兩棲類心臟起搏點(diǎn)觀察實驗中剪斷法與傳統(tǒng)結(jié)扎法的比較*

司子林 李鵬飛 賈昊鑫 劉梅芳

（濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院 山東日照 276826）

1852年德國科學(xué)家Stannius（1808—1883）利用兩棲類動物心臟向他的同事演示了一個有趣的實驗［1-2］。他在腔靜脈進(jìn)入心房處作一結(jié)扎（斯氏第一結(jié)扎），可使整個心臟停跳于舒張狀態(tài)，這時只有2 條腔靜脈和靜脈竇還能搏動,用針尖輕刺心房，可引起心房收縮，心房收縮后心室也發(fā)生收縮；用針尖輕刺心室，心室可發(fā)生收縮，但是此刺激不能擴(kuò)散引起心臟其他部分發(fā)生收縮［1］。這說明蛙心的收縮最先出現(xiàn)于靜脈竇,興奮從靜脈竇傳至心房，再從心房傳至心室［1，2］。這是人類對于心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)最早的實驗研究。

Stannius 在人們對心臟的傳導(dǎo)系統(tǒng)一無所知的年代,利用這個簡單的方法證明了心臟興奮的順序和興奮的來源。故此方法被命名為斯氏結(jié)扎法（Stannius ligation），并被沿用至今。但在實際教學(xué)中發(fā)現(xiàn),斯氏結(jié)扎后心房和心室節(jié)律恢復(fù)率較低，且恢復(fù)所需時間較長。采用針刺、直流電刺激及升高溫度等方法均不能促進(jìn)自律性恢復(fù),這與早期的文獻(xiàn)報道一致［3］。本文將結(jié)扎法改為剪斷法，并對2 種方法進(jìn)行了比較。

1 實驗材料和方法

1.1 實驗動物和試劑 人工養(yǎng)殖健康蟾蜍,雌、雄不限，體重40～90 g，由濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院日照校區(qū)實驗動物中心提供。肝素鈉注射液（上海第一生化藥業(yè)有限公司），所用其他試劑均為分析純。實驗所用溶液有2 種，一種是正常任氏液（NaCl 6.50 g、KCl 0.14 g、NaHCO30.20 g、NaH2PO40.01 g、CaCl20.12 g、葡萄糖1.0 g 溶于蒸餾水1 000 mL）,另一種是添加肝素鈉的任氏液，肝素鈉濃度為10 單位／mL［4］。

1.2 儀器和設(shè)備 實驗器材包括蛙類手術(shù)器械、玻璃培養(yǎng)皿、燒杯、手術(shù)用絲線、計時器、BS224S 電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）、HH-S2數(shù)顯雙孔恒溫水浴鍋（金壇市瑞華儀器有限公司）和ZW-SX 數(shù)顯恒溫平滑肌槽（河北潤聯(lián)科技有限公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 斯氏結(jié)扎法 結(jié)扎位置如圖1所示。用金屬探針搗毀蟾蜍的腦和脊髓，將其固定于蛙板上，打開胸腔，用小鑷子將心包膜提起，用眼科剪將心包膜剪開,暴露心臟；用蛙心夾夾住心尖少量組織，提起心臟，在靜脈竇與心房間可看到半月形交界線［5］。此半月線為竇房分界線，用眼科鑷在主動脈干下方穿線備用。在進(jìn)行結(jié)扎之前記錄蟾蜍的初始心率，用玻璃分針將心尖翻向頭端，將預(yù)先穿入的結(jié)扎線在竇房分界處進(jìn)行斯氏第一結(jié)扎，阻斷靜脈竇和心房之間的傳導(dǎo),心房和心室會停止搏動,用計時器記錄心房-心室恢復(fù)搏動所需要的時間及恢復(fù)后心率。再在房室溝處進(jìn)行斯氏第二結(jié)扎,觀察心室恢復(fù)搏動所需時間及恢復(fù)后心率［5］。

