老年人動(dòng)脈硬化檢測(cè)的應(yīng)用及與血清轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1 和結(jié)締組織生長(zhǎng)因子的相關(guān)性研究

顧靜彧，吳曉，張婷，沙江明，邵榮，鄭若龍，崔俊友，殷泉忠*

近年來(lái)，心腦血管疾病成為威脅老年人健康的首位疾病。心腦血管疾病出現(xiàn)嚴(yán)重臨床癥狀前，早期會(huì)有動(dòng)脈血管結(jié)構(gòu)和功能的改變，即發(fā)生動(dòng)脈僵硬、動(dòng)脈粥樣硬化、狹窄甚至閉塞。動(dòng)脈僵硬度增加是動(dòng)脈功能病變的一種表現(xiàn)，其病理機(jī)制是膠原沉積、彈力纖維斷裂或降解及動(dòng)脈中層壞死鈣化和膠原交聯(lián)致血管過(guò)度纖維化、彈性降低［1］。早期的動(dòng)脈功能病變很少引起人們的關(guān)注，社會(huì)大眾更關(guān)注動(dòng)脈的結(jié)構(gòu)性改變，如動(dòng)脈有無(wú)斑塊形成、狹窄甚至閉塞。不管是動(dòng)脈的功能還是結(jié)構(gòu)的損害，均是心腦血管疾病干預(yù)的靶點(diǎn)，只有改善供應(yīng)靶器官動(dòng)脈的硬化程度，才能延緩和逆轉(zhuǎn)靶器官損害，最終防止終末期心腦血管事件發(fā)生。頸動(dòng)脈超聲所測(cè)的內(nèi)層中膜厚度（IMT）是觀察血管結(jié)構(gòu)改變的一個(gè)通用指標(biāo)，可進(jìn)行早期定量和定性診斷［2］。血管壁功能性改變的檢測(cè)指標(biāo)中，臂踝脈搏波傳導(dǎo)速度（BaPWV）與評(píng)估大動(dòng)脈僵硬度金指標(biāo)的頸股脈搏波傳導(dǎo)速度（cfPWV）具有良好的相關(guān)性，且因其操作簡(jiǎn)便、無(wú)創(chuàng)、可靠、重復(fù)性好的優(yōu)勢(shì)，在臨床和流行病學(xué)研究中廣泛應(yīng)用［3］?！吨袊?guó)高血壓防治指南2018 年修訂版》［4］將頸動(dòng)脈超聲、脈搏波傳導(dǎo)速度作為靶器官損害評(píng)估項(xiàng)目。結(jié)締組織生長(zhǎng)因子（CTGF）是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（TGF-β1）的直接下游效應(yīng)遞質(zhì)，兩者共同承擔(dān)誘導(dǎo)器官纖維化發(fā)生的功能，包括血管的纖維化［5］。本研究通過(guò)比較老年動(dòng)脈硬化患者與正常對(duì)照者動(dòng)脈硬化指標(biāo)（BaPWV、TGF-β1、CTGF）的差異，探討老年人動(dòng)脈硬化與TGF-β1、CTGF 之間的關(guān)系，以期利用TGF-β1、CTGF 聯(lián)合BaPWV 及頸動(dòng)脈超聲作為老年人動(dòng)脈血管病變?cè)u(píng)估和臨床療效監(jiān)測(cè)的指標(biāo)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 比較老年動(dòng)脈硬化患者與正常對(duì)照者各指標(biāo)的情況，置信水平為0.95，檢驗(yàn)功效為0.9，根據(jù)既往大型流行病學(xué)研究結(jié)果［6］可知，我國(guó)老年BaPWV 的切點(diǎn)為1 700 cm/s，正常水平為1 400 cm/s，兩樣本例數(shù)相等時(shí)，兩獨(dú)立樣本均數(shù)比較的樣本量估算 公 式［7］：n1=n2=2〔（Zα+ Zβ）×σ/δ〕2+0.25×Zα2，其中Zα及Zβ分別為Ⅰ型錯(cuò)誤概率α 和Ⅱ型錯(cuò)誤概率β 相對(duì)應(yīng)的Z 值，本研究Zα=1.96，Zβ=1.28，σ=400，σ 為研究指標(biāo)的總體標(biāo)準(zhǔn)差，約為400 cm/s，δ 為研究指標(biāo)兩總體均數(shù)的差值絕對(duì)數(shù)，為300 cm/s，根據(jù)公式計(jì)算可得n1=n2=38 例，故該研究所需樣本量最小為76 例，考慮到失訪及試驗(yàn)誤差，最終納入134 例患者。

