食品中多組分甜味劑和防腐劑同時(shí)快速測定方法的建立

程水連 何建國 盧桂英 晏許超 付柏婷

(益陽市產(chǎn)商品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，湖南 益陽 413000)

目前人工合成甜味劑和防腐劑在日常食品中的應(yīng)用范圍越來越廣泛，使用的劑量也越來越大，而且超劑量、超范圍濫用的現(xiàn)象層出不窮，為了改善口感和延長食品的保質(zhì)期，提高食品口感的穩(wěn)定性，甚至以多組分協(xié)同的形式添加。但是攝入過多的甜味劑和防腐劑會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生不良影響，對(duì)身體造成負(fù)擔(dān)、對(duì)人體的肝臟和神經(jīng)系統(tǒng)造成嚴(yán)重危害，特別是對(duì)代謝排毒能力較弱的小孩、老人和孕婦危害更加明顯，長期食用甚至?xí)掳?、致畸、損害腎功能等副作用[1]。目前食品中常用到的防腐劑主要有納他霉素、苯甲酸鈉、山梨酸鉀、脫氫乙酸鈉和雙乙酸鈉，人工合成甜味劑主要有甜蜜素、糖精鈉、安賽蜜、三氯蔗糖、阿斯巴甜和紐甜。

食品中的甜味劑和防腐劑大多采用高效液相色譜法來測定，但由于這些添加劑各自的物理、化學(xué)及光譜性質(zhì)存在差異，導(dǎo)致不能直接進(jìn)行檢測，如甜蜜素沒有紫外吸收基團(tuán)，需對(duì)其進(jìn)行衍生化才能檢測[1]，三氯蔗糖要用示差檢測器[2]，而且甜味劑和防腐劑的檢測方法一般都是單一組分測定，如GB 500.97—2016是針對(duì)食品中甜蜜素的測定，GB 22255—2014是針對(duì)食品中三氯蔗糖的測定，GB 5009.28—2016是針對(duì)食品中苯甲酸、山梨酸和糖精鈉的測定，GB/T 5009.140—2003是針對(duì)食品中安賽蜜的測定，GB 5009.263—2016是針對(duì)食品中阿斯巴甜的測定，GB 5009.247—2016是針對(duì)食品中紐甜的測定，GB/T 23377—2009是針對(duì)食品中脫氫乙酸的測定，GB/T 21915—2008是針對(duì)食品中納他霉素的測定，GB/T 23383—2009是針對(duì)食品中雙乙酸鈉的測定，這些無疑給多種甜味劑和防腐劑的同時(shí)檢測增加了難度?，F(xiàn)有的國家標(biāo)準(zhǔn)中，不利于對(duì)食品中多種甜味劑和防腐劑的大規(guī)模篩查，導(dǎo)致檢測工作量非常大，浪費(fèi)人力物力，因此有必要開發(fā)一種適用性廣、可同時(shí)快速測定、靈敏度高的高通量檢測方法，以便高效應(yīng)對(duì)甜味劑和防腐劑在食品中的濫用現(xiàn)象。

食品中甜味劑和防腐劑現(xiàn)有的測定方法有離子色譜法[2]、液相色譜法[3]、氣相色譜法[4]、分光光度法[5]等，其中以液相色譜法測定比較常見。近年來，隨著三重四級(jí)桿液質(zhì)聯(lián)用儀的使用，液質(zhì)法測定甜味劑和防腐劑的報(bào)道也逐漸增多。如：王麗娟等[6]采用高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測定葡萄酒中甜味劑、防腐劑和色素，該方法能夠滿足葡萄酒甜味劑、防腐劑和色素含量測定的分析要求；宗珊盈等[7]采用超高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測定食品中7種防腐劑和4種甜味劑，該方法為食品添加劑的測定提供了高效、準(zhǔn)確的檢測。SN/T 3538—2013中涉及了6種甜味劑的檢測，但未涉及三氯蔗糖的檢測，且樣品處理繁瑣，樣品需經(jīng)HLB固相萃取小柱凈化。GB 2760—2014中對(duì)甜蜜素、糖精鈉、安賽蜜、三氯蔗糖、阿斯巴甜、紐甜6種甜味劑和納他霉素、苯甲酸鈉、山梨酸鉀、脫氫乙酸鈉和雙乙酸鈉5種防腐劑的使用和限量都作了規(guī)定，以上這些添加劑標(biāo)準(zhǔn)一般都采用高效液相色譜法，對(duì)多種添加劑成分進(jìn)行分析時(shí)，對(duì)相鄰的色譜峰僅靠保留時(shí)間來定性不準(zhǔn)確，容易出現(xiàn)假陽性。

