3種經(jīng)濟(jì)頭足類(lèi)透明標(biāo)本的制作方法*

陳棟林 萬(wàn)永文 鮑鎮(zhèn)寧 王奎欽 董乃銘 鄭小東

（中國(guó)海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院 山東青島 266003）

將動(dòng)物某一器官制成半透明或透明的狀態(tài)，便于直接觀察內(nèi)部構(gòu)造，這種標(biāo)本稱(chēng)為透明標(biāo)本。與目前利用福爾馬林、酒精等保存的標(biāo)本相比，透明標(biāo)本有許多顯著的優(yōu)點(diǎn)，例如可長(zhǎng)期保存、觀賞性高等,在教學(xué)和科學(xué)普及方面都有重要的應(yīng)用價(jià)值［1-3］。在我國(guó)，透明標(biāo)本的制作技術(shù)起源于上世紀(jì)50年代［3］，制作過(guò)程主要為骨骼染色。近年來(lái),透明標(biāo)本制作技術(shù)的發(fā)展應(yīng)用范圍已擴(kuò)展至魚(yú)類(lèi)［1］、蛙類(lèi)［4］和小鼠［5］等，關(guān)于頭足類(lèi)透明標(biāo)本的制備方法國(guó)內(nèi)卻尚無(wú)報(bào)道。頭足類(lèi)是海洋軟體動(dòng)物的重要類(lèi)群，與人們的經(jīng)濟(jì)、飲食生活聯(lián)系甚廣。本文以日本槍魷、無(wú)針烏賊和短蛸3 種常見(jiàn)的頭足類(lèi)動(dòng)物為對(duì)象,探索一種成熟的頭足類(lèi)透明標(biāo)本制備方法。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 選擇新鮮、完整的頭足類(lèi)標(biāo)本作為實(shí)驗(yàn)材料。其中,選取的日本槍魷（Loliolus japonica）全長(zhǎng)7～13 cm，無(wú)針烏賊（Sepiella japonica）全長(zhǎng)7～13 cm，短蛸（Amphioctopus fangsiao）全長(zhǎng)為10～21 cm。

1.2 試劑配制方法 茜素紅溶液用1.0 g／L 茜素紅和20.0 g／L 的KOH 配制而成；番紅O 染色液采用0.1%的番紅溶液配制而成；阿利新藍(lán)染色液用1.0 g／L 阿利新藍(lán)、50%的95%酒精溶液、10%冰醋酸和40%蒸餾水配制而成；甲苯胺藍(lán)染色液用1.0 g／L 甲苯胺藍(lán)、50%的95%酒精溶液、10%冰醋酸和40%蒸餾水配制而成。分色劑用10 g／L 的KOH、20%丙三醇和80%蒸餾水配制而成。透明液用10 g／L 的KOH、50%丙三醇和50%蒸餾水配制而成。

1.3 透明標(biāo)本制備流程 透明標(biāo)本制備主要包括墨囊處理、脫水固定、腐蝕透明、染色、分色、二次透明、封裝保存等步驟。

在常溫下,用蒸餾水或自來(lái)水將頭足類(lèi)動(dòng)物表面沖洗干凈后翻至腹面,輕輕提起胴體腹面肌肉，露出墨囊，用解剖針在墨囊上刺一個(gè)小口，用針按壓墨囊，使墨汁流出，并用清水不斷沖洗，至流水不再呈黑色為止。處理過(guò)程中要盡可能保持墨囊的完整性。將處理好的頭足類(lèi)動(dòng)物平放于亞克力透明盒中，使其舒展，保持自然形態(tài)，添加95%的酒精，浸沒(méi)標(biāo)本1~2 cm，靜置2 d，較大的標(biāo)本可根據(jù)形態(tài)適當(dāng)延長(zhǎng)固定時(shí)間。

將脫水固定后的標(biāo)本放入2% KOH 中進(jìn)行透明處理。一般浸泡1~2 d，使標(biāo)本表面色素基本溶解，標(biāo)本變軟即可。按染色劑配制方法（見(jiàn)1.2）提前配制好染色劑。將標(biāo)本放入染色劑溶液中，浸泡1~2 d，使標(biāo)本完全染色。

