兒童反復(fù)上呼吸道感染補(bǔ)充維生素D 后LL-37 水平的變化研究

王博玉，柏金秀，賈浩，湛要五，許月紅

本研究創(chuàng)新點(diǎn)：

反復(fù)上呼吸道感染是小兒常見的呼吸系統(tǒng)疾病，反復(fù)發(fā)作既影響小兒身心健康，又耗費(fèi)看護(hù)者精力。既往研究發(fā)現(xiàn)維生素D 缺乏是該病的一個(gè)重要原因，而抗菌肽LL-37 在其中起著重要作用。因此本研究前瞻性研究反復(fù)上呼吸道感染患兒補(bǔ)充維生素D 后LL-37 水平變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)反復(fù)上呼吸道感染患兒補(bǔ)充維生素D 后LL-37 水平升高，且呼吸道感染次數(shù)減少。從而進(jìn)一步證實(shí)了維生素D 抗感染作用的相關(guān)機(jī)制，對維生素D 制劑在臨床的應(yīng)用提供了更多佐證。

反復(fù)上呼吸道感染是兒科臨床常見疾病之一，該病病因較復(fù)雜，如不給予及時(shí)適當(dāng)?shù)闹委?，可能使患兒反?fù)發(fā)作、病情遷延不愈，嚴(yán)重影響小兒身心健康。既往研究顯示，維生素D 缺乏與反復(fù)上呼吸道感染有關(guān)［1］，另有研究顯示，活性維生素D 是抗菌肽LL-37 的誘導(dǎo)因子［2-3］。抗菌肽是機(jī)體固有免疫的重要組成部分，cathelicidin 是新發(fā)現(xiàn)的一種，主要存在于哺乳動物中。hCAP-18（human cathelicidin antimicrobia peptide with a molecular size 18 ku）是至今在人體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的cathelicidin家族唯一成員，hCAP-18 酶解后釋放出的C 端片段，因其N 端前兩個(gè)氨基酸殘基為亮氨酸（L）和氨基酸，總數(shù)為37，而命名為LL-37，也有文獻(xiàn)稱之為LL-37/hCAP-18［4］。LL-37 具有針對細(xì)菌、真菌、病毒、結(jié)核等多種病原的抗感染作用，并有趨化、免疫調(diào)節(jié)、促進(jìn)血管生成、參與組織修復(fù)及抗腫瘤等重要作用［5］。既往研究證明反復(fù)上呼吸道感染患兒，維生素D 缺乏是導(dǎo)致抗菌肽LL-37 下調(diào)的主要原因，而抗菌肽LL-37減少使得機(jī)體免疫力下降，從而更易發(fā)生感染［6］。目前尚缺乏針對反復(fù)上呼吸道感染患兒補(bǔ)充維生素D 治療后抗菌肽LL-37 變化的相關(guān)研究，因此本課題組對此展開研究，以期為臨床治療提供參考。

1 對象與方法

1.1 納入標(biāo)準(zhǔn) （1）1 年以內(nèi)發(fā)生上呼吸道感染次數(shù)超過參考范圍，即0～2 歲〉7 次/年、〉2～5 歲〉6 次/年、〉5～14 歲〉5 次/年，兩次感染需間隔7 d 以上［7］；（2）不存在免疫缺陷、耳部及鼻部發(fā)育異常、呼吸道慢性疾病等基礎(chǔ)疾病；（3）未接受過維生素D 及相關(guān)制劑治療。

1.2 研究對象 選取2017 年5—11 月河北大學(xué)附屬醫(yī)院門診就診的反復(fù)上呼吸道感染并存在維生素D 不足或缺乏的患兒54 例，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為試驗(yàn)組及對照組，每組各27 例。本研究得到河北大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，并得到患兒監(jiān)護(hù)人的知情同意簽字。