高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法ESI負(fù)離子模式是利用電場產(chǎn)生帶電液滴繼而通過離子蒸發(fā)分析離子的電離過程，在ESI負(fù)離子模式下采用不同的碰撞電壓對(duì)各目標(biāo)化合物產(chǎn)生的一級(jí)質(zhì)譜進(jìn)行全掃描，得到的目標(biāo)化合物的準(zhǔn)分子離子作為母離子和最佳的裂解電壓，然后使用碰撞氣使其分子離子進(jìn)行二級(jí)電離而得到各目標(biāo)化合物的子離子，確定每種待測化合物的監(jiān)測離子對(duì)，一般選離子豐度最高的兩對(duì)，一對(duì)作為定量離子對(duì)，一對(duì)作為定性離子對(duì)，再采用多反應(yīng)監(jiān)測方式(MRM)監(jiān)測相應(yīng)的離子對(duì)[8]。且ESI負(fù)離子模式通過研究化合物碎裂信息，不僅能夠解析化合物的碎裂途徑以便確認(rèn)其結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，同時(shí)也可以優(yōu)化其質(zhì)譜分析條件，為化合物及其降解產(chǎn)物的分析檢測提供了強(qiáng)有力的工具[9]。但用高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法ESI負(fù)離子模式來同時(shí)測定食品中甜蜜素、糖精鈉、安賽蜜、三氯蔗糖、阿斯巴甜、紐甜6種甜味劑和納他霉素、苯甲酸鈉、山梨酸鉀、脫氫乙酸鈉、雙乙酸鈉5種防腐劑的方法未見報(bào)道。因此有必要建立一種快速測定、準(zhǔn)確定性食品中甜味劑和防腐劑的方法。

研究擬利用高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜同時(shí)測定食品中甜蜜素、糖精鈉、安賽蜜、三氯蔗糖、阿斯巴甜、紐甜6種甜味劑和納他霉素、苯甲酸鈉、山梨酸鉀、脫氫乙酸鈉、雙乙酸鈉5種防腐劑的含量，以期為食品中添加劑的檢測提供快速、準(zhǔn)確、有效的方法。

1 材料與方法

1.1 儀器

三重四級(jí)桿液質(zhì)聯(lián)用儀：LCMS-8040型，配有電噴霧離子源(ESI)，日本島津公司；

電子分析天平：AEY-210型，湖南長沙湘儀檢測設(shè)備有限公司；

電子天平：AUW120D型，日本島津公司；

電熱恒溫水浴鍋：DZKW-D-6型，北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司；

高速分散勻質(zhì)機(jī)：FJ-200型，上海標(biāo)本模型廠；

均質(zhì)器：AVS-100型，轉(zhuǎn)速不低于20 000 r/min，天津奧特賽恩斯儀器有限公司；

離心機(jī)：TD5型，轉(zhuǎn)速不低于4 200 r/min，長沙英泰儀器有限公司；

超聲波清洗機(jī)：PS-80型，深圳潔康超聲波清洗機(jī)科技有限公司。

1.2 試劑

甜蜜素、糖精鈉、安賽蜜、三氯蔗糖、阿斯巴甜、紐甜、納他霉素、苯甲酸鈉、山梨酸鉀、脫氫乙酸鈉和雙乙酸鈉標(biāo)準(zhǔn)品：質(zhì)量分?jǐn)?shù)>90%，德國Dr.Ehrenstorfer Gmbh公司；

