格列齊特對(duì)糖尿病大鼠心肌的保護(hù)作用及其機(jī)制*

潘文強(qiáng)， 王書凡， 丁伯平， 黃幀檜

((皖南醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室及中藥藥理國(guó)家三級(jí)實(shí)驗(yàn)室， 安徽 蕪湖 241002)

近年來(lái)糖尿病發(fā)病率逐年上升，糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy，DCM)是由糖尿病引起，與冠心病及微血管疾病發(fā)病機(jī)制不同的特異性心肌損害疾病[1]。DCM的發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，目前認(rèn)為氧化應(yīng)激、炎癥、心肌纖維化、細(xì)胞凋亡等參與該病的發(fā)生，主要表現(xiàn)為心臟舒縮功能障礙，最終發(fā)展為心力衰竭，與正常人相比，DCM患者發(fā)生心臟疾病的概率明顯增加，是導(dǎo)致糖尿病患者死亡的主要原因之一[2-5]。

格列齊特(Glic)屬于第二代磺酰脲類降糖藥，臨床上廣泛用于治療II型糖尿病，Glic可以促進(jìn)胰島素分泌降低血糖，同時(shí)能夠降低血小板粘附力，改善血小板聚集，由于其獨(dú)特的氮雜環(huán)結(jié)構(gòu)，Glic可以清除氧自由基，因此Glic在降糖的同時(shí)，對(duì)糖尿病的并發(fā)癥也有一定的改善作用[6-7]。格列本脲(Glib)同屬于磺酰脲類降糖藥，本品通過刺激胰島β細(xì)胞釋放胰島素，其作用強(qiáng)度較強(qiáng)，因此所用劑量明顯減少。鹽酸法舒地爾(Fas)屬于Rho激酶抑制物，可以抑制高血壓和改善心肌肥厚[8]。目前關(guān)于Glic對(duì)糖尿病心肌病的研究較少，本實(shí)驗(yàn)通過建立糖尿病大鼠模型，分別給予Glic、Glib和Fas，通過與后兩者的對(duì)比，探討Glic對(duì)糖尿病大鼠心肌損傷的影響并探討其機(jī)制，為臨床治療糖尿病心肌病提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

60只雄性SD大鼠，體質(zhì)量(220±20)g，許可證號(hào)：SCXK(浙)2014-0001，購(gòu)于南京青龍山繁殖場(chǎng)，溫度(23±2)℃，動(dòng)物自由飲水和進(jìn)食。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

EL-800多功能酶標(biāo)儀(BIO-TEK，USA)；-80℃冰箱(Thermo Fisher科技公司)；Mini PROTEAN轉(zhuǎn)模系統(tǒng)(美國(guó)BIO-RAD公司)；BX-41型奧林巴斯顯微鏡(OLYMPUS公司)；22R高速冷凍離心機(jī)(Beckman Coulter)

1.3 藥物與試劑

格列齊特(施維雅制藥有限公司)；鹽酸法舒地爾注射液(天津紅日藥業(yè)股份有限公司)；STZ(源葉生物有限公司)；血糖儀和血糖試紙(三諾生物傳感股份有限公司)；糖化血紅蛋白(HbA1c)測(cè)定試劑盒、總膽固醇(TC)測(cè)定試劑盒(南京建成有限公司)；TUNEL試劑盒(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司)；RhoA、ROCK1、eNOS抗體(Abcam公司)；BCL-2抗體(Affinity公司)；Bax抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)

1.4 模型的建立與給藥

雄性SD大鼠60只，適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d，隨機(jī)選10只喂養(yǎng)普通飼料作為正常對(duì)照組(NC組)，其余50只喂養(yǎng)高糖高脂飼料4周后，禁食不禁水12 h，使用0.1 mol/L檸檬酸緩沖液配制1% STZ溶液，腹腔注射(45 mg/kg，pH 4.4)誘導(dǎo)糖尿病。注射72 h后，隨機(jī)抽取測(cè)定FBG≥16.7 mmol/L作為糖尿病模型建立成功[9]。造模成功的38只糖尿病大鼠隨機(jī)分為模型組(MC組，n=9)、格列齊特組(Glic組，80 mg/kg，n=10)、格列本脲組(Glib組，2.5 mg/kg，n=10)、法舒地爾組(Fas組，10 mg/kg，n=9)。Glic組和Glib組采取灌胃，F(xiàn)as組進(jìn)行腹腔注射，每天一次，NC組和MC組每天灌胃同體積的蒸餾水，連續(xù)8周，每周測(cè)定一次空腹血糖和體質(zhì)量，按體重調(diào)整給藥物劑量。

