miR-29a通過(guò)調(diào)控PTEN/AKT信號(hào)通路對(duì)CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠的影響

肝纖維化是病毒性肝炎、藥物性肝損傷、脂肪肝等多種慢性肝病的共同病理過(guò)程。肝纖維化的病理機(jī)制復(fù)雜多樣，在多種致病因素的作用下，肝臟發(fā)生損傷及炎性反應(yīng)，造成肝細(xì)胞外基質(zhì)分泌增加，使細(xì)胞外基質(zhì)的生產(chǎn)和溶解失去平衡，導(dǎo)致過(guò)多的細(xì)胞外基質(zhì)在肝臟內(nèi)沉積，從而引發(fā)一系列病理改變，可進(jìn)展為肝硬化、肝功能衰竭及肝細(xì)胞癌等。肝纖維化的發(fā)病率和病死率較高，且呈逐年上升趨勢(shì)，已成為一個(gè)亟待解決的醫(yī)學(xué)問(wèn)題。有效抑制肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展對(duì)肝病的治療具有重要意義[1-3]。越來(lái)越多的研究表明，張力蛋白同源第10染色體丟失的磷酸酶基因(PTEN)在纖維化疾病的治療中具有積極作用，上調(diào)PTEN可抑制肝纖維化的發(fā)展進(jìn)程[4-5]。有研究報(bào)道，miR-29a可調(diào)控PTEN甲基化并促進(jìn)PTEN表達(dá)[6]。但目前關(guān)于miR-29a在肝纖維化中的作用報(bào)道較少。本研究旨在探究miR-29a對(duì)四氯化碳(CCl4)誘導(dǎo)的肝損傷大鼠肝纖維化的影響及其分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、儀器及試劑

本研究選取40只SPF級(jí)雄性SD大鼠，體質(zhì)量為180～220 g，由湖南天勤生物技術(shù)有限公司提供，動(dòng)物質(zhì)量合格證編號(hào)43006700005608。PCR儀(型號(hào)X-96T)購(gòu)自蘇州東勝興業(yè)科學(xué)儀器有限公司，超純總RNA提取試劑盒購(gòu)自康為世紀(jì)生物有限公司。miR-29a慢病毒質(zhì)粒購(gòu)自上海吉瑪基因股份有限公司。丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)試劑盒、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒、過(guò)氧化氫酶(CAT)試劑盒和丙二醛(MDA)試劑盒均購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。β-actin抗體購(gòu)自英國(guó)PTG公司，磷酸化蛋白激酶B(p-AKT)及PTEN抗體購(gòu)自美國(guó)abcam公司。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。引物序列見(jiàn)表1。

1.2 造模及給藥

隨機(jī)選取32只雄性SD大鼠，每只大鼠腹腔注射40%的CCl4橄欖油溶液(1 mL/kg)，1周注射2次，注射4周，建立肝纖維化大鼠模型。取2只大鼠進(jìn)行肝臟HE染色，檢測(cè)造模成功與否。將造模成功的30只大鼠隨機(jī)分為3組：肝纖維化組(B組)、NC-miRNA+肝纖維化組(C組)和miR-29a+肝纖維化組(D組)，每組10只。另取8只作為正常組(A組)。C組大鼠采用胰島素注射器通過(guò)尾靜脈注射注入NC-miRNA慢病毒空質(zhì)粒作為陰性對(duì)照，D組大鼠注入miR-29a慢病毒表達(dá)質(zhì)粒，1周1次，持續(xù)4周。采用實(shí)時(shí)定量PCR法(Real-time PCR)檢測(cè)各組miR-29a慢病毒表達(dá)質(zhì)粒的miRNA表達(dá)情況，以確保質(zhì)粒構(gòu)建成功。

表1 引物序列

1.3 血清指標(biāo)檢測(cè)

給藥結(jié)束后，分別采集各組大鼠心臟靜脈血2.5 mL，以離心半徑5 cm、轉(zhuǎn)速3 000 r/min室溫離心15 min，取上層血清并采用酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定大鼠血清中ALT、AST的含量。

1.4 肝組織病理學(xué)檢查

取肝左葉置于10%福爾馬林溶液中固定，進(jìn)行石蠟包埋、切片，將上述制備好的石蠟切片予以二甲苯Ⅰ脫蠟 15 min，再換用二甲苯Ⅱ脫蠟10 min，然后進(jìn)行梯度乙醇脫水處理，蘇木素染色5 min，用蒸餾水漂洗殘余染液5 min后予以乙醇溶液分色20 s，蒸餾水漂洗1 min后再經(jīng)1 %稀氨返藍(lán)數(shù)秒，再次用蒸餾水漂洗1 min，伊紅染色5 min，并在光鏡下進(jìn)行觀察[7]。

1.5 Real-time PCR法檢測(cè)肝臟組織中miR-29a mRNA、PTEN mRNA的表達(dá)水平

取肝組織研磨，加入 1 mL Buffer RLT，充分裂解放置 5 min。再加入200 μL氯仿，混勻30 s，靜置2 min，離心(4 ℃，12 000 r/min，10 min)后吸取上清液，采用TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit提取RNA，采用TaqMan Small RNA Assays進(jìn)行miR-29a的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，并采用相對(duì)定量法進(jìn)行miRNA水平分析，采用2-ΔΔCt法計(jì)算miR-29a mRNA、PTEN mRNA的相對(duì)表達(dá)量[8]。

