海藻糖的生產(chǎn)及分析方法的國內(nèi)研究進展

鄧丹丹，李 美，凌婉陽

0 引言

1832年Wiggers從黑麥的麥角菌中提取到海藻糖，這是人們第一次發(fā)現(xiàn)了海藻糖的存在，隨后相繼在許多動植物和微生物中也發(fā)現(xiàn)了海藻糖，如人們?nèi)粘Ｉ钪惺秤玫哪⒐筋悺⒑Ｔ孱?、豆類、蝦、面包、啤酒及酵母發(fā)酵食品中都有含量較高的海藻糖。由于海藻糖的結(jié)構(gòu)明顯不同于其他低聚糖類，賦予了它獨特的理化性質(zhì)與生物學特性，學術(shù)界對海藻糖的作用機理進行了廣泛的研究，繼而對海藻糖的生產(chǎn)方法也進行了不斷的探索和開發(fā)。隨著生產(chǎn)技術(shù)的研究不斷深入，使得生產(chǎn)成本也不斷降低，越來越多的人們開始認識和利用海藻糖的各種性質(zhì)，將其應用在各種領(lǐng)域，應用價值得到了不斷的提升[1]。本文對海藻糖的化學結(jié)構(gòu)以及生物學功能進行了簡介，對國內(nèi)海藻糖的生產(chǎn)方法以及定性定量分析方法的研究進展進行了概述，通過對海藻糖的論述希望能進一步推動我國海藻糖的應用技術(shù)開發(fā)。

1 海藻糖的結(jié)構(gòu)和功能

1.1 化學結(jié)構(gòu)

海藻糖是一種安全、可靠的天然糖類，Bredereek在1930年采用化學方法對海藻糖的結(jié)構(gòu)進行了論證，它是由2個吡喃型葡萄糖單體組成的非還原性糖，以 α, α-1,1-糖苷鍵連結(jié)而成，分子式為 C12H22O11·2H2O，分子結(jié)構(gòu)的 Haworth式如圖 1所示。

圖1 海藻糖分子的Haworth式

通過核磁共振技術(shù)對海藻糖分子進行化學結(jié)構(gòu)分析，研究發(fā)現(xiàn)，海藻糖分子存在一種簡單的雙折軸向?qū)ΨQ結(jié)構(gòu)，在水溶液中，2個椅式構(gòu)象的葡萄糖分子通過糖苷鍵的氧原子形成對稱的空間結(jié)構(gòu)(圖2)，在固體狀態(tài)對稱結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。

由圖1和圖2可知，海藻糖分子結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)對稱性，也沒有半縮醛基的存在，海藻糖既沒有還原性也沒有變旋光性現(xiàn)象。海藻糖的 α, α-1,1-糖苷鍵具有遠低于其他糖苷鍵的能量，如另一種非還原性雙糖蔗糖的糖苷鍵具有27 kcal/mol的能量，而海藻糖的α, α-1,1-糖苷鍵僅具有1 kcal/mol能量，因此海藻糖不易被水解。研究發(fā)現(xiàn)，海藻糖在pH 3.5、溫度100℃的環(huán)境下加熱時間24 h，其保存率仍可達99%以上，表明海藻糖分子的穩(wěn)定性極強，是天然二糖中最穩(wěn)定的分子，這種特殊的分子結(jié)構(gòu)賦予了海藻糖奇異的生物學功能[2]。

圖2 海藻糖結(jié)構(gòu)式

1.2 生物學功能

海藻糖的存在形式多種多樣，既可以以游離糖的形式存在生物體內(nèi)，也可以作為海藻糖脂的組成部分存在生物體內(nèi)，不同的存在形式相應表現(xiàn)出海藻糖不同的生物學功能。其生物學功能主要有3個方面：①在生物體內(nèi)可以作為海藻糖脂的基本組分，海藻糖脂有幾種不同的結(jié)構(gòu)，它廣泛存在于棒狀桿菌屬、分枝桿菌屬、諾卡菌屬等菌中，是構(gòu)成上述各細菌細胞壁的主要成分之一；②用于提供能量，海藻糖在生物體內(nèi)的含量隨著生物的生長狀態(tài)、營養(yǎng)狀況和環(huán)境條件的變化而變化，外界壓力會引起海藻糖的合成與積累，如干燥會導致海藻糖的快速積累，吸收水分后在生物體內(nèi)又會迅速發(fā)生代謝，通過海藻糖酶將海藻糖催化分解成 2個葡萄糖分子，作為能量來源和新陳代謝中間產(chǎn)物，提供的熱值和其他化合物相當，扮演著貯存碳水化合物的角色；③是許多生物的應激代謝物，具有保護生物細胞和生物活性物質(zhì)在脫水、干旱、高溫、冷凍、高滲透壓及有毒化合物等不良環(huán)境條件下活性免遭破壞的功能，作為一種天然的非特異性生物保護物質(zhì)而存在[2]。