1.5 狀態(tài)的觀察和指標(biāo)檢測(cè)

觀察各組大鼠皮毛、狀態(tài)、精神情況等，每周測(cè)定一次體質(zhì)量和血糖。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，使用10%水合氯醛(330 mg/kg)腹腔注射麻醉，腹主動(dòng)脈取血，分離血清并按照試劑盒的要求測(cè)定血清HbA1c、TC、TG、HDL-C、LDL-C；按照試劑盒要求測(cè)定MDA含量和SOD活性。摘取心臟生理鹽水沖洗干凈后，測(cè)定心臟重量，按照公式計(jì)算心臟質(zhì)量指數(shù)(HWI)，HWI=心臟質(zhì)量/體質(zhì)量(mg/g)。

1.6 心肌組織的病理學(xué)觀察

待大鼠麻醉后腹主動(dòng)脈取血，快速取出心臟并用生理鹽水沖洗，取心臟的三分之一心尖處置于10%甲醛溶液固定，梯度乙醇脫水后石蠟包埋切片，置于伊紅水溶液中進(jìn)行染色3 min之后，再次脫水封片，顯微鏡下觀察心肌組織病理學(xué)的變化。

1.7 心肌纖維化的檢測(cè)

腹主動(dòng)脈取血后，摘取心臟生理鹽水沖洗，切取心尖組織以10%甲醛溶液固定，梯度脫水后石蠟包埋后切片，然后進(jìn)行梯度乙醇脫蠟，按試劑盒要求進(jìn)行Masson染色。心肌膠原容積分?jǐn)?shù)(collagen volume fraction，CVF)的計(jì)算，每組隨機(jī)選用5個(gè)視野，使用分析軟件Image-Pro Plus 6.0進(jìn)行計(jì)算，CVF=膠原面積/視野總面積，取平均值。

1.8 心肌細(xì)胞TUNEL凋亡檢測(cè)

取心臟的三分之一心尖處置于10%甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟切片5 μm，取石蠟切片按照TUNEL凋亡試劑盒的要求加入TUNEL反應(yīng)液，TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞核內(nèi)可見棕黃色顆粒，陰性細(xì)胞呈現(xiàn)淡藍(lán)色。在光學(xué)顯微鏡下拍照，每個(gè)切片至少觀察20個(gè)不重疊區(qū)域，每組隨機(jī)選取5個(gè)不同視野，計(jì)算每個(gè)視野凋亡率=TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%，取平均數(shù)。

1.9 Western blot檢測(cè)心肌RhoA、ROCK1、eNOS、Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)

按步驟測(cè)定ras同源家族成員A(Ras homolog gene family member A，RhoA)、Rho相關(guān)蛋白激酶1(Rho associated coiled coil forming protein kinase l，ROCK1)、內(nèi)皮型一氧化氮合成酶(endothelial Nitric-Oxide Synthase，eNOS)、B淋巴細(xì)胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)和BCL2-Associated X(BCL2-Associated X，Bax)的蛋白表達(dá)。取心臟組織45 mg，RIPA裂解液(含磷酸酶和蛋白酶抑制劑)裂解組織，采用BCA蛋白測(cè)定法檢測(cè)蛋白濃度，在電泳凝膠中電泳后使用PVDF膜進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜完成后將膜置于5%脫脂牛奶中孵育2 h，再次加入RhoA、ROCK1、eNOS、Bcl-2、Bax和GADPH抗體在4 ℃下孵育8 h以上。使用辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫下孵育2 h，在凝膠圖像分析儀下加入發(fā)光液來(lái)分析目的條帶的光密度，采用image-pro PLUS處理軟件分析圖像。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠的一般狀態(tài)觀察及血糖和體質(zhì)量變化