甲醇：色譜純，德國默克公司；

乙酸銨：色譜純，北京邁瑞達(dá)科技有限公司；

水相微孔濾膜：0.22 μm，浙江月旭科技有限公司；

亞鐵氰化鉀、乙酸鋅：分析純，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；

冰乙酸：分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

濃鹽酸、濃氨水：分析純，株洲石英化玻有限公司；

氨水(1+1)：量取50 mL濃氨水于燒杯中，加入50 mL 超純水；

鹽酸(1+1)溶液：量取50 mL濃鹽酸于燒杯中，加入50 mL超純水；

106 g/L亞鐵氰化鉀溶液：稱取106.0 g亞鐵氰化鉀，用水溶解，并稀釋至1 L；

220 g/L乙酸鋅溶液：稱取220.0 g乙酸鋅，先加30 mL 冰乙酸溶解，用水稀釋至1 L；

實(shí)驗(yàn)室用水：超純水，湖南中沃水務(wù)環(huán)?？萍加邢薰尽?/p>

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

(1) 含酒精類食品：準(zhǔn)確稱取酒樣2.000 0 g于50 mL 燒杯中，于60 ℃水浴上加熱30 min，冷卻至室溫后將其全部轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，用超純水定容至刻度并搖勻，經(jīng)0.22 μm水相微孔濾膜過濾至進(jìn)樣瓶后備用。

(2) 非蛋白質(zhì)類食品：液體樣品充分混勻，半固體樣品用高速分散勻質(zhì)機(jī)勻漿，固體樣品用粉粹機(jī)充分粉粹并混合均勻。準(zhǔn)確稱取樣品2.000 0 g于80 mL離心管中，加入10 mL甲醇超聲提取20 min，再加水10 mL超聲提取20 min，用氨水(1+1)或鹽酸(1+1)調(diào)節(jié)pH至6.5，用20 000 r/min均質(zhì)器勻漿提取5 min，在4 200 r/min 離心5 min，上清液轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中。再重復(fù)提取2次，合并上清液，用超純水定容至100 mL，經(jīng)0.22 μm水相微孔濾膜過濾至進(jìn)樣瓶后備用。

(3) 蛋白質(zhì)類食品：液體樣品充分混勻，半固體樣品用高速分散勻質(zhì)機(jī)勻漿，固體樣品用粉粹機(jī)充分粉碎并混合均勻。準(zhǔn)確稱取樣品2.000 0 g于80 mL離心管中，加入10 mL甲醇超聲提取20 min，再加水10 mL超聲提取20 min，并加2 mL亞鐵氰化鉀溶液和2 mL乙酸鋅溶液以沉淀蛋白質(zhì)，再用氨水(1+1)調(diào)節(jié)pH至6.5，用20 000 r/min 均質(zhì)器勻漿提取5 min，在4 200 r/min離心5 min，上清液轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中。再重復(fù)提取兩次，合并上清液，用超純水定容至100 mL，經(jīng)0.22 μm水相微孔濾膜過濾至進(jìn)樣瓶后備用。

1.3.2 樣品測定方法 將處理好的樣液放在自動(dòng)進(jìn)樣器的進(jìn)樣盤上，進(jìn)樣量為2 μL，數(shù)據(jù)實(shí)時(shí)分析采用LCMS8040工作站進(jìn)行采集。采用Postrun 瀏覽器軟件，外標(biāo)法定量，得出樣品中甜味劑的濃度。再根據(jù)式(1)計(jì)算樣品中各甜味劑的含量。

(1)

式中：

w——樣品中各甜味劑和防腐劑的含量，g/kg；

v——樣品液的定容體積，mL；

c——由譜圖中得出各甜味劑和防腐劑的濃度，μg/L；

m——試樣的質(zhì)量，g。

1.3.3 色譜和質(zhì)譜條件：

(1) 色譜條件：選擇Shim-pack XR-ODS III柱(75 L×2.0 mm，1.6 μm)；流速0.25 mL/min；柱溫35 ℃；流動(dòng)相B為甲醇，流動(dòng)相A為10 mmol/L乙酸銨溶液。梯度洗脫條件：0.00～1.00 min，10% B；1.00～4.00 min，10%～90% B；4.00～9.00 min，90% B；9.00～10.00 min，90%～10% B；10.00～15.00 min，10% B；15.01 min，控制器停止。