選取2017 年9 月—2018 年9 月在江陰市人民醫(yī)院老年醫(yī)學(xué)科及心血管內(nèi)科就診的134 例老年患者，其中動(dòng)脈硬化組69 例，對(duì)照組65 例。動(dòng)脈硬化組男32 例，女37 例；年齡60～87 歲，平均年齡（71.0±7.2）歲。對(duì)照組男30 例，女35 例；年齡60～85 歲，平均年齡（69.2±5.8）歲。兩組性別、年齡比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué) 意 義（χ2=0.001，P=0.979；t=-1.573，P=0.118）。研究對(duì)象均同意參加本研究，并簽署知情同意書(shū)。本研究經(jīng)江陰市人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.1.1 納入標(biāo)準(zhǔn) 年齡≥60 歲；漢族；長(zhǎng)期居住在本地，非外來(lái)人口；無(wú)血緣關(guān)系；自愿參加本研究并簽署知情同意書(shū)。

1.1.2 排除標(biāo)準(zhǔn) 心律失常；外周動(dòng)脈硬化癥；嚴(yán)重心臟疾?。ㄈ缂毙孕募」Ｋ?、肥厚梗阻型心肌病、限制性心肌病等）；嚴(yán)重腦血管疾?。X梗死、腦出血等）；嚴(yán)重肝腎功能不全；惡性腫瘤、血液病、自身免疫性疾病、慢性結(jié)締組織病及近期（≤1 個(gè)月）有手術(shù)、創(chuàng)傷史；各種疾病急性期；應(yīng)用免疫抑制劑；因疾病無(wú)法配合調(diào)查者。

1.1.3 分組 根據(jù)《中國(guó)血管病變?cè)缙跈z測(cè)技術(shù)應(yīng)用指南（2011 第二次報(bào)告）》［8］，將動(dòng)脈硬化檢測(cè)儀所測(cè)數(shù)據(jù)與同年齡同性別標(biāo)準(zhǔn)值進(jìn)行比較分析，BaPWV ≤1 400 cm/s 為正常，BaPWV 高出標(biāo)準(zhǔn)值20%以上診斷為動(dòng)脈硬化（20%～30%為輕度，31%～50%為中度，〉50%為重度）。應(yīng)用彩色多普勒超聲診斷儀觀察頸動(dòng)脈IMT 及粥樣硬化斑塊情況，正常血管IMT 〈0.9 mm，IMT ≥0.9 mm 為增厚；粥樣硬化斑塊定義為：IMT ≥1.2 mm 或比臨近部位厚0.5 mm 或≥臨近部位IMT 的1.5 倍，或彩色圖像顯示血管腔某處血流缺損，其面積≥10 mm2［2，9］。所有斑塊的確認(rèn)必須有縱切及橫切兩個(gè)切面證實(shí)，彩色多普勒超聲檢查由專(zhuān)人操作。將BaPWV 高出標(biāo)準(zhǔn)值20%以上或頸動(dòng)脈超聲診斷有粥樣硬化斑塊者納入動(dòng)脈硬化組，其余納入對(duì)照組。

