潰瘍性結(jié)腸炎患者血清miR-15表達(dá)水平與炎性反應(yīng)狀態(tài)及預(yù)后的關(guān)系

潰瘍性結(jié)腸炎(UC)是一種可以損傷腸道黏膜的慢性非特異性炎性疾病[1-2]。UC的病程較長且易反復(fù)發(fā)作，常表現(xiàn)為血便、體質(zhì)量降低、高熱等[3-4]。一項長期調(diào)查發(fā)現(xiàn)，隨著UC病程延長，病情反復(fù)發(fā)作，患者癌變的風(fēng)險也隨之增加[5-6]。因此，早期明確UC的病情對于改善患者的預(yù)后至關(guān)重要。目前臨床尚缺乏敏感、準(zhǔn)確的生物學(xué)標(biāo)志物以評估患者的病情及預(yù)后。有研究表明，miR-15在細(xì)胞分化方面發(fā)揮著重要的作用[7-8]。有研究指出，miR-15與炎性反應(yīng)的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切，miR-15可調(diào)控炎性因子的表達(dá)水平[9]。UC作為一種炎性腸道疾病，其發(fā)病與炎性因子的作用密不可分，因此推測miR-15可能與UC的發(fā)生、發(fā)展存在聯(lián)系。目前有關(guān)miR-15在UC中的表達(dá)及其與UC患者預(yù)后關(guān)系的報道較少。本研究通過檢測UC患者血清miR-15的表達(dá)水平，分析其與患者炎性反應(yīng)程度及預(yù)后的關(guān)系，以期為臨床治療提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2014年1月至2017年1月遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬第三醫(yī)院及北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院收治的101例UC患者作為研究對象。所有患者的診斷均符合《中國炎癥性腸病組織病理診斷共識意見》[10]。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合UC的診斷標(biāo)準(zhǔn)；(2)入組前未接受對癥治療；(3)對本研究知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)伴有惡性腫瘤；(2)伴有嚴(yán)重心、肝、腎功能障礙；(3)妊娠期或哺乳期婦女；(4)伴有結(jié)腸狹窄、梗阻、穿孔、中毒性結(jié)腸擴(kuò)張等；(5)伴有精神疾病或認(rèn)知功能障礙，無法配合完成本研究。另選取同期50例健康體檢者作為對照組。

101例UC患者中緩解期45例，活動期56例。UC緩解期中男性23例，女性22例，平均年齡為(40.93±5.73)歲，體質(zhì)指數(shù)(BMI)為(21.37±3.48)kg/m2。UC活動期男28例，女28例，平均年齡(40.41±5.55)歲，BMI為(20.90±3.37)kg/m2。對照組中男性有22例，女性有28例，平均年齡為(38.74±5.80)歲，BMI為(22.16±4.02)kg/m2。3組受試者的性別(χ2=0.577，P=0.749)、年齡(F=1.973，P=0.143)、BMI(F=1.614，P=0.203)比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。本研究獲得醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)同意。

1.2 血清學(xué)指標(biāo)檢測

抽取受試者空腹外周靜脈血5 mL，在4 ℃下以4 000 r/min離心15 min，分離上層血清，采用速率比濁法檢測C反應(yīng)蛋白(CRP)水平，試劑盒購自北京康思潤業(yè)生物技術(shù)有限公司(批號E0516141116)；采用間接免疫熒光法檢測抗中性粒細(xì)胞胞漿抗體(ANCA)，試劑盒購自歐蒙(杭州)醫(yī)學(xué)實驗診斷有限公司(批號E0601141201)，ANCA陽性樣本逐漸稀釋至1/1024確定滴度，將滴度轉(zhuǎn)換為整數(shù)：陰性=0、1/16=1、1/32=2、1/64=3、1/128=4、1/256=5、1/512=6、1/1024=7。采用HE染色測定基底漿細(xì)胞，基底漿細(xì)胞增多指黏膜下1/3漿細(xì)胞濃密滲透。

1.3 血清miR-15相對表達(dá)量檢測

抽取受試者外周靜脈血10 mL，4 000 r/min離心15 min，分離上層血清，置于-20 ℃冰箱中待測。采用TRIzol試劑(購自美國Thermo公司，批號1405266)提取總RNA。采用TaqMan MicroRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(購自美國Thermo公司，批號1405137)合成cDNA，PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件為：95 ℃ 60 s預(yù)變性；95 ℃ 15 s，15 s退火，72 ℃ 45 s，40個循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參，用2-ΔΔCt表示miR-15的相對表達(dá)量。