NC組大鼠皮毛光亮，狀態(tài)良好，血糖穩(wěn)定，體質(zhì)量逐步上升。MC組大鼠毛色枯黃，精神萎靡，血糖上升，體質(zhì)量下降明顯。與MC組比，Glic組上述情況有明顯改善，血糖降低，體重增加(P<0.01，表1，表2)，Glib組血糖降低，體重有所增加，F(xiàn)as組血糖及體重?zé)o明顯差別。與Glic組相比，Glib組和Fas組體重下降(P<0.01，表1，表2)。

Tab. 1 Changes of fasting blood glucose (FBG) in each group (mmol/L,

Tab. 2 Changes in body mass(BM) in each group (g,

2.2 各組大鼠的HW及HWI的變化

與NC組相比，MC組心臟質(zhì)量指數(shù)增大(P< 0.01，表3)；與MC組相比，Glic組和Glib組心臟質(zhì)量指數(shù)降低，F(xiàn)as組無(wú)明顯改善；與Glic組相比，Glib組及Fas組心臟質(zhì)量指數(shù)增大(P<0.01或P<0.05，表3)，提示Glic和Glib可以改善糖尿病大鼠的心臟肥大，而Glic組改善更加明顯(P<0.05，表3)。

Tab. 3 Changes of cardiac weight index in each

2.3 各組大鼠的血脂變化

與NC組相比，MC組大鼠HbA1c、TC、TG、LDL-C水平均有顯著升高，HDL-C水平降低(P<0.01，表4)；與MC組相比，Glic組HbA1c、TC、TG、LDL-C水平均有明顯下降，HDL-C水平也有所提升(P<0.01，表4)，Glib組HbA1c、TC、TG、LDL-C也有改善(P<0.01或P<0.05，表4)，F(xiàn)as組無(wú)明顯變化。Glic和Glib可以調(diào)控糖脂代謝，改善血脂，而Fas不能。

Tab. 4 Changes of blood lipid in rats of each

2.4 各組大鼠血清中SOD活性及MDA含量

與NC組相比，MC組大鼠血清中SOD活性明顯降低，MDA水平增加；與MC組相比，Glic組SOD活性提高，氧化應(yīng)激損傷物MDA含量明顯減少，F(xiàn)as組和Glib組SOD活力也有所提高，MDA含量減少(P<0.01或P<0.05，表5)；與Glic組相比，Glib組及Fas組SOD活性下降，MDA含量增加(P<0.01，表5)，提示各治療組中Glic組改善氧化應(yīng)激最為明顯。

Tab. 5 SOD activity and MDA content in serum of rats in each

2.5 HE染色觀察大鼠心肌組織形態(tài)學(xué)變化

NC組大鼠心肌細(xì)胞排列整齊致密，著色均勻且細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰完整，MC組大鼠心肌細(xì)胞排列紊亂，可見大量心肌細(xì)胞肌漿溶解，MC組心肌細(xì)胞發(fā)生了明顯損傷。與MC組相比，Glic組病變較輕，可見輕度的肌漿溶解，F(xiàn)as組損傷有輕微改善，而Glib組未見明顯改變(圖1，見彩圖頁(yè)Ⅱ)。

2.6 Masson染色與TUNEL染色

Masson染色結(jié)果顯示，NC組大鼠心肌組織中細(xì)胞排列整齊且細(xì)胞間質(zhì)膠原纖維分布很少，染色面積少且染色較淡，MC組大鼠的心肌組織細(xì)胞分布雜亂且細(xì)胞間基質(zhì)較多，被染色的面積明顯增大。與MC組相比，Glic組和Fas組心臟組織細(xì)胞間隙減小且被染色的組織膠原也明顯下降(P<0.01，圖2，表6)，Glib組纖維化有輕微改善(P<0.05，圖2，表6)。Glic組與Glib組相比，前者改善心肌纖維化更加明顯(P<0.01)；Glic組與Fas組相比，兩組之間無(wú)明顯差異。提示Glic和Fas可以明顯改善纖維化，而Glib有輕微改善作用(圖2，見彩圖頁(yè)Ⅱ)。

