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    甘草次酸抑制骨肉瘤細胞MG63增殖的NF-κB信號通路機制*

    2020-03-05 03:58:12劉培敏杜向陽李鳳巖林大勇
    關(guān)鍵詞:次酸孔板孵育

    董 嵩, 劉培敏, 杜向陽, 李鳳巖, 曹 營, 林大勇, 白 劍

    ((1. 朝陽市第二醫(yī)院, 遼寧 朝陽, 122000; 2. 遼寧中醫(yī)藥大學(xué), 沈陽 110847)

    骨肉瘤是青少年多發(fā)的骨科惡性腫瘤之一,其容易發(fā)生早期的轉(zhuǎn)移,病情進展迅速,愈后不良[1]。由于骨肉瘤增長迅速,因此需要對骨肉瘤進行有效的以化療為主,在條件成熟后進行手術(shù)切除。但是化療有著極大的副作用,臨床急切需要尋找一種副作用低、容易獲取、療效好的新型藥物用于骨肉瘤的輔助治療。

    核轉(zhuǎn)錄因子κB (nuclear factor κB, NF-κB)蛋白是一個表達于多種細胞中的多效性轉(zhuǎn)錄因子家族,正常情況下NF-κB處于非活化的狀態(tài),但在炎癥、腫瘤和免疫功能改變的情況下NF-κB基因發(fā)生活化并導(dǎo)致其所編碼的蛋白明顯升高。有研究表明,骨肉瘤的增殖與NF-κB蛋白的表達呈正相關(guān),在骨肉瘤的轉(zhuǎn)移、侵襲過程中NF-κB蛋白也起到促進作用[2]。甘草具有補脾益氣、祛痰止咳、緩急止痛、清熱解毒、調(diào)和諸藥等功效。甘草酸是發(fā)揮其藥理活性的重要有效成分之一,甘草酸進入體內(nèi)后可以水解為甘草次酸和甘草黃酮等活性成分,其中甘草次酸具有的抑制腫瘤細胞生長的藥理學(xué)作用[3]。本研究在此基礎(chǔ)上,通過體外細胞培養(yǎng)的方法,觀察甘草次酸對骨肉瘤細胞MG63增殖的抑制作用,并分析可能的機制,

    1 材料與方法

    1.1 材料和儀器

    甘草次酸購買于梯希愛(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司(產(chǎn)品標號:S0988,HPLC ≥98%);甘草次酸和甲基四氮唑藍(TOX1-1KT)和白藜蘆醇(R5010)購買于SIGMA-ALDRICH中國有限公司;骨肉瘤細胞MG63購買于北京鼎國昌盛生物科技有限公司;DMEM培養(yǎng)液購買于美國Gene公司;胰酶和Hyclone小牛血清購買美國Thermo scientific公司;Annexin V/PI凋亡檢測試劑盒購買于美國BD公司;NF-κB抗體買于美國Santa Cruze生物技術(shù)公司;測其余分析純試劑購買于國藥集團北京分公司。低速離心機購(型號:H1650)買于湖南湘儀儀器裝備有限公司;流式細胞儀(型號:FACSCalibur)購買于美國BD公司;CO2培養(yǎng)箱(型號:Form 311)購買于美國Thermo公司;酶標儀(型號:SpectraMax 190)和垂直系列電泳槽(型號:165-8001)購買于美國Bio-Rad公司。

    1.2 實驗分組設(shè)計與處理方法[4]

    本實驗采用骨肉瘤MG63細胞做為研究對象,共分5組??瞻捉M、甘草次酸組(50 μmol/L, 100 μmol/L,200 μmol/L)、陽性對照組。當(dāng)細胞進入生長平臺期后使用 0.1%的胰酶消化并按1×106cells/ml的密度接種于96孔板中進行MTT試驗。將骨肉瘤細胞MG63用PBS沖洗2次后,加入 1.25%的胰酶消化3 min后,加入含有10%血清的DMEM培養(yǎng)基,將細胞按照1×106cells/ml的密度接種于96孔板中進行MTT試驗。將MG63細胞按照1×108cells/ml的密度接種于6孔板中進行流式細胞檢測和蛋白質(zhì)印跡檢測,待細胞貼壁后繼續(xù)培養(yǎng)24 h,直至細胞的融合度接近90%。棄去上清,6孔板中加入不含血清的DMEM培養(yǎng)基,陽性對照組中加入白藜蘆醇40 μmol/L,實驗組中加入濃度分別為50 μmol/L、100 μmol/L和200 μmol/L的甘草次酸,空白組為不含有甘草次酸的DMEM培養(yǎng)基,在5%的二氧化碳培養(yǎng)箱中孵育24 h和48 h。