2 海藻糖的生產(chǎn)方法

2.1 微生物提取法

微生物提取法的提取源可以是乳酸菌、酵母、霉菌及其它一些含海藻糖的菌體，目前生產(chǎn)工藝所用的原料主要是酵母菌，其工藝流程為：先改變菌體的生長環(huán)境如干燥、改變滲透壓等，使菌體在逆性環(huán)境下合成更多的海藻糖，繼而通過有機溶劑如乙醇、三氯乙酸等采用適當?shù)姆椒ㄌ崛　⒕凭w內(nèi)的海藻糖，以獲得較高純度的海藻糖晶體[3]。

趙玉巧等為了有效地提取酵母中的海藻糖，分別研究了3種提取溶劑即乙醇水溶液、三氯乙酸和超聲波輔助的水溶液的提取海藻糖的效果；以濕酵母為原料用三氯乙酸作為提取溶劑提取3次，海藻糖的得率總共達 96.2%；以濕酵母為原料用超聲波輔助的水溶液作為提取溶劑，第1次提取海藻糖的得率為95.1%，提取3次的得率總共達99.1%；以濕酵母為原料用9 mL 55%的乙醇溶液作為提取溶劑，當提取時間90 min時2次提取率合計81.9%；而以1 g干酵母為原料，采用12 mL水溶液提取海藻糖，在提取時間75 min、溫度90℃的條件下，2次提取率合計86.6%[4]。宋曉麗等以三氯乙酸為浸提溶劑從安琪葡萄酒高活性干酵母中提取海藻糖，通過微波法滅酶對海藻糖得率的影響得出：微波滅酶最適功率119 W、最適時間45 s；通過Box-Behnken響應面設計對提取工藝進行優(yōu)化，即在三氯乙酸用量41.95 mL、三氯乙酸濃度 0.43 mol/L、時間 88.75 min、溫度34.19℃的提取條件下，1 g干酵母中海藻糖得率為251.86 mg，回歸模型的預測值與實測值的相對誤差＜1%[5]。王宜磊等采用微波破壁法、高溫處理破壁、煮沸提取法 3種提取方法從啤酒廢酵母中提取海藻糖，以海藻糖得率以及工藝的效益性為指標研究了海藻糖的最佳提取條件，研究發(fā)現(xiàn)煮沸提取法的效果較好，即在煮沸80 min的條件下，以1 g干酵母為原料可得海藻糖含量8.147 mg[6]。何鋼等采用超聲波輔助的乙醇-水溶液提取海藻糖，研究了啤酒酵母、葡萄酒酵母、高活性酵母、釀酒高活性酵母4株菌體的海藻糖含量大?。辉诹弦嘿|(zhì)量體積比1∶15、溫度80℃、時間70 min、乙醇濃度50%的條件下，酵母菌細胞海藻糖得率達(68.10±0.7)mg/g；研究結(jié)果顯示，4株菌體中釀酒高活性酵母的海藻糖含量最高，其次是高活性酵母，第三是葡萄酒酵母，而啤酒酵母的海藻糖相對最少[7]。洪厚勝等通過微波-浸提法提取活性干酵母胞內(nèi)的海藻糖，通過單因素及正交試驗得出：在1.5 g活性干酵母的基礎上，微波最佳功率231 W、微波最佳時間40 s、三氯乙酸最佳濃度0.7 mol/L、三氯乙酸最佳用量40 mL、浸提最佳時間150 min、浸提最佳溫度55℃，得到的海藻糖含量為280.15 mg/g；另外，研究發(fā)現(xiàn)從現(xiàn)有面包酵母菌種中篩選出的高產(chǎn)海藻糖菌株在添加營養(yǎng)源的條件下進行流加發(fā)酵后，最大酵母濕質(zhì)量濃度可從198.34 g/L提高到264.82 g/L，提高了 33.52%，而 0.7%～1.0%的乙醇溶液可有效提高酵母濕質(zhì)量濃度，發(fā)酵力在650 mL/h以上[8]。