1.2 研究方法

1.2.1 一般信息采集 記錄研究對(duì)象性別、年齡、體質(zhì)指數(shù)（BMI）、血壓、慢性病等指標(biāo)。

1.2.2 生化及血清TGF-β1、CTGF 檢測(cè) 所有研究對(duì)象禁食12 h，于次日清晨空腹抽取肘靜脈血，抽血前4 h 禁煙、咖啡及大量活動(dòng)。采集5 ml 靜脈血進(jìn)行生化檢測(cè)，采用羅氏Cobas8000 c701 全自動(dòng)生化分析儀以 4 000 r/min 在20 ℃離心10 min，測(cè)定總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、尿素氮（BUN）、血肌酐（Scr）。采用液相色譜法測(cè)定糖化血紅蛋白（HbA1c）。另采集2 ml 靜脈血，將血樣保存于惰性分離膠促凝管，以3 000 r/min 離心5 min，離心半徑160 mm，分離血清后置于-80 ℃冰箱中保存，采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)血清TGF-β1、CTGF 水平，試劑盒購(gòu)自上海酶聯(lián)生物公司，TGF-β1 抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam 公司，CTGF 抗體購(gòu)自美國(guó)Mybio Source 公司，批內(nèi)及批間差異分別〈10%和〈15%，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

1.2.3 頸動(dòng)脈彩色多普勒超聲檢查及動(dòng)脈硬化檢測(cè) 采用美國(guó)ATL 公司生產(chǎn)的HDI5000 Sono CT 型彩色多普勒超聲診斷儀，探頭頻率為5～12 MHz。研究對(duì)象取仰臥位，頭部偏向檢查對(duì)側(cè)，充分暴露頸部，依次檢查雙側(cè)頸總動(dòng)脈（CCA）、頸總動(dòng)脈分叉處（BIF）、頸內(nèi)動(dòng)脈（ICA）及頸外動(dòng)脈（ECA），觀察動(dòng)脈內(nèi)膜是否光滑、有無(wú)增厚及斑塊存在，于頸總動(dòng)脈分叉前1 cm 處、BIF以及ICA、ECA 起始部1 cm 處沿血管長(zhǎng)軸測(cè)量動(dòng)脈后壁IMT，每處測(cè)量3 次，取其平均值［8］。

采用日本歐姆龍公司生產(chǎn)的全自動(dòng)動(dòng)脈硬化檢測(cè)裝置（型號(hào)BP-203RPE Ⅲ），由經(jīng)過(guò)專(zhuān)門(mén)培訓(xùn)的醫(yī)務(wù)人員測(cè)量研究對(duì)象BaPWV。當(dāng)開(kāi)始檢測(cè)時(shí)，需輸入受檢者性別、年齡、身高、體質(zhì)量等基本信息，囑研究對(duì)象取去枕仰臥位，雙手手心向上置于身體兩側(cè)，靜息 5 min，按照儀器操作標(biāo)準(zhǔn)連接四肢示波血壓袖帶、心電圖（ECG）Ⅰ導(dǎo)聯(lián)的電極及心音圖（PCG）傳感器。儀器預(yù)準(zhǔn)備，軟件實(shí)時(shí)顯示心電心音信號(hào)，等待心電心音信號(hào)穩(wěn)定后開(kāi)始測(cè)量，整個(gè)過(guò)程約5 min［7］。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用Excel 2007 軟件錄入所有數(shù)據(jù)信息，并進(jìn)行邏輯檢查。采用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。經(jīng)剔除極端值和正態(tài)性檢驗(yàn)后，TGF-β1、CTGF 呈偏態(tài)分布，其他主要研究指標(biāo)呈正態(tài)或近似正態(tài)分布。正態(tài)分布的計(jì)量資料以（±s）表示，兩組間比較采用t 檢驗(yàn)；偏態(tài)分布的計(jì)量資料以M（P25，P75）表示，兩組間比較采用秩和檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率表示，兩組間比較采用χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 動(dòng)脈硬化組與對(duì)照組基線(xiàn)資料比較 兩組BMI、舒 張 壓（DBP）、TC、TG、HDL-C、LDL-C、BUN、Scr 水平比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；動(dòng)脈硬化組收縮壓（SBP）、平均動(dòng)脈壓（MAP）、HbA1c、BaPWV 均高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，見(jiàn)表1）。

2.2 動(dòng)脈硬化組與對(duì)照組TGF-β1、CTGF 水平比較 動(dòng)脈硬化組TGF-β1 水平為76.6（63.9，90.7）ng/L，CTGF 水平為1 010.0（199.4，2 304.4）ng/L；對(duì)照組TGF-β1 水 平 為73.1（58.7，83.3）ng/L，CTGF 水 平為266.9（124.4，113.9）ng/L。動(dòng)脈硬化組和對(duì)照組TGF-β1 水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=-1.499，P=0.134）；動(dòng)脈硬化組CTGF 水平高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=-3.250，P=0.001）。