    1.3 MTT方法檢測各組細胞的增值率

    將接種于96孔板的用于MTT試驗的MG63細胞取出,棄去上清液,用PBS沖洗2次,在每個孔中加入50 μl的含有MTT濃度為5 g/L的PBS溶液,在室溫靜置4 h,棄去上清液,每孔中加入DMSO 150 μl,在混勻儀上振動混勻30 min,使用550全自動酶標儀在570 nm下檢測光密度(OD)度值。計算細胞增值率(%)=各孔OD值/對照組OD值均數(shù)×100%。

    1.4 Annexin V / PI雙標記流式細胞術(shù)檢測骨肉瘤細胞MG63的凋亡

    將在6孔板內(nèi)培養(yǎng)各組骨肉瘤細胞MG63消化后 1 500 r/min離心5 min,棄去上清液,PBS清洗2次,加入500 μl的Binding buffer重懸細胞制備單細胞懸液并調(diào)整濃度為1×106cells/ml,取200 μl細胞懸液,加入Annexin V-FITC流式抗體5 μl混勻,再加入5 μl Propidium Iodide,混勻,避光室溫孵育20 min后流式細胞儀檢測細胞凋亡的比例。

    1.5 蛋白質(zhì)印跡法檢測檢NF-kB蛋白的表達

    使用蛋白裂解液將在6孔板內(nèi)培養(yǎng)48 h的各組骨肉瘤細胞MG63裂解,將裂解產(chǎn)物收集到1.5 ml EP管中,煮沸5 min后通過高速離心機12 000 r/min離心1 min。BCA法進行蛋白濃度的測定,向SDS-PAGE凝膠中加入樣本,電泳分離后電轉(zhuǎn)移至PVDF膜。加入NF-κB (1∶1 000)和β-actin(1∶1 000)抗體,4℃孵育過夜后,加入二抗再37℃孵育30 min。通過凝膠成像分析系統(tǒng),并通過各條帶的吸光度值計算蛋白的相對表達量。結(jié)果采用各組中NF-κB灰度值與β-actin灰度值的比值表示。

    1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

    2 結(jié)果

    2.1 甘草次酸對骨肉瘤細胞MG63 增殖率的影響

    采用MTT的方法計算細胞的增值率,在不同濃度的甘草次酸中孵育24 h后,骨肉瘤細胞MG63增值率與空白組相比有顯著性差異(P<0.05);在不同濃度的甘草次酸中孵育48 h后,骨肉瘤細胞MG63增值率與空白對照組相比有顯著性差異(P<0.05,表1)。甘草次酸200 μmol/L組其骨肉瘤細胞MG63的增值率最低,與陽性對照組比較有顯著性差異(P<0.05)。

    Tab. 1 Comparison of the proliferation rate of cells in each group after incubation with different concentrations ofglycyrrhetinic acid for 24h and 48h(%, n=6)

    2.2 甘草次酸對骨肉瘤細胞MG63凋亡率的影響

    流式細胞儀對凋亡細胞的比例進行檢測,結(jié)果顯示在經(jīng)過甘草次酸孵育24 h后,在50 μmol/L、100 μmol/L和200 μmol/L甘草次酸組中凋亡細胞比例與空白組相比有顯著性差異(P<0.05);結(jié)果顯示在經(jīng)過甘草次酸孵育48 h后,在50 μmol/L、100 μmol/L和200 μmol/L甘草次酸組中凋亡細胞比例與對照組相比有顯著性差異 (P<0.05,表2)。

    Tab. 2 The proportion of apoptosis of osteosarcoma cells MG63 detecting byAnnexin V / PI double labeling flow cytometry ( %, n=6)