2.2 微生物發(fā)酵法

利用微生物發(fā)酵法培養(yǎng)的微生物對象有節(jié)桿菌屬、棒桿菌屬、短桿菌屬、諾卡氏菌屬、絲核菌屬、微球菌屬等，在符合菌株生長條件的高濃度培養(yǎng)基質(zhì)上通過誘變、細胞融合或基因重組等技術(shù)手段選育出高產(chǎn)海藻糖的菌株，經(jīng)高滲發(fā)酵后從發(fā)酵液中提取、精制海藻糖[9]。

宿玲恰等對前期獲得的一種嗜熱棲熱菌來源的海藻糖合酶通過定點突變技術(shù)進行分子改造，得到突變體P251L，并在E. coli中重組表達，研究發(fā)現(xiàn)重組菌的發(fā)酵酶活可達6.9 U/mL；在初始pH 7.5、溫度50℃、0.3 g/mL麥芽糖的條件下，利用重組菌體發(fā)酵制備海藻糖，當每克麥芽糖加酶量為 20 U時，海藻糖的轉(zhuǎn)化率可達到 62.0%，比天然海藻糖合酶提升了 13.0%[10]。段瑩瑩等從土壤中分離篩選得到一株能合成海藻糖的菌株，在海藻糖合酶的催化下以麥芽糖為底物對其進行搖瓶發(fā)酵，通過對發(fā)酵條件的研究得到：最適菌株發(fā)酵的培養(yǎng)基質(zhì)成分為2%麥芽糖、0.5%酵母粉和1%蛋白胨，調(diào)節(jié)初始pH 7.0、發(fā)酵溫度35℃，菌株接種量4%，經(jīng)過48 h的發(fā)酵時間后，海藻糖含量最高為 15.1%，即轉(zhuǎn)化率為 49.8%[11]。張曉元等以產(chǎn)朊假絲酵母為發(fā)酵微生物，預處理去除麥芽糖漿中葡萄糖，通過單因素及正交試驗結(jié)果可知，預處理較佳工藝條件為：培養(yǎng)基質(zhì)的菌液接種量4%，底物濃度為40%的麥芽糖漿，在溫度32℃、pH 5.5、發(fā)酵時間6 h的條件下，葡萄糖的去除率可達 99.4%，海藻糖得率由 29.8%提高至 58.4%，提高了 96.0%[12]。段瑩瑩等在重組大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)海藻糖合成酶過程中，采用DO-stat流加培養(yǎng)控制，研究了溶氧濃度分別為20%、30%、35%和40%時的發(fā)酵效果，當發(fā)酵罐中溶氧濃度為30%時，發(fā)酵時間40 h，菌體干質(zhì)量可達53.9 g/L，海藻糖轉(zhuǎn)化率達到80.9%[13]。晏星辰等采用自誘導表達系統(tǒng)對含有海藻糖合成酶的大腸桿菌BL21(DE3)進行三階段溫度控制發(fā)酵，在37℃培養(yǎng)2.5 h，25℃培養(yǎng)10.5 h，30℃培養(yǎng)至發(fā)酵終點，研究發(fā)現(xiàn)，與自誘導恒溫控制發(fā)酵獲得的海藻糖合成酶酶活相比，經(jīng)過三階段控溫發(fā)酵酶活最高可達1.42×104U/mL，提高了57.4%；在5 L反應器中利用大腸桿菌連續(xù)發(fā)酵40 h，細胞去除水分后的凈重濃度達到15.32 g/L，與搖瓶發(fā)酵相比，在5 L反應器中獲得的海藻糖合成酶酶活最高可達 1.81×104U/mL，提高了28.6%；以5%甲苯處理45 min，40 mmol/L PBS緩沖液配制的pH 7.5的350 g/L麥芽糖溶液為底物，反應溫度30℃，全細胞催化反應的海藻糖得率達到74%以上，10批次后，麥芽糖仍保留64.1%的轉(zhuǎn)化率[14]。