TUNEL染色結(jié)果顯示，正常細(xì)胞核呈淡藍(lán)色，凋亡的細(xì)胞核呈棕褐色顆粒樣(TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞)。NC組大鼠心肌細(xì)胞整齊且細(xì)胞核完整清晰，極少見陽(yáng)性細(xì)胞，MC組中心肌細(xì)胞排列雜亂且細(xì)胞核呈褐色的陽(yáng)性細(xì)胞明顯增加，淡藍(lán)色正常細(xì)胞顯著減少，可見凋亡細(xì)胞數(shù)量明顯上升(P<0.01，圖3，表6)。與MC組相比：Glic組和Fas組陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量明顯減少(P<0.01)，Glib組有輕微改善(P<0.05，圖3，表6)。Glic組與Glib組相比，Glic能顯著抑制心肌細(xì)胞凋亡(P<0.01)；Glic組與Fas組相比，Glic抑制細(xì)胞凋亡作用更明顯(P<0.05，圖3，見彩圖頁(yè)Ⅱ)。

Tab. 6 Myocardial collagen volume fraction and apoptosis fraction in each

2.7 Western blot檢測(cè)心肌RhoA、ROCK1、eNOS、Bcl-2和Bax的表達(dá)

與NC組相比，MC組大鼠心肌組織中RhoA、ROCK1及Bax蛋白水平顯著升高，eNOS和Bcl-2表達(dá)明顯減少(P<0.01，圖4，表7)。給予Glic治療之后，心肌組織中RhoA、ROCK1和Bax蛋白明顯降低，eNOS和Bcl-2表達(dá)增加(P<0.01或P<0.05)。給予Glib治療之后，eNOS及Bcl-2蛋白水平有輕微提高(P<0.05)。給予Fas治療之后，RhoA、ROCK1、Bax蛋白顯著降低(P<0.01)，eNOS和Bcl-2蛋白表達(dá)升高(P<0.01或P<0.05，圖4)。Glic組與Glib組相比，前者RhoA、ROCK1、Bax蛋白表達(dá)明顯下降，Bcl-2蛋白表達(dá)升高(P<0.01或P<0.05)；與Fas組相比，Glic組Bcl-2蛋白表達(dá)上調(diào)更加明顯(P<0.05，圖4，表7)。

Fig. 4 Expressions of RhoA, ROCK1, eNOS, Bcl-2 and Bax in myocardium in each group

Tab. 7 Quantitative analysis of the results of Western blot in each n=5)

3 討論

糖尿病心肌病(DCM)作為糖尿病嚴(yán)重的并發(fā)癥之一，早在1972年就曾提出，之后廣泛運(yùn)用于臨床醫(yī)學(xué)研究[10]。DCM的主要病理表現(xiàn)為心肌膠原纖維的大量沉積和心肌細(xì)胞異常凋亡，纖維化和凋亡共同作用導(dǎo)致心臟收縮功能障礙，最終引發(fā)心力衰竭。

為了評(píng)價(jià)Glic減輕氧化應(yīng)激和抑制RhoA/ROCK信號(hào)通路減輕心肌損傷的作用，并與另一種磺酰脲類降糖藥Glib和Rho激酶抑制劑Fas相比較，本實(shí)驗(yàn)通過采用高糖高脂飼料合并STZ建立糖尿病大鼠模型。MC組大鼠心臟質(zhì)量指數(shù)增加，通過HE染色發(fā)現(xiàn)心肌細(xì)胞排列紊亂且細(xì)胞發(fā)生變形，可見心肌細(xì)胞肌漿溶解，Masson染色顯示心肌細(xì)胞排列紊亂且被染色的陽(yáng)性面積明顯增加，TUNEL染色顯示MC組大鼠心肌細(xì)胞大量凋亡，可以看出MC組心肌損傷嚴(yán)重，這些符合DCM的病理特征。