表1 引物序列

1.4 炎性反應(yīng)程度評價

采用Mayo評分評價UC臨床活動度，Mayo評分≤2分為癥狀緩解，3～5分為輕度活動，6～10分為中度活動，11～12分為重度活動[11]。采用改良的Baron評分評價UC鏡下炎性反應(yīng)程度，0分為黏膜血管紋理清晰可見；1分為黏膜輕度病變，血管紋理模糊，黏膜充血但未出血；2分為中度病變，黏膜顆粒樣變化且出血；3分為重度病變，黏膜潰瘍且出血[12]。

1.5 UC活動期劃分

按照UC活動期患者臨床嚴(yán)重程度將患者分為輕度組(21例)、中度組(18例)和重度組(17例)。輕度、中度、重度的劃分標(biāo)準(zhǔn)見表2[13]。

表2 UC活動期劃分

注：中度為介于輕、重度之間

1.6 隨訪

采用電話隨訪及復(fù)診等方式對UC患者進(jìn)行為期2年的跟蹤隨訪，每月隨訪1次，記錄患者的復(fù)發(fā)情況。隨訪開展時間為2014年1月18日至2019年1月15日。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 3組受試者血清miR-15相對表達(dá)量比較

對照組、UC緩解期和UC活動期患者血清miR-15的相對表達(dá)量分別為0.42±0.07、0.64±0.11和0.97±0.13，3組受試者血清miR-15的相對表達(dá)量差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=354.262，P<0.001)。UC活動期患者血清miR-15相對表達(dá)量明顯高于UC緩解期及對照組(q=21.738，P<0.05；q=37.278，P<0.05)，UC緩解期患者血清miR-15相對表達(dá)量明顯高于對照組(q=14.120，P<0.05)。

2.2 活動期不同程度UC患者血清miR-15相對表達(dá)量、Mayo評分及Baron評分比較

3組患者血清miR-15相對表達(dá)量、Mayo評分及Baron評分組間比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)。重度組UC患者血清miR-15相對表達(dá)量、Mayo評分及Baron評分明顯高于中度組及輕度組(P<0.05)，中度組患者血清miR-15相對表達(dá)量、Mayo評分及Baron評分明顯高于輕度組(P<0.05)。見表3。

2.3 活動期UC患者血清miR-15相對表達(dá)量與Mayo評分、Baron評分的相關(guān)性分析

相關(guān)性分析顯示，血清miR-15相對表達(dá)量與Mayo評分及Baron評分均呈正相關(guān)(r=0.474，P<0.001；r=0.365，P=0.006)。見圖1。

表3 活動期不同程度UC患者血清miR-15相對表達(dá)量、Mayo評分及Baron評分比較()

注：與輕度組比較，aP<0.05；與中度組比較，bP<0.05

2.4 不同預(yù)后UC患者血清miR-15相對表達(dá)量

101例UC患者隨訪期間復(fù)發(fā)率為47.52%(48/101)，未復(fù)發(fā)率為52.48%(53/101)。復(fù)發(fā)組患者血清miR-15相對表達(dá)量為1.09±0.17，明顯高于未復(fù)發(fā)組(0.58±0.11)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=17.698，P<0.001)。

2.5 影響UC患者復(fù)發(fā)的單因素分析

兩組患者的年齡、BMI、病變位置、白細(xì)胞介素-6(IL-6)、IL-15表達(dá)的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。復(fù)發(fā)組患者中女性、基底漿細(xì)胞增多的比例高于未復(fù)發(fā)組，吸煙者比例低于未復(fù)發(fā)組，且pANCA、CRP、紅細(xì)胞沉降率水平高于未復(fù)發(fā)組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)。見表4。