1.3 治療方法 試驗(yàn)組給予常規(guī)治療聯(lián)合補(bǔ)充維生素D，對照組給予常規(guī)治療聯(lián)合安慰劑。維生素D 不足或缺乏的診斷標(biāo)準(zhǔn)及治療方案參考《兒童微量營養(yǎng)素缺乏防治建議》［8］，兒童適宜的血清25-羥維生素D 水平，目前認(rèn)定為〉50.0 nmol/L，37.5～50.0 nmol/L 為維生素D不足，12.5～37.4 nmol/L 為維生素D 缺乏，〈12.5 nmol/L為維生素D 嚴(yán)重缺乏。參與研究的患兒無維生素D 嚴(yán)重缺乏者，因此補(bǔ)充維生素D 方案為：雙倍預(yù)防劑量的維生素D 補(bǔ)充劑（國藥控股星鯊制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字H35021450），即800 U/d，持續(xù)治療3～4 個(gè)月，然后恢復(fù)400 U/d 的常規(guī)補(bǔ)充劑量。安慰劑選擇去除掉維生素D 的植物油膠囊。反復(fù)上呼吸道感染診治原則參考中國醫(yī)師協(xié)會兒科醫(yī)師分會過敏專業(yè)委員會、中華醫(yī)學(xué)會兒科學(xué)分會呼吸學(xué)組、中國醫(yī)師協(xié)會兒科醫(yī)師分會風(fēng)濕免疫專業(yè)委員會及中華醫(yī)學(xué)會兒科學(xué)分會免疫學(xué)組聯(lián)合制定的《反復(fù)呼吸道感染臨床診治路徑》［7］。常規(guī)治療主要包括抗病毒及對癥支持治療，檢查提示存在細(xì)菌感染者給予抗生素，患兒均不給予免疫調(diào)節(jié)治療。

1.4 隨訪 每隔3 個(gè)月隨訪1 次，共隨訪12 個(gè)月。記錄治療前和治療后12 個(gè)月時(shí)上呼吸道感染次數(shù)，檢測血漿25-羥維生素D3及痰上清LL-37 的變化。

1.5 標(biāo)本采集及檢測方法

1.5.1 標(biāo)本采集 血標(biāo)本的采集及保存：空腹?fàn)顟B(tài)下采集靜脈血，標(biāo)本保存于普通生化管（紅帽或黃帽管）中，避光保存。

痰上清的采集及制作：用4%高滲氯化鈉溶液霧化吸入15 min 后叩擊患兒肺部，然后負(fù)壓吸引下于聲門下部吸取痰標(biāo)本，用一次性無菌小瓶留取痰液。操作使用的負(fù)壓吸引器、一次性吸痰管、消毒等物品均一致。痰液標(biāo)本保存于4 ℃冰箱或保溫桶，在1 h 內(nèi)處理，將培養(yǎng)皿中的痰液肉眼去除唾液及雜物后放置于振蕩器上混勻后取1 ml 于刻度離心管中，加入4 倍重量的0.1%二硫蘇糖醇（DTT），置于37 ℃水浴箱5 min，吹打至黏液完全溶解，2 500 r/min 離心10 min（離心半徑 13.4 cm），上清液置于-80 ℃保存。

1.5.2 檢測方法 血漿25-羥維生素D3的檢測：血液標(biāo)本離心（3 500 r/min離心10 min，離心半徑13.4 cm）后，取上清液置于干凈的離心管中，低溫運(yùn)輸和貯存（樣本穩(wěn)定性：室溫1 d，4 ℃冷藏2 d，-80 ℃冷凍30 d），送到北京和合醫(yī)學(xué)診斷技術(shù)股份有限公司進(jìn)行檢測，采用液相-串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS）。

痰上清LL-37 的檢測：采用酶聯(lián)免疫吸附（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA） 法 檢 測 抗 菌 肽LL-37，試劑盒采用進(jìn)口LL-37 專用試劑盒（批號：3213K21，Hycult Biotech，荷蘭），按試劑盒說明書要求使用聚丙烯微量離心管，乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝劑抗凝，皆-80 ℃超低溫冰箱保存。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)；計(jì)量資料以（±s）表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)，同組治療前后比較采用配對t 檢驗(yàn)；相關(guān)性分析采用Pearson 直線相關(guān)分析。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患兒基本情況比較 45 例患兒完成了隨訪，試驗(yàn)組23 例，對照組22 例。兩組患兒性別及年齡比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，見表1）。