用3%過(guò)氧化氫溶液（或市售雙氧水消毒液）對(duì)染色的標(biāo)本進(jìn)行分色，5~6 h 后,用分色劑再次對(duì)標(biāo)本進(jìn)行褪色處理2~3 d。將褪色后的標(biāo)本置于透明液中繼續(xù)透明處理2~3 周。最后將處理好的頭足類(lèi)標(biāo)本放入丙三醇中封裝保存，完成標(biāo)本制備。

2 結(jié)果

2.1 不同染色劑的染色效果 使用了茜素紅、番紅O、阿利新藍(lán)、甲苯胺藍(lán)4 種染色劑，制備的3種頭足類(lèi)動(dòng)物透明標(biāo)本效果不同，詳見(jiàn)表1。

表1 不同染色劑對(duì)日本槍魷、無(wú)針烏賊及短蛸透明標(biāo)本效果

本實(shí)驗(yàn)中使用了阿利新藍(lán)、甲苯胺藍(lán)、番紅O、茜素紅4 種染色劑,實(shí)驗(yàn)表明4 種染色劑均收效良好，能清晰地觀察到內(nèi)部結(jié)構(gòu)。但這4 種染色劑的染色效果有所不同，茜素紅、番紅O 染色較淺，容易凸顯頭足類(lèi)眼和頭部的內(nèi)部結(jié)構(gòu)；甲苯胺藍(lán)、阿利新藍(lán)染色較深，更能凸顯頭足類(lèi)觸腕、吸盤(pán)、齒的結(jié)構(gòu)。不同種類(lèi)的頭足類(lèi)染色效果也有所不同。對(duì)于日本槍魷，染色凸顯出了鰓絲、墨囊、角質(zhì)顎、眼等結(jié)構(gòu)（圖1，本文附圖見(jiàn)封四）；對(duì)于無(wú)針烏賊，染色凸顯出了白色的海螵蛸結(jié)構(gòu)（圖2）；對(duì)于短蛸，染色突出了吸盤(pán)、眼、肝臟、性腺和角質(zhì)顎等結(jié)構(gòu)（圖3）。

2.2 過(guò)氧化氫對(duì)標(biāo)本褪色效果的影響 褪色過(guò)程中，使用了不同濃度的過(guò)氧化氫（0%、1.5%及3%），它們對(duì)無(wú)針烏賊、短蛸組織影響不同，即使在過(guò)氧化氫濃度很低的情況下，無(wú)針烏賊、短蛸肌肉表面仍會(huì)出現(xiàn)大量氣泡，肌肉被嚴(yán)重腐蝕，呈現(xiàn)氧化發(fā)白的現(xiàn)象（圖4a、圖4b）。

為解決該問(wèn)題，在實(shí)驗(yàn)中使用了甘油和氫氧化鉀的混合溶液（KOH 10 g／L、20%丙三醇及80%蒸餾水）作為褪色液代替過(guò)氧化氫進(jìn)行褪色步驟。褪色48 h 后，該褪色液不僅達(dá)到過(guò)氧化氫的褪色效果（觸腕顏色變淺，能看到吸盤(pán)，頭部?jī)?nèi)的結(jié)構(gòu)逐漸顯現(xiàn)），同時(shí)避免了標(biāo)本產(chǎn)生大量氣泡和氧化發(fā)白的現(xiàn)象（圖4c）。

2.3 墨囊處理的影響 墨囊結(jié)構(gòu)較為脆弱，在標(biāo)本制備過(guò)程中容易破裂，導(dǎo)致標(biāo)本頭部被染黑，對(duì)標(biāo)本結(jié)構(gòu)的觀察造成巨大的負(fù)面影響。因此，通過(guò)在標(biāo)本固定前對(duì)墨囊進(jìn)行處理，去除墨汁（見(jiàn)制備流程1.3），可成功地避免后期墨汁流出對(duì)形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察的影響。

3 討論

3.1 染色效果 在透明魚(yú)類(lèi)標(biāo)本的制備過(guò)程中，普遍僅使用1~2 種染色劑（茜素紅或阿利新藍(lán)）。本實(shí)驗(yàn)分別使用了阿利新藍(lán)、甲苯胺藍(lán)、番紅O、茜素紅4 種染色劑進(jìn)行單獨(dú)染色,取得了較好的效果。