Rho蛋白屬于小G蛋白R(shí)as超家族，Rho激酶(Rho Kinase，ROCK)是RhoA的效應(yīng)子，同屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族成員，ROCK1蛋白主要在非神經(jīng)中組織中表達(dá)，并在心血管功能中起調(diào)節(jié)作用，RhoA蛋白參與細(xì)胞的多種生理反應(yīng)，當(dāng)RhoA被相關(guān)受體激活時(shí)，可以調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)與凋亡以及膠原纖維的生成[11-12]。eNOS作為內(nèi)皮型一氧化氮合酶是NO的主要生理來(lái)源，可以減少血小板聚集，增強(qiáng)心血管抗氧化的能力，維持正常的通透性，糖尿病大鼠缺乏eNOS時(shí)會(huì)導(dǎo)致心功能紊亂和心肌細(xì)胞的凋亡，因此eNOS在調(diào)節(jié)心血管功能中起到重要作用[13-14]。當(dāng)RhoA被激活時(shí)，下游ROCK蛋白被活化，這種活化能夠降低eNOS的mRNA穩(wěn)定性，最終導(dǎo)致eNOS的表達(dá)減少[15]。RhoA/ROCK通路可以通過多種途徑參與DCM的發(fā)生與發(fā)展中，在高糖環(huán)境下，RhoA/ROCK通路被激活，心肌中一氧化氮合酶(NOS)生成受阻，導(dǎo)致糖尿病大鼠的心肌抗氧化能力下降，直接或間接損傷心肌組織[16]。RhoA/ROCK信號(hào)通路還可以通過調(diào)控JNK(c-jun N-terminal Kinase)信號(hào)通路，增加Bax蛋白的表達(dá)，從而誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡增加[17]。高糖環(huán)境下，RhoA/ROCK通路異?；罨梢约せ畈⑸险{(diào)核因子κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)的表達(dá)，并激活轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(transforming growth factor β1，TGFβ1)/Smad信號(hào)通路，最終導(dǎo)致纖維化的形成[18]。此外，氧化應(yīng)激也是導(dǎo)致糖尿病大鼠心肌損傷和細(xì)胞凋亡加重的原因之一，長(zhǎng)期的高血糖狀態(tài)會(huì)損傷線粒體，增加活性氧的生成，并誘導(dǎo)體內(nèi)抗氧化酶的糖基化，進(jìn)一步加重體內(nèi)抗氧化酶活性的下降甚至消失，心肌細(xì)胞的抗氧化能力下降，活性氧簇(ROS)直接損傷心肌細(xì)胞并導(dǎo)致細(xì)胞死亡[19]。

Glic作為第二代磺脲類降糖藥物，廣泛應(yīng)用于II型糖尿病的臨床治療。糖尿病大鼠經(jīng)Glic干預(yù)后，大鼠FBG、HWI、HbA1c、TC、TG、LDL-C顯著降低，BM、HDL-C水平升高，大鼠血清中MDA含量降低，SOD活性升高，說明Glic可以改善糖尿病大鼠的氧化應(yīng)激，增強(qiáng)心肌抗氧化能力。通過纖維化染色顯示，模型組大鼠發(fā)生明顯的心肌纖維化，而給予Glic可明顯改善糖尿病大鼠的心肌纖維化。通過TUNEL染色可以看出，Glic治療組心肌細(xì)胞凋亡數(shù)量顯著下降，這一結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)Western blot檢測(cè)Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)結(jié)果一致，Glic組上調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)，降低Bax蛋白水平，Glic可以使糖尿病大鼠心肌組織中RhoA及ROCK1蛋白水平明顯減少，eNOS表達(dá)上升。

綜上所述，糖尿病會(huì)造成大鼠心肌損傷，促使大鼠心肌RhoA/ROCK信號(hào)通路信號(hào)激活，導(dǎo)致糖尿病大鼠發(fā)生心肌纖維化和細(xì)胞凋亡，進(jìn)一步加重糖尿病大鼠的心肌損傷。Glic可以通過降低血糖，改善心肌纖維化，緩解糖尿病所致的心肌損傷，還可以改善糖尿病大鼠氧化應(yīng)激，調(diào)控RhoA/ROCK1/eNOS信號(hào)通路，減少細(xì)胞凋亡，從而對(duì)心肌起到保護(hù)作用。