2.2 兩組患兒治療前后上呼吸道感染次數(shù)、血漿25-羥維生素D3及痰上清LL-37 比較 治療前，兩組患兒上呼吸道感染次數(shù)、血漿25-羥維生素D3及痰上清LL-37 水平比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；治療后12 個(gè)月，試驗(yàn)組患兒上呼吸道感染次數(shù)少于對照組，血漿25-羥維生素D3、痰上清LL-37 水平高于對照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。對照組患兒治療前后上呼吸道感染次數(shù)、血漿25-羥維生素D3及痰上清LL-37水平比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；試驗(yàn)組患兒治療后12 個(gè)月上呼吸道感染次數(shù)少于治療前，血漿25-羥維生素D3、痰上清LL-37 水平高于治療前，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，見表2）。

表1 兩組患兒性別及年齡比較Table 1 Comparison of sex and age between two groups

2.3 試驗(yàn)組治療后12 個(gè)月血漿25-羥維生素D3與痰上清LL-37 相關(guān)性分析 試驗(yàn)組治療后12 個(gè)月血漿25-羥維生素D3與痰上清LL-37 呈正相關(guān)（r=0.505，P＜0.05，見圖1）。

3 討論

隨著兒童保健事業(yè)的規(guī)范化進(jìn)程，人們普遍認(rèn)為維生素D 缺乏的問題已經(jīng)得到了解決，但流行病學(xué)調(diào)查卻顯示，全球大約有10 億人存在維生素D 缺乏或不足；我國維生素D 缺乏嚴(yán)重，不同地區(qū)之間不均衡，北方地區(qū)兒童維生素D 缺乏占30%～70%，南方地區(qū)兒童維生素D 缺乏占10%～40%［9］。維生素D 缺乏與很多疾病的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。

圖1 試驗(yàn)組治療后12 個(gè)月血漿25-羥維生素D3 與痰上清LL-37 相關(guān)性分析Figure 1 Correlation between plasma 25-hydroxyvitamin D3 and sputum supernatant LL-37 after 12-month treatment in the experimental group

表2 兩組患兒治療前后上呼吸道感染次數(shù)、血漿25-羥維生素D3 及痰上清LL-37 比較（±s）Table 2 Comparison of the episodes of upper respiratory tract infections，plasma 25-hydroxyvitamin D3，and LL-37 in sputum supernatant before and after treatment between two groups

表2 兩組患兒治療前后上呼吸道感染次數(shù)、血漿25-羥維生素D3 及痰上清LL-37 比較（±s）Table 2 Comparison of the episodes of upper respiratory tract infections，plasma 25-hydroxyvitamin D3，and LL-37 in sputum supernatant before and after treatment between two groups

注：與同組治療前比較，aP＜0.05

組別 例數(shù) 上呼吸道感染次數(shù)（次） 25-羥維生素D3（μg/L） LL-37（μg/L）治療前 治療后12 個(gè)月 治療前 治療后12 個(gè)月 治療前 治療后12 個(gè)月對照組 22 8.4±1.5 8.4±1.3 26.6±5.7 30.5±5.3 5.7±3.0 5.8±3.2試驗(yàn)組 23 8.3±1.3 5.1±1.3a 28.2±4.9 65.3±8.2a 6.3±3.3 10.8±4.8a t 值 -0.246 8.624 1.003 16.796 0.602 4.069 P 值 0.806 〈0.001 0.321 〈0.001 0.551 〈0.001

反復(fù)上呼吸道感染是小兒的常見病及多發(fā)病，經(jīng)常反復(fù)發(fā)作或遷延不愈，嚴(yán)重影響小兒身心健康。既往研究證明維生素D 缺乏是該病的一個(gè)重要原因［10］，補(bǔ)充維生素D 有助于病情好轉(zhuǎn)［11］，但其作用機(jī)制尚不完全清楚。有研究顯示，LL-37 是維生素D 的下游因子，維生素D 受體（vitamin D receptor，VDR）作為核受體家族中的一員，在調(diào)節(jié)LL-37 生成中起著重要作用。1，25-二羥維生素D〔1，25-（OH）2D〕與VDR 結(jié)合，之后再與維甲酸X 受體（retinoid X receptor，RXR）形成異源二聚體，轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)，識別靶基因啟動子區(qū)域中的維生素D 反應(yīng)元件（vitamin D responsive elements，VDRE），最終促進(jìn)目標(biāo)基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。編碼LL-37 的基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游存在VDRE 序列，因而維生素D 可以促進(jìn)LL-37 的編碼基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄［12］。LL-37 對細(xì)菌、真菌、病毒等具有廣譜抗菌活性，針對不同物種和菌株具有殺滅微生物活性［13］。因而推測，維生素D 缺乏可能會導(dǎo)致LL-37 的減少，從而使得機(jī)體抗炎作用減弱，更易感染，這可能是維生素D 缺乏導(dǎo)致反復(fù)上呼吸道感染的機(jī)制之一。