(2) 質(zhì)譜條件：選擇電噴霧離子源(ESI)；采用多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)負(fù)離子掃描；噴霧電壓4.5 kV；脫溶劑管溫度95 ℃；加熱塊溫度450 ℃；霧化氣流量15 L/min；干燥氣流量3 L/min；氬氣作為碰撞氣，碰撞氣壓力0.6～0.7 MPa。

2 結(jié)果與分析

2.1 各標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)提取離子圖譜

將標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶液按1.3.3色譜和質(zhì)譜條件進(jìn)樣，得到各組分提取離子圖譜，見圖1。

2.2 樣品前處理方法優(yōu)化

(1) 酒類樣品：酒類主要含有水和乙醇，由于乙醇的存在，會(huì)導(dǎo)致目標(biāo)化合物從色譜柱上洗脫下來的時(shí)間大大縮短，導(dǎo)致了保留時(shí)間不穩(wěn)定，從而使目標(biāo)化合物的保留時(shí)間前移，以至于目標(biāo)化合物未在所設(shè)的時(shí)間窗中，出現(xiàn)假陰性的結(jié)果。為了消除乙醇對(duì)檢測結(jié)果的影響，將酒樣于60 ℃水浴上加熱30 min以除去乙醇，再用超純水定容，最后經(jīng)0.22 μm水相微孔濾膜過濾至進(jìn)樣瓶后備用。

(2) 非蛋白類樣品：只要加入甲醇超聲，再加入水超聲，再用氨水(1+1)或鹽酸(1+1)調(diào)節(jié)pH值為6.5，離心提取并定容，最后經(jīng)0.22 μm水相微孔濾膜過濾至進(jìn)樣瓶后備用。

(3) 蛋白類樣品：由于蛋白質(zhì)的存在，會(huì)吸附一定量的目標(biāo)化合物，故先加入甲醇超聲，再加入水超聲，用亞鐵氰化鉀溶液和乙酸鋅溶液除去蛋白質(zhì)，用氨水(1+1)調(diào)節(jié)pH值為6.5，離心提取并定容，再經(jīng)0.22 μm水相微孔濾膜過濾至進(jìn)樣瓶后備用。

2.3 色譜條件的選擇

對(duì)于三重四級(jí)桿液質(zhì)聯(lián)用儀來說，流動(dòng)相的選擇不僅要考慮色譜系統(tǒng)的洗脫能力，而且還要考慮目標(biāo)化合物在質(zhì)譜中的離子化效率。由于試驗(yàn)研究的6種甜味劑和5種防腐劑，除納他霉素外，都能很好地溶于水，分別采用甲醇—水、乙腈—水為流動(dòng)相進(jìn)行比較。試驗(yàn)表明：雖然乙腈在液相中的洗脫能力比甲醇好，但是進(jìn)入質(zhì)譜系統(tǒng)后，6種甜味劑和5種防腐劑的離子化程度明顯受到抑制，離子豐度比明顯降低，導(dǎo)致靈敏度下降，說明了乙腈的離子化效率低，所以流動(dòng)相的有機(jī)相采用甲醇。