造成不同染色劑染色效果不同的原因多樣：1）從種類(lèi)上看，日本槍魷個(gè)體較小，肌肉層薄，容易被腐蝕透明,結(jié)構(gòu)也展現(xiàn)得最為清晰；無(wú)針烏賊、短蛸肌肉層相對(duì)較厚，堿不易穿透，透明程度稍遜一籌。2）從染色機(jī)理上看，結(jié)合位點(diǎn)的不同也造成了一定的影響。茜素紅可在堿性環(huán)境中結(jié)合鈣，從而將骨組織和其他鈣化結(jié)構(gòu)染成紅色［6］。番紅O 是一種嗜堿性陽(yáng)離子染料，能與軟骨基質(zhì)中豐富的陰離子糖胺聚糖結(jié)合成紅色［7］。甲苯胺藍(lán)是一種陽(yáng)離子染料,其基團(tuán)中的陽(yáng)離子有染色作用,能與組織細(xì)胞的酸性物質(zhì)相結(jié)合而染成藍(lán)色［8］。阿利新藍(lán)也是一種陽(yáng)離子染料，能與組織內(nèi)含有的陰離子基團(tuán)如羧基和硫酸根形成不溶性復(fù)合物［9］。3）從染料的顏色上看，阿利新藍(lán)、甲苯胺藍(lán)顏色較深，對(duì)于外部細(xì)小的結(jié)構(gòu)例如吸盤(pán)等有較好的凸顯作用，但對(duì)于肌肉層較厚的無(wú)針烏賊、短蛸的內(nèi)部結(jié)構(gòu)觀察來(lái)說(shuō)，染料本身的深顏色具有一定的遮蔽作用,因此不是觀察內(nèi)部結(jié)構(gòu)最佳的染料。番紅O 和茜素紅顏色相對(duì)較淺，經(jīng)過(guò)分色、繼續(xù)透明后能很好地顯露出頭部的內(nèi)部結(jié)構(gòu)。

3.2 褪色及透明效果 對(duì)染色后的日本槍魷、無(wú)針烏賊及短蛸進(jìn)行褪色處理,目的在于使?jié)馊镜牟糠滞手吝m當(dāng)程度，使外套膜外層肌肉染色較淺，內(nèi)部結(jié)構(gòu)染色較深（分色），更好地凸顯透明的效果。日本槍魷的褪色可參照李婷等［10］對(duì)透明魚(yú)骨骼制備中的脫色方法,使用過(guò)氧化氫對(duì)日本槍魷進(jìn)行褪色處理，但會(huì)出現(xiàn)不影響效果的少量氣泡。對(duì)于無(wú)針烏賊、短蛸，使用過(guò)氧化氫進(jìn)行褪色效果不佳。在無(wú)針烏賊、短蛸的褪色過(guò)程中，使用過(guò)氧化氫均會(huì)導(dǎo)致其表皮出現(xiàn)氧化現(xiàn)象或氣泡。本實(shí)驗(yàn)利用分色液處理48 h,不僅能避免組織氧化，而且能達(dá)到相同的脫色透明效果。

3.3 方法改進(jìn) 透明魚(yú)標(biāo)本的制備特點(diǎn)主要是將肌肉腐蝕殆盡后，再對(duì)骨骼進(jìn)行染色，從而凸顯出魚(yú)的骨架結(jié)構(gòu)［10-11］。而日本槍魷、無(wú)針烏賊及短蛸標(biāo)本中，由于骨骼等堅(jiān)硬結(jié)構(gòu)較少，不能將肌肉完全腐蝕后再染色,否則會(huì)導(dǎo)致形態(tài)不完整。因此，照搬已有的透明魚(yú)類(lèi)標(biāo)本制備方法效果不佳。頭足類(lèi)的透明標(biāo)本制作更注重將表層肌肉腐蝕透明，以突出其內(nèi)部結(jié)構(gòu)，同時(shí)以不同的染色劑進(jìn)行染色，使得標(biāo)本更具觀賞性。制備好的頭足類(lèi)標(biāo)本不僅能顯示角質(zhì)顎、觸腕等外部結(jié)構(gòu)，還能顯示海螵蛸、內(nèi)臟團(tuán)等內(nèi)部構(gòu)造，既可用于教學(xué)與科研，又可作為科普宣傳。

致謝：感謝中國(guó)海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院貝類(lèi)遺傳育種實(shí)驗(yàn)室對(duì)本項(xiàng)目的支持,感謝中國(guó)海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院姜典航、唐艷、許晨曦、南澤、陳智威等研究生在樣品采集、鑒定和實(shí)驗(yàn)操作中給予的幫助。