羅光燕等［6］研究證實(shí)，反復(fù)上呼吸道感染患兒體內(nèi)LL-37 表達(dá)下調(diào)，并且這一現(xiàn)象與維生素D 缺乏有關(guān)。那么給予反復(fù)上呼吸道感染患兒補(bǔ)充維生素D，是否會引起LL-37 的增多，并且減輕呼吸道感染次數(shù)，針對這一問題，本研究進(jìn)行了前瞻性研究。

維生素D 的主要作用是調(diào)節(jié)鈣磷代謝和維持骨平衡，90%來源于皮膚中的7-脫氫膽固醇經(jīng)日光紫外線照射轉(zhuǎn)化的維生素D3。維生素D3首先在肝臟被羥化為25-羥維生素D3，這是在外周血存在的主要形式；之后在腎臟進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為1，25-二羥維生素D3，這是維生素D 發(fā)揮生物活性的主要形式。為了評估維生素D 含量，一般測量外周血25-羥維生素D3水平來實(shí)現(xiàn)。LL-37廣泛分布于人體的血液細(xì)胞和上皮細(xì)胞中，主要分布于粒細(xì)胞，如中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、B細(xì)胞，以及睪丸、消化道、呼吸道和皮膚的上皮細(xì)胞［13］。因此本研究采集痰上清液中的LL-37 進(jìn)行檢測以了解其含量。

本研究采用了安慰劑對照研究，試驗(yàn)組給予常規(guī)治療聯(lián)合補(bǔ)充維生素D，對照組采用常規(guī)治療聯(lián)合安慰劑。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)比較，兩組患兒一般資料及治療前上呼吸道感染次數(shù)、血漿25-羥維生素D3、痰上清LL-37 水平比較無差異。這樣保證了試驗(yàn)組和對照組在相同的條件下開始治療。治療后12 個(gè)月，試驗(yàn)組患兒上呼吸道感染次數(shù)少于對照組，血漿25-羥維生素D3、痰上清LL-37水平高于對照組，說明維生素D 的治療確實(shí)有助于反復(fù)上呼吸道感染患兒病情好轉(zhuǎn)，而這種作用可能與維生素D 促進(jìn)LL-37 產(chǎn)生增加有關(guān)。進(jìn)一步進(jìn)行相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)試驗(yàn)組治療后12 個(gè)月血漿25-羥維生素D3與痰上清LL-37 呈正相關(guān)，進(jìn)一步佐證了補(bǔ)充維生素D 有助于LL-37 產(chǎn)生增加。

綜上所述，本研究采用了前瞻性隊(duì)列研究，在小范圍人群中給予維生素D 補(bǔ)充劑，證明補(bǔ)充維生素D可減輕反復(fù)上呼吸道感染的病情，而這一作用可能與LL-37 的產(chǎn)生增多有關(guān)。但本研究樣本量少，尚需擴(kuò)大研究對象，在更廣泛的人群中進(jìn)行推廣。

作者貢獻(xiàn)：王博玉、賈浩進(jìn)行文章的構(gòu)思與設(shè)計(jì)，結(jié)果的分析與解釋，撰寫論文，論文的修訂，負(fù)責(zé)文章的質(zhì)量控制及審校，對文章整體負(fù)責(zé)，監(jiān)督管理；王博玉、柏金秀、賈浩進(jìn)行研究的實(shí)施與可行性分析；王博玉、柏金秀、賈浩、湛要五、許月紅進(jìn)行數(shù)據(jù)收集；賈浩、湛要五進(jìn)行數(shù)據(jù)整理；王博玉進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。

本文無利益沖突。