2.3 動(dòng)脈硬化組與對(duì)照組慢性病發(fā)病率比較 兩組冠心病發(fā)病率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；動(dòng)脈硬化組高血壓、糖尿病、腦血管疾病發(fā)病率高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，見(jiàn)表2）。

3 討論

TGF-β 家族包含β1～β5 5 種亞型，是由110～140個(gè)氨基酸組成的細(xì)胞外多肽借由二硫鍵組成的二聚體，亞型之間有60%～80%的同源性［10］，其在多種組織和細(xì)胞內(nèi)有表達(dá)，例如成纖維細(xì)胞、上皮細(xì)胞、骨骼及細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）、各種組織細(xì)胞等［11］。TGF-β 家族具有復(fù)雜而豐富的生物學(xué)功能，參與細(xì)胞生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移、組織修復(fù)、炎癥、血管生成、腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移［9］。TGF-β1 主要參與血管平滑肌細(xì)胞（VSMC）增殖、ECM 沉積和血管重塑，并影響血漿內(nèi)皮素（ET）的合成和血管緊張素受體拮抗劑（ARS）的相互調(diào)節(jié)。有學(xué)者認(rèn)為高血壓患者血清TGF-β1 升高的機(jī)制可能與血壓升高、血管切應(yīng)力增加及通過(guò)刺激ET 的產(chǎn)生有關(guān)［12］。

表2 動(dòng)脈硬化組與對(duì)照組慢性病發(fā)病率比較〔n（%）〕Table 2 Comparison of incidence of chronic diseases between arteriosclerosis group and normal control group

CTGF 是一種由349 個(gè)氨基酸組成，分子量為34～38 KD 的富含半胱氨酸的分泌肽。按不同的細(xì)胞類(lèi)型，CTGF 介導(dǎo)不同的生物活性，如促進(jìn)細(xì)胞有絲分裂、增殖、分化和存活，促進(jìn)細(xì)胞趨化、黏附和遷移，刺激凋亡，血管形成及膠原、纖維連接素及a5 整合素的合成等［13］。近來(lái)大量研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，CTGF 與包括血管、皮膚、心臟、腎臟、胰腺、肺及肝臟等在內(nèi)的許多組織器官纖維化發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)［14］。CTGF 是TGF-β1 的直接下游效應(yīng)遞質(zhì)，是TGF-β1 通過(guò)調(diào)控CTGF 啟動(dòng)子內(nèi)TGF-β1 反應(yīng)元件和Smad 結(jié)合元件誘導(dǎo)產(chǎn)生［15］，在許多纖維化疾病中CTGF 與TGF-β1 的表達(dá)同步增高，TGF-β1 主要在組織纖維化病變的早期表達(dá)，而CTGF 持續(xù)表達(dá)被認(rèn)為是纖維化病變緩慢進(jìn)展的重要因素［16］。本研究結(jié)果顯示，動(dòng)脈硬化組較對(duì)照組CTGF 明顯升高，而TGF-β1 升高不顯著，分析其原因，可能與本研究樣本量偏少有關(guān)，亦可能提示相較TGF-β1，檢測(cè)血清CTGF 水平更有利于判斷患者的動(dòng)脈硬化情況。