    2.3 甘草次酸對對骨肉瘤細胞MG63的NF-κB蛋白表達的影響

    采用蛋白印跡的方法檢測各組細胞NF-κB蛋白的表達,結(jié)果顯示甘草次酸孵育24 h和48 h后,50 μmol/L、100 μmol/L和200 μmol/L甘草次酸組中的NF-κB蛋白的相對表達量分別為與空白對照組相比有顯著差異(P<0.05,表3)

    Tab. 3 Relative expression levels of NF-κB protein in each group after incubation with different concentrations ofglycyrrhetinic acid for 48 h n=6)

    3 討論

    骨肉瘤是一種惡性程度較高,容易轉(zhuǎn)移的惡性腫瘤,且對化療的反應(yīng)較差。甘草是一種具有補益功能的中草藥。在神農(nóng)《神農(nóng)本草經(jīng)》中有記載“甘草,主五臟六腑寒邪氣,堅筋骨,長肌肉,倍氣力,金瘡腫,解毒?!备什葜匾钚猿煞种桓什荽嗡?,具有抗炎、抗病毒、抑菌、抗腎損傷、抗?jié)?、降血糖、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化和肝細胞保護作用等藥理學(xué)活性[5]。而近年來的國內(nèi)外的諸多研究證明,甘草次酸可以在體外抑制血液腫瘤、胃癌、肝癌、結(jié)腸癌、胰腺癌、卵巢癌和食管癌等多種類型的腫瘤細胞的增殖[6-7]。Pirzadeh 等[8]采用流式細胞術(shù)觀察到甘草次酸能以劑量依賴的方式上調(diào)人白血病細胞 HL-60表面CD95 和 CD178 的表達,從而引起細胞凋亡。Sharma等[9]研究發(fā)現(xiàn)甘草次酸對乳腺癌 MCF-7 細胞的生長產(chǎn)生抑制作用。李鳳巖等研究表明,甘草次酸可通過抑制 AKT 蛋白的表達促進甲狀腺癌細胞 SW579 凋亡,通過有效的抑制 AKT 信號就能夠促進腫瘤 細胞的凋亡,對于腫瘤的輔助治療有著積極的作用[10]。 目前國內(nèi)對甘草次酸對骨肉瘤細胞的影響的研究尚未見,本文通過體外培養(yǎng)的方法,研究甘草次數(shù)對骨肉瘤細胞MG63的影響,并探究其可能機制,為臨床治療骨肉瘤提供新的視野。本研究結(jié)果顯示,在不同濃度的甘草次酸中孵育24 h和48 h后,骨肉瘤細胞MG63增值率和凋亡率與空白組相比有顯著性差異,均P<0.05,說明甘草次酸對骨肉瘤的增殖具有抑制作用。

    NF-κB是多效性轉(zhuǎn)錄因子家族,表達于多種細胞,正常情況下NF-κB處于非活化的狀態(tài)。目前研究表明NF-κB的活化與機體防御反應(yīng)、組織損傷與應(yīng)激、細胞的分化和調(diào)亡以及腫瘤生長呈正相關(guān),在乳腺腫瘤、甲狀腺腫瘤、骨腫瘤中均發(fā)現(xiàn)NF-κB表達明顯升高,如果能有有效抑制NF-κB信號通路就能夠減緩腫瘤的生長,為臨床治療提供思路[11]。王玉峰[12]等研究表明NF-κB的抑制劑吡咯烷二硫代氨基甲酸(PDTC)能夠誘導(dǎo)骨肉瘤細胞的凋亡,其可能機制為PDTC能抑制NF-κB的信號通路,下調(diào)Livin和上調(diào)Caspase-9有關(guān)。本研究結(jié)果表明骨肉瘤細胞MG63經(jīng)過甘草次酸孵育48 h后,不同濃度組的NF-κB蛋白的相對表達量分別降低,這表明甘草次酸可能通過影響NF-κB信號通實現(xiàn)其刺激細胞凋亡的作用,但是其具體機制仍需要進一步研究。

    綜上所述,甘草次酸能夠抑制骨肉瘤細胞MG63的增殖,其可能的影響機制為NF-κB信號通路,但是仍需進一步的研究和證實。甘草的來源廣泛,毒副作用低,價格低廉,具有較好的臨床應(yīng)用前景。

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