)兩者的表達(dá)狀態(tài)將患者分為兩者雙陽(yáng)性、HIF-1α蛋白陽(yáng)性、HIF-2α蛋白陽(yáng)性、兩者雙陰性4組，進(jìn)一步比較發(fā)現(xiàn)單陽(yáng)性及兩者雙陰性的患者DFS和OS均長(zhǎng)于雙陽(yáng)性患者，但統(tǒng)計(jì)學(xué)處理提示無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，可能與分組樣本量較少有關(guān)。但是此結(jié)論初步提示HIF-1α和HIF-2α蛋白的表達(dá)可能預(yù)示著宮頸癌患者的不良預(yù)后，為今后分子水平的研究提供了一個(gè)方向[16]。

綜上所述，本研究進(jìn)一步得出結(jié)論，在宮頸癌組織中存在HIF-1α和HIF-2α蛋白的高表達(dá)，兩者的高表達(dá)可能預(yù)示著患者的預(yù)后不良，但它們?cè)趯m頸癌發(fā)生、發(fā)展中的作用以及具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。