為了使6種甜味劑和5種防腐劑的離子化達(dá)到最優(yōu)靈敏度，所以進(jìn)行了以下試驗(yàn)：在水相中分別添加5 mmol/L 乙酸銨、10 mmol/L乙酸銨、20 mmol/L乙酸銨、0.1%甲酸—5 mmol/L乙酸銨，同一濃度的6種甜味劑和5種防腐劑的峰面積數(shù)據(jù)見表1。結(jié)果表明：加入10 mmol/L 乙酸銨時(shí)得到最優(yōu)的靈敏度，所以最終確定流動(dòng)相為甲醇—10 mmol/L乙酸銨的水溶液，并采用梯度洗脫，6種甜味劑和5種防腐劑在5 min內(nèi)得到了最佳分離效果，甜蜜素、糖精鈉、安賽蜜、阿斯巴甜、紐甜、三氯蔗糖、納他霉素、苯甲酸鈉、山梨酸鉀、脫氫乙酸鈉和雙乙酸鈉的保留時(shí)間見表2。結(jié)果表明：從各物質(zhì)響應(yīng)值、保留時(shí)間及離子化效率等綜合分析，甲醇—10 mmol/L乙酸銨作為流動(dòng)相時(shí)，優(yōu)于甲醇—其他濃度的乙酸銨溶液，故試驗(yàn)采用甲醇—10 mmol/L乙酸銨作為流動(dòng)相。

圖1 6種甜味劑(甜蜜素、糖精鈉、安賽蜜、三氯蔗糖、阿斯巴甜和紐甜)和5種防腐劑(納他霉素、苯甲酸鈉、山梨酸鉀、脫氫乙酸鈉和雙乙酸鈉)的提取離子色譜圖Figure 1 Extraction ion chromatography ofsix kinds of sweeteners (sodium cyclamate, saccharinsodium, acesulfame K, trichlorosucrose, aspartame and neotame) and five kinds of preservatives (natamycin, sodium benzoate, potassium sorbate, sodium dehydroacetate and sodium diacetate)

表1 流動(dòng)相組成對(duì)各甜味劑和防腐劑組分峰面積的影響Table 1 The composition of mobile phase to influence on the peak area of sweeteners and preservatives

2.4 質(zhì)譜條件的建立和定性確證

試驗(yàn)研究的6種甜味劑和5種防腐劑均是極性物質(zhì)，故采用電噴霧離子源進(jìn)行離子化。試驗(yàn)中分別采用了正、負(fù)離子模式，發(fā)現(xiàn)負(fù)離子模式下的離子化效率明顯高于正離子模式。在全掃描模式下，對(duì)于甜蜜素、安賽蜜、苯甲酸鈉、雙乙酸鈉和脫氫乙酸鈉來說，確定了M-Na作為母離子；對(duì)于糖精鈉來說，確定了M-2H2O-Na作為母離子；對(duì)于山梨酸鉀來說，確定了M-K作為母離子；對(duì)于阿斯巴甜、紐甜、三氯蔗糖和納他霉素來說，確定了M-H作為母離子，通過直接接二通的方式做了MRM自動(dòng)優(yōu)化，得到了定量離子、定性離子、Q1預(yù)桿電壓、碰撞電壓(CE)、Q3預(yù)桿電壓，優(yōu)化結(jié)果見表2。在Pro-scan掃描時(shí)，每種甜味劑選擇兩個(gè)響應(yīng)最強(qiáng)的子離子作為檢測的二級(jí)子離子，其中豐度高且穩(wěn)定的離子作為定量離子，并最終確定了甜蜜素、糖精鈉、安賽蜜、阿斯巴甜、紐甜、三氯蔗糖、納他霉素、苯甲酸鈉、山梨酸鉀、脫氫乙酸鈉和雙乙酸鈉的定量離子。

2.5 回收率和精密度

從市面上隨機(jī)選取了飲料、休閑食品(小魚仔)、糕點(diǎn)3種典型樣品，在空白樣品中分別加入3種質(zhì)量濃度的甜味劑和防腐劑標(biāo)準(zhǔn)溶液，按上述試驗(yàn)條件進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，每個(gè)添加水平重復(fù)測定6次，計(jì)算添加平均回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果見表3。從表3可以看出：6種甜味劑和5種防腐劑的平均回收率在73.4%～96.8%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在1.6%～7.8%。該方法的準(zhǔn)確度和精密度均滿足多殘留分析的要求。