2.3 基因工程法

基因工程法生產(chǎn)海藻糖主要包括構(gòu)建轉(zhuǎn)基因植物法和構(gòu)建基因工程菌2種方法，其中構(gòu)建轉(zhuǎn)基因植物法利用能夠合成海藻糖的基因引入到果蔬植物中，促使轉(zhuǎn)基因植物在體內(nèi)合成海藻糖，獲得其所需的生物學功能；構(gòu)建基因工程菌則是利用酶工程技術(shù)將海藻糖合酶基因轉(zhuǎn)入新的微生物宿主中高效表達獲得高產(chǎn)海藻糖菌體，或利用工程微生物能夠高效表達海藻糖合酶的特點，在體外將葡萄糖、麥芽糖、淀粉等底物轉(zhuǎn)化為海藻糖[15]。

高超等以哈氏噬纖維菌Cytophaga hutchinsonii為研究對象，利用PCR技術(shù)以及克隆技術(shù)獲得菌體的海藻糖雙功能合成酶基因(tpsp)，以大腸桿菌 E.coli p Tac-HisA為表達載體，將葡萄糖催化合成海藻糖；結(jié)果表明C. hutchinsonii海藻糖合成酶基因(tpsp)在E. coli胞內(nèi)催化反應，并將其轉(zhuǎn)運到胞外，海藻糖的產(chǎn)量可達1.2 g/L，相對轉(zhuǎn)化率為21%；在發(fā)酵罐中利用重組大腸桿菌菌株催化葡萄糖轉(zhuǎn)化，其合成的海藻糖產(chǎn)量可達 13.3 g/L，相對轉(zhuǎn)化率為48.6%[16]。宿玲恰等以 Thermus thermophilus ATCC33923為研究對象，通過PCR擴增技術(shù)獲得了該菌體的海藻糖合酶基因 treS，構(gòu)建了基因工程菌E. coli BL21 (DE3)/pET-24a (+)-TreS；利用該基因工程菌在搖瓶中連續(xù)發(fā)酵28 h，獲得的胞內(nèi)海藻糖合酶酶活最高可達6.4 U/mL；而以海藻糖得率為指標的最佳工藝參數(shù)為：麥芽糖的濃度為10%，每克麥芽糖添加海藻糖合酶酶量15 U，調(diào)節(jié)初始pH 7.5、溫度40℃，在轉(zhuǎn)速150 r/min下連續(xù)反應24 h，海藻糖的轉(zhuǎn)化率達到最高，為 49.0%；當麥芽糖濃度提高至20%～40%時，轉(zhuǎn)化率為45.4%～46.2%[17]。王珊瑛等通過來源于古細菌嗜酸硫化葉菌的麥芽寡糖基海藻糖合成酶(MTSase)和麥芽寡糖基海藻糖水解酶(MTHase)的聯(lián)合作用以淀粉為底物合成海藻糖；通過構(gòu)建 6種基因工程菌(枯草芽孢桿菌-大腸桿菌)為表達載體，優(yōu)化MTSase和MTHase編碼基因，在木糖異構(gòu)酶基因的啟動子及其阻遏蛋白介導下，使枯草芽孢桿菌中的MTSase和MTHase能夠高效表達；培養(yǎng)基中添加5 g/L甘油、24 g/L蛋白胨，8 h后加入6 g/L木糖，在發(fā)酵溫度37℃、時間16 h的條件下，誘導重組基因工程菌中的 MTSase和MTHase產(chǎn)生聯(lián)合作用催化淀粉轉(zhuǎn)化，海藻糖轉(zhuǎn)化率達到 33.57%[18]。徐燕杉等以谷氨酸棒桿菌ATCC14067為研究對象，利用克隆技術(shù)獲得海藻糖合酶基因(treS)，將其插入表達質(zhì)粒 pET-22b，以大腸桿菌E. coli BL21(DE3)為宿主誘導其表達，利用鎳柱親和層析進一步純化重組海藻糖合酶；以麥芽糖為底物，在30℃，pH 7.5條件下，Km值約為29.2 mmol/L，海藻糖的得率可達60%～70%[19]。吳傲等以天藍色鏈霉菌為對象，通過克隆技術(shù)得到海藻糖合酶基因，將其轉(zhuǎn)入大腸桿菌菌體進行表達，獲得高產(chǎn)海藻糖的大腸桿菌 Escherichia coli BL21(DE3)；該酶最適溫度35℃；最適pH 7.0，海藻糖轉(zhuǎn)化率最高為65%；通過同源建模和序列比對分析，對該基因進行定點突變，利用突變株BL21/pET28a-K246A在 5 L發(fā)酵罐催化合成海藻糖，在麥芽糖濃度300 g/L、溫度35℃和pH 7.0的條件下，海藻糖轉(zhuǎn)化率為71.3%，產(chǎn)量為213.93 g/L；將麥芽糖濃度提高至700 g/L，其他試驗條件保持不變，海藻糖的轉(zhuǎn)化率可達 66%，其產(chǎn)量為 465.98 g/L[20]。李新等以施氏假單胞菌 A1501為對象，經(jīng)過克隆技術(shù)得到 otsA/otsB基因，將其導入Escherichia coli BL21(DE3)宿主中，催化葡萄糖轉(zhuǎn)化合成海藻糖，通過表達E. coli本身的galU基因增加海藻糖合成前體物質(zhì)尿苷二磷酸-葡萄糖的含量，使海藻糖產(chǎn)量提高了3倍；過表達來自天然纖維素分解細菌 Saccharophagus degradans的纖維二糖磷酸化酶基因cepA，以20 g/L纖維二糖為底物，添加0.05 mmol/L的井岡霉素抑制海藻糖降解，反應48 h后海藻糖含量可達 1.3 g/L[21]。杜立合成了源自Arabidopsis thaliana、Archaeoglobus fulgidus和Corynebacterium glutamicum的3種4-α-糖基轉(zhuǎn)移酶(4αGTase)基因，并以大腸桿菌為E. coli BL21(DE3)為表達宿主；以Bacillus circulans的環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(BcCGT)為催化劑，將濃度 150 g/L、DE值16的麥芽糊精催化合成海藻糖，海藻糖轉(zhuǎn)化率為74.1%，與對照相比提高了24.0%；設計和構(gòu)建了以提高 BcCGT對麥芽糖受體親和力為目的的高通量篩選體系，獲得了一株突變體 M234I，以麥芽糖為受體的Km降低至野生型的54.4%，海藻糖轉(zhuǎn)化率提高至 77.2%；將突變體 M234I基因插入表達質(zhì)粒pHY300PLK-bccgtM234I，將其轉(zhuǎn)入枯草芽孢桿菌中，獲得枯草芽孢桿菌重組菌 B. subtilis WS11/pHY300PLK-bccgtM234I，以葡萄糖為碳源、7∶1的隆科特玉米漿與大豆蛋白胨為氮源，碳氮比為3∶1時，在3 L發(fā)酵罐中的最高酶活達到1423.2 U/mL[22]。