近來(lái)有研究報(bào)道，抗TGF-β 或抗Smad 的治療可以阻止纖維化的發(fā)生和發(fā)展［17］，但由于TGF-β 作用的靶細(xì)胞種類(lèi)多，效應(yīng)復(fù)雜，完全阻斷其表達(dá)或活性的后果是難以預(yù)料的。CTGF 表現(xiàn)出與TGF-β 不同的生物學(xué)活性，作用比較單一，主要介導(dǎo)TGF-β 的促纖維化作用，并且其只在間質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)，其作用也只局限于結(jié)締組織。因此，靶向CTGF 的抗纖維化治療不影響TGF-β 抗炎和調(diào)節(jié)免疫功能，是一個(gè)較阻斷TGF-β更有效和特異的靶點(diǎn)。RUPéREZ 等［18］體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，辛伐他汀和阿托伐他汀可通過(guò)阻斷RhoA 蛋白的異戊二烯化而降低由血管緊張素Ⅱ（Ang Ⅱ）誘導(dǎo)VSMC CTGF mRNA 的表達(dá)。以上研究均提示CTGF 是血管纖維化進(jìn)展中的重要環(huán)節(jié)，本研究結(jié)果亦提示老年動(dòng)脈硬化患者血清CTGF 水平明顯升高，為CTGF 參與動(dòng)脈硬化提供了分子水平的理論基礎(chǔ)。且本研究發(fā)現(xiàn)動(dòng)脈硬化患者高血壓、糖尿病及腦血管疾病發(fā)病率高于對(duì)照組，至于冠心病發(fā)病率未顯示出差異可能與受試者選擇偏倚有關(guān)。今后可利用CTGF 聯(lián)合BaPWV 及頸動(dòng)脈超聲作為老年人群動(dòng)脈血管病變?cè)u(píng)估和臨床療效監(jiān)測(cè)指標(biāo)，并且可更深入地探討CTGF 影響動(dòng)脈硬化的機(jī)制，為動(dòng)脈硬化性疾病的防治提供新思路。

表1 動(dòng)脈硬化組與對(duì)照組BMI、血壓、生化指標(biāo)及BaPWV 比較（±s）Table 1 Comparison of BMI，blood pressure，biochemical indicators and BaPWV between the arteriosclerosis group and normal control group

表1 動(dòng)脈硬化組與對(duì)照組BMI、血壓、生化指標(biāo)及BaPWV 比較（±s）Table 1 Comparison of BMI，blood pressure，biochemical indicators and BaPWV between the arteriosclerosis group and normal control group

注：BMI=體質(zhì)指數(shù)，SBP=收縮壓，DBP=舒張壓，MAP=平均動(dòng)脈壓，TC=總膽固醇，TG=三酰甘油，HDL-C=高密度脂蛋白膽固醇，LDL-C=低密度脂蛋白膽固醇，BUN=尿素氮，Scr=血肌酐，HbA1c=糖化血紅蛋白，BaPWV=臂踝脈搏波傳導(dǎo)速度

組別 例數(shù) BMI（kg/m2）SBP（mm Hg）DBP（mm Hg）MAP（mm Hg）TC（mmol/L）TG（mmol/L）HDL-C（mmol/L）LDL-C（mmol/L）BUN（mmol/L）Scr（μmol/L）HbA1c（%）BaPWV（cm/s）對(duì)照組 65 24.6±3.4 133±14 75±10 100±12 3.85±0.81 1.51±0.70 1.14±0.33 2.23±0.72 5.37±1.49 72±15 5.7±1.3 1 561±232動(dòng)脈硬化組 69 23.7±2.9 149±17 79±10 110±13 4.13±1.23 1.51±0.72 1.20±0.36 2.50±1.07 5.64±1.47 73±20 6.3±2.1 2 060±365 t 值 1.778 -5.899 -1.892 -4.846 -1.545 -0.008 -0.918 -1.652 -1.176 -0.517 -2.016 -9.495 P 值 0.078 〈0.001 0.061 〈0.001 0.125 0.994 0.360 0.101 0.246 0.606 0.046 〈0.001

作者貢獻(xiàn)：顧靜彧進(jìn)行文章的構(gòu)思與設(shè)計(jì)，統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，撰寫(xiě)論文，論文的修訂；顧靜彧、殷泉忠進(jìn)行研究的實(shí)施與可行性分析，負(fù)責(zé)文章的質(zhì)量控制及審校，對(duì)文章整體負(fù)責(zé)，監(jiān)督管理；顧靜彧、吳曉、沙江明、邵榮、鄭若龍、崔俊友負(fù)責(zé)受試者入組及樣本信息采集；張婷負(fù)責(zé)血樣預(yù)處理及血清標(biāo)本組織庫(kù)入庫(kù)出庫(kù)；顧靜彧、吳曉進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室操作及試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析處理，結(jié)果的分析與解釋。

本文無(wú)利益沖突。