圖1 活動期UC患者血清miR-15相對表達(dá)量與Mayo評分、Baron評分的散點圖 A Mayo評分 B Baron評分

表4 影響UC患者復(fù)發(fā)的單因素分析

2.6 影響UC患者復(fù)發(fā)的多因素分析

根據(jù)pANCA、CRP、紅細(xì)胞沉降率及miR-15相對表達(dá)量評估UC患者預(yù)后的最佳截斷點，并將其轉(zhuǎn)換為二分類變量。將單因素分析有統(tǒng)計學(xué)意義的因素(性別、吸煙、pANCA、CRP、紅細(xì)胞沉降率及基底漿細(xì)胞增多)作為自變量，將是否復(fù)發(fā)作為因變量納入多因素Logistic回歸分析。賦值情況：性別(女為1，男為0)；吸煙(否為1，是為0)；pANCA(≥1.85為1，<1.85為0)；CRP(≥0.31 mg/dL為1，<0.31 mg/dL為0)；紅細(xì)胞沉降率(≥13.26 mm/h為1，<13.26 mm/h為0)；基底漿細(xì)胞增多(是為1，否為0)；miR-15相對表達(dá)量(≥0.87為1，<0.87為0)；復(fù)發(fā)(是為1，否為0)。結(jié)果顯示，性別、吸煙、pANCA、基底漿細(xì)胞增多、miR-15相對表達(dá)量與UC患者復(fù)發(fā)密切相關(guān)。見表5。

表5 影響UC患者復(fù)發(fā)的多因素Logistic回歸分析

3 討論

miR-15是一種功能性miRNA，近年來大量研究指出miR-15與多種炎性疾病關(guān)系密切[14]。Zhang等[15]研究指出，miR-15在UC患者中異常表達(dá)，其能通過調(diào)節(jié)炎性因子水平參與UC的發(fā)生、發(fā)展過程。但關(guān)于miR-15與UC患者病情嚴(yán)重程度及預(yù)后的關(guān)系尚未見報道。

本研究比較了不同分期UC患者血清miR-15相對表達(dá)量，結(jié)果顯示UC活動期患者血清miR-15相對表達(dá)量明顯高于UC緩解期及對照組，提示miR-15可能與UC患者的病情存在聯(lián)系，miR-15或可作為評估UC病情的潛在生物學(xué)標(biāo)志物。本研究進(jìn)一步分析了血清miR-15相對表達(dá)量在UC活動期不同嚴(yán)重程度患者中的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)重度組患者血清miR-15相對表達(dá)量高于中度組及輕度組，推測miR-15相對表達(dá)量可能與疾病嚴(yán)重程度存在聯(lián)系。為驗證推測，本研究對血清miR-15相對表達(dá)量與Mayo評分及Baron評分之間的相關(guān)性進(jìn)行探討，結(jié)果顯示血清miR-15相對表達(dá)量與Mayo評分及Baron評分呈正相關(guān)，提示UC患者血清miR-15相對表達(dá)量與UC患者的嚴(yán)重程度及炎性反應(yīng)程度密切相關(guān)。此外，本研究對UC患者進(jìn)行為期2年的隨訪觀察，發(fā)現(xiàn)共有48例患者復(fù)發(fā)。既往研究顯示，UC反復(fù)發(fā)作會使腫瘤的發(fā)生率升高，因此早期評估影響UC患者復(fù)發(fā)的相關(guān)因素具有重要意義[16]。本研究采用多因素Logistic回歸法分析影響UC患者復(fù)發(fā)的因素，結(jié)果顯示性別、吸煙、pANCA、基底漿細(xì)胞增多與UC患者的復(fù)發(fā)密切相關(guān)，與國外報道的結(jié)論相似[17]。女性復(fù)發(fā)率高主要與情緒因素有關(guān)，精神因素能通過改變下丘腦-垂體-腎上腺軸、細(xì)菌及黏膜之間的相互作用，進(jìn)而影響?zhàn)つぱ仔约?xì)胞，導(dǎo)致UC復(fù)發(fā)。吸煙者的復(fù)發(fā)率較低，可能與香煙中尼古丁可促進(jìn)血液循環(huán)，而CO可抑制炎性反應(yīng)發(fā)生有關(guān)。pANCA及基底漿細(xì)胞增多均提示黏膜愈合時間的延長，而愈合時間越長，受到炎性因子侵襲的概率越高，復(fù)發(fā)的概率也將升高。本研究結(jié)果提示，miR-15相對表達(dá)量是UC復(fù)發(fā)的危險因素，可能與miR-15可以調(diào)節(jié)炎性因子參與UC的發(fā)生、發(fā)展過程有關(guān)。綜上所述，血清miR-15與UC患者的炎性反應(yīng)程度關(guān)系密切，監(jiān)測miR-15表達(dá)水平有助于改善患者的預(yù)后情況。