圖1 蟾蜍心臟基本結(jié)構(gòu)和斯氏結(jié)扎位置示意圖

1.3.2 剪斷法及其優(yōu)化 暴露心臟的步驟及后續(xù)記錄方法同上,剪斷法即將結(jié)扎步驟改為用手術(shù)剪剪斷。暴露心臟并記錄初始心率后，用蛙心夾夾住心尖少量組織,提起心臟,用手術(shù)剪剪取心臟，注意保留完整的靜脈竇。心臟離體后立即浸入盛有任氏液的平皿中，使其處于持續(xù)搏動狀態(tài)，用小鑷子輕輕抖動心臟，促進(jìn)心腔內(nèi)血液排出；第1次剪斷沿半月線進(jìn)行，稱為竇-房分割；第2 次剪斷沿房室溝進(jìn)行，稱為房-室分割。為進(jìn)一步優(yōu)化剪斷法的孵育液,筆者觀察比較了在任氏液中添加肝素,以及通氧對心率恢復(fù)時間和心搏維持時間的影響。對照組孵育液為正常任氏液；肝素組和肝素-通氧組均使用添加10 單位／mL 肝素鈉［4］的任氏液,其中肝素-通氧組是利用平滑肌浴槽的給氣管通入空氣，根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果，通氣速度設(shè)定為90 個氣泡／min。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用PRISM 5.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。連續(xù)變量數(shù)據(jù)資料以均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，2 個組之間采用t檢驗進(jìn)行比較，多組之間采用方差分析。計數(shù)結(jié)果采用四格表或列聯(lián)表表示，用卡方獨(dú)立性檢驗進(jìn)行分析。當(dāng)P＜0.05 時認(rèn)為有統(tǒng)計學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)扎法與剪斷法的比較 對照組采用結(jié)扎法，實驗組用剪斷法。進(jìn)行斯氏第一結(jié)扎或竇-房分割后，40 min 以內(nèi)心率得以恢復(fù)的視為成功；進(jìn)行斯氏第二結(jié)扎或者房-室分割后，20 min 以內(nèi)心率得以恢復(fù)的視為成功。結(jié)果表明剪斷法的成功率顯著高于斯氏結(jié)扎法（P＜0.05），剪斷法竇-房分割成功率為83.3%,而斯氏結(jié)扎第一扎后成功率僅為47.6%（表1）。此外，剪斷法心率恢復(fù)時間顯著短于結(jié)扎法（P＜0.01），斯氏結(jié)扎法的平均恢復(fù)時間為21.0 min，而剪斷法僅為3.8 min（表2）。由結(jié)果可知,剪斷法心率恢復(fù)所需時間顯著縮短，而成功率顯著提高。但是，剪斷法的房-室分割成功率與斯氏第二扎成功率無顯著性差異（表1）。

表1 剪斷法與結(jié)扎法成功率的比較

表2 剪斷法與結(jié)扎法恢復(fù)后心率和心率恢復(fù)時間的比較

2.2 肝素和通氧對恢復(fù)時間和活性時間的影響將竇-房分割后的心臟放入不同的孵育液中記錄心率恢復(fù)時間，恢復(fù)后心率及心搏維持時間。實驗結(jié)果表明（表3），肝素組心搏持續(xù)時間為42.0 min，與對照組30.8 min 相比顯著延長（P＜0.01）。但是2個組在恢復(fù)后心率及心率恢復(fù)時間方面無統(tǒng)計學(xué)差異。肝素-通氧組的心搏持續(xù)時間為63.8 min，顯著長于對照組和肝素組（P＜0.001）。此外,肝素-通氧組恢復(fù)后心率明顯高于對照組和肝素組（P＜0.05），這表明持續(xù)通氧對于維持心肌組織細(xì)胞活性有重要意義。

表3 不同條件下竇房分割前后各項指標(biāo)的比較

3 討論

斯氏結(jié)扎法作為研究兩棲類動物心臟起搏點(diǎn)觀察最早使用的方法，簡便易行，在基礎(chǔ)設(shè)施薄弱的早期醫(yī)學(xué)及生物學(xué)教育中發(fā)揮了不可估量的作用。本研究將傳統(tǒng)的結(jié)扎法改為剪斷法，從實驗結(jié)果可知，剪斷法的成功率明顯高于結(jié)扎法，而且恢復(fù)心率時間明顯縮短。心肌是一種耗氧量很高的組織，斯氏結(jié)扎后心腔不能充盈，心肌處于缺血缺氧狀態(tài)，導(dǎo)致ATP 不足及代謝產(chǎn)物堆積，影響心肌細(xì)胞的起搏和興奮傳導(dǎo)［6-7］。早期有關(guān)蛙心的研究也表明，缺氧可顯著降低靜脈竇、心房和心室的搏動頻率［8-9］。所以結(jié)扎導(dǎo)致的缺血缺氧可能是蛙心自律性搏動難以恢復(fù)的原因之一。剪斷法將離體心臟浸入任氏液中，這能緩解心肌缺血缺氧狀態(tài)，保持組織活性。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，在孵育液中添加肝素可延長心率恢復(fù)后節(jié)律性跳動的時間，這可能與肝素抑制心肌組織內(nèi)血管發(fā)生血液凝固,改善心肌組織缺血缺氧狀態(tài)有關(guān)。結(jié)果還顯示，向肝素-任氏液中通入空氣可進(jìn)一步顯著延長心臟活性維持的時間。本研究表明，剪斷法在成功率、心率恢復(fù)時間、心搏維持時間等方面明顯優(yōu)于結(jié)扎法，值得推廣。