1.6 Western blot法檢測(cè)肝臟組織中PTEN及p-AKT蛋白的表達(dá)情況

取肝左葉分別采用細(xì)胞核提取試劑盒及普通組織裂解液裂解肝組織，低溫離心，上清液采用BCA試劑盒進(jìn)行蛋白定量，配膠，瓊脂糖凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，一抗4 ℃過(guò)夜，二抗孵育2 h，顯影，進(jìn)行半定量分析[8]。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2.1 各組AST、ALT水平比較

4組血清中ALT、AST水平組間比較，差異均有統(tǒng)汁學(xué)意義(P均<0.05)。與A組相比，B、C、D組血清ALT、AST水平顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。D組血清中ALT、AST表達(dá)水平均低于B組和C組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠血清中AST、ALT的表達(dá)水平比較()

注：與A組比較，aP<0.05；與B組比較，bP<0.05；與C組比較，cP<0.05

2.2 肝組織HE染色結(jié)果

由圖1 HE染色結(jié)果可知，A組大鼠肝細(xì)胞形態(tài)正常，無(wú)病理性改變；B組和C組大鼠肝細(xì)胞壞死及空泡變性，有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，明顯病理性改變。D組大鼠肝小葉內(nèi)偶見(jiàn)肝細(xì)胞壞死，有少量的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。

2.3 各組miR-29a mRNA、PTEN mRNA的表達(dá)情況

各組miR-29a mRNA、PTEN mRNA水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。B、C組中miR-29a mRNA、PTEN mRNA水平均低于A組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。D組中miR-29a mRNA、PTEN mRNA的水平明顯高于B、C組，差異有統(tǒng)汁學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表3。

圖14組大鼠肝組織形態(tài)學(xué)觀察 HE染色 ×400A正常組B肝纖維化組CNC-miRNA+肝纖維化組DmiR-29a+肝纖維化組

2.4 各組大鼠p-AKT及PTEN蛋白的表達(dá)情況

各組PTEN蛋白和p-AKT蛋白表達(dá)量比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。B、C組PTEN蛋白的表達(dá)量明顯低于A組，而p-AKT蛋白的表達(dá)量明顯高于A組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。D組PTEN 蛋白的表達(dá)量明顯高于B、C組，而p-AKT蛋白的表達(dá)量明顯低于B、C組，差異有統(tǒng)汁學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖2，表4。

表3 各組miR-29a mRNA、PTEN mRNA的相對(duì)表達(dá)量比較()

注：與A組比較，aP<0.05；與B組比較，bP<0.05；與C組比較，cP<0.05

圖2 Western blot檢測(cè)結(jié)果

表4 各組大鼠肝組織中PTEN、p-AKT蛋白含量比較()

注：與A組比較，aP<0.05；與B組比較，bP<0.05；與C組比較，cP<0.05

3 討論

肝纖維化是一種嚴(yán)重威脅人類健康的疾病，是各種慢性肝病進(jìn)展為肝硬化的必經(jīng)階段，如何改善肝纖維化是當(dāng)今的研究熱點(diǎn)[9]。PTEN是目前發(fā)現(xiàn)的第1個(gè)具有蛋白磷酸酶活性及脂質(zhì)磷酸酶活性的腫瘤抑制基因。有研究表明，PTEN在大鼠肝纖維化疾病過(guò)程中起著非常重要的作用[10]。有研究指出，miR-29a具有誘導(dǎo)細(xì)胞分化，促進(jìn)細(xì)胞自噬、細(xì)胞凋亡，抑癌等作用，miR-29a的上調(diào)在結(jié)直腸癌的發(fā)生中起重要作用[11-12]。

本研究通過(guò)建立肝纖維化大鼠模型，探究miR-29a過(guò)表達(dá)后對(duì)于肝組織的病理?yè)p傷及作用機(jī)制。肝臟受到損傷時(shí)，ALT和AST會(huì)從細(xì)胞內(nèi)滲出，釋放至血液中。血清中ALT和AST含量的變化，在一定程度上能夠反映肝細(xì)胞損傷的程度。本研究結(jié)果顯示，D組大鼠血清中ALT和AST的表達(dá)水平顯著低于B、C組，提示miR-29a可減少肝纖維化中肝細(xì)胞的損傷，具有保護(hù)肝細(xì)胞的作用。PTEN可調(diào)控AKT的磷酸化，AKT磷酸化后又會(huì)反向抑制PTEN的釋放[13]。為了考察miR-29a的抗纖維化作用機(jī)制，本研究首先采用PCR法檢測(cè)了肝組織中miR-29a mRNA的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)D組的miR-29a mRNA表達(dá)水平顯著高于B、C組，表明模型建立成功。隨后，本研究采用PCR法和Western blot法檢測(cè)各組中PTEN mRNA、PTEN和p-AKT的蛋白表達(dá)水平變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)B組與C組的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示導(dǎo)入空載體對(duì)于肝損傷無(wú)明顯影響。而D組PTEN mRNA及蛋白表達(dá)量明顯高于B、C組，p-AKT及蛋白表達(dá)量則明顯降低，提示miR-29a過(guò)表達(dá)后可能通過(guò)PTEN/AKT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路作用機(jī)制對(duì)肝組織起到保護(hù)作用。

綜上所述，miR-29a過(guò)表達(dá)對(duì)肝纖維化有明顯的保護(hù)作用，其可能通過(guò)PTEN/AKT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路起作用，從而對(duì)肝纖維化起到保護(hù)作用。本研究結(jié)果提示，干預(yù)miR-29a表達(dá)有望成為臨床治療肝纖維化的新策略。今后的研究可聚焦于各信號(hào)通路之間的相互作用及上下游調(diào)節(jié)關(guān)系，以及miR-29a的主要作用靶點(diǎn)等相關(guān)內(nèi)容，以期為臨床肝纖維化的治療提供更多的新思路。