2.6 方法的線性范圍和檢出限

對(duì)6種甜味劑和5種防腐劑的質(zhì)量濃度在10～1 000 μg/L 的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行了測定，得到了一系列質(zhì)量濃度的色譜圖，以各甜味劑和防腐劑的色譜峰面積y為縱坐標(biāo)，以各甜味劑和防腐劑的質(zhì)量濃度x(μg/L)為橫坐標(biāo)，作線性回歸方程，以10倍信噪比(S/N≥10)對(duì)應(yīng)的空白樣品添加質(zhì)量濃度作為方法的定量限(LOQ)，得到的線性范圍、回歸方程，線性系數(shù)R2和定量限見表4。結(jié)果表明：線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)(R2)都在0.996 以上，經(jīng)樣品添加試驗(yàn)確定空白樣品中這11種化合物的定量限為1.52～5.04 μg/kg。

表2 6種甜味劑和5種防腐劑標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的保留時(shí)間和質(zhì)譜參數(shù)Table 2 The retention time and MS parameters of six kinds of sweeteners and five kinds of preservatives

表3 不同食品中6種甜味劑和5種防腐劑的回收率和精密度試驗(yàn)Table 3 The results of the recoveries and RSDs of six kinds of sweeteners and five kinds of preservatives in different foods (n=3)

3 結(jié)論

試驗(yàn)采用HPLC-MS/MS分析技術(shù)，綜合應(yīng)用了高效液相色譜的高分離能力，利用質(zhì)譜具有質(zhì)量范圍寬、定性準(zhǔn)、高特異性和高靈敏度的特點(diǎn)，能在較短的分析時(shí)間內(nèi)對(duì)多組分進(jìn)行一次性定性和分離，建立了一種食品中多組分甜味劑和防腐劑同時(shí)快速測定的方法。研究建立了高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)對(duì)食品中甜蜜素、糖精鈉、安賽蜜、三氯蔗糖、阿斯巴甜、紐甜6種甜味劑和納他霉素、苯甲酸鈉、山梨酸鉀、脫氫乙酸鈉、雙乙酸鈉5種防腐劑進(jìn)行定性、定量的確證分析方法。其主要優(yōu)勢在于目標(biāo)分析物無需衍生且無需凈化過柱就可直接測定，縮減了樣品前處理時(shí)間，節(jié)約了試驗(yàn)成本；采用液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜分析技術(shù)，可以顯著提高結(jié)果的準(zhǔn)確性和檢測的靈敏度，同時(shí)還減少了檢測中出現(xiàn)的假陽性現(xiàn)象；彌補(bǔ)了標(biāo)準(zhǔn)只針對(duì)單個(gè)或兩種甜味劑或防腐劑檢測的不足之處。由于試驗(yàn)的6種甜味劑和5種防腐劑，除納他霉素外，均易溶于水，但納他霉素能很好地溶于甲醇，故試驗(yàn)時(shí)樣品前處理先用甲醇超聲提取后，再用水超聲、定勻、搖勻后離心靜置取上清液過濾上機(jī)即可(對(duì)于含蛋白質(zhì)的樣品還需加乙酸鋅和亞鐵氰化鉀沉淀蛋白質(zhì))。試驗(yàn)結(jié)果表明：該方法前處理簡單、分析速度快、重現(xiàn)性好、準(zhǔn)確度高和靈敏度高，有較強(qiáng)的實(shí)用性，為各類食品中多種甜味劑和防腐劑的檢測提供了一種可靠且準(zhǔn)確的方法。

表4 6種甜味劑和5種防腐劑的標(biāo)準(zhǔn)曲線參數(shù)Table 4 The calibration curve’s parameters six kinds of sweeteners and five kinds of preservatives

利用高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜分析技術(shù)建立食品中多組分食品添加劑同時(shí)測定并進(jìn)行確證的方法，將成為食品安全質(zhì)量檢測的發(fā)展方向之一，能夠滿足食品中多種甜味劑和防腐劑殘留的痕量分析要求，與國標(biāo)[10-11]方法相比，大大提高了分析效率并降低了分析成本。