2.4 酶轉(zhuǎn)化法

酶轉(zhuǎn)化法是采用各類碳水化合物如葡萄糖、麥芽糖、淀粉等為底物，在海藻糖合成酶類的催化下，將其轉(zhuǎn)化合成海藻糖。

張曰輝等以麥芽糖為底物利用海藻糖轉(zhuǎn)化酶粗酶液轉(zhuǎn)化海藻糖，通過單因素和正交試驗結(jié)果得知：溫度53℃，轉(zhuǎn)化pH 7.8，時間20 h，搖床轉(zhuǎn)速150 r/min時，海藻糖的轉(zhuǎn)化率為59.8%[23]。崔懷言等選取生物表面活性劑硫酸粘桿菌素，采用可視化優(yōu)化方法對其進行通透性處理，重組大腸桿菌 BL21生產(chǎn)海藻糖合成酶；提高海藻糖合酶酶活的最佳處理工藝為：將1.40 g/L的硫酸粘桿菌素在35℃下滲透處理72 min，其酶活是傳統(tǒng)超聲破碎法的2.09倍；利用該海藻糖合酶催化30%麥芽糖進行轉(zhuǎn)化反應，海藻糖得率為70%，以反應時間12 h為一批次試驗，重復使用該催化劑16批后，海藻糖得率仍然維持在65%以上[24]。劉念等通過對比無水乙醇、氯仿、EDTA和硫酸粘桿菌素4種透性試劑對表達海藻糖合成酶的大腸桿菌工程菌的處理效果，發(fā)現(xiàn)使用硫酸粘桿菌素透性化處理后海藻糖合成酶的催化轉(zhuǎn)化率高達64.6%，是傳統(tǒng)超聲破碎的 2.63倍；為得到較高的海藻糖合成酶活性，以1.5 g/L的硫酸粘桿菌素為滲透劑，在 30℃下滲透處理 60 min，其酶活為 5209 U/mL；以 25%的麥芽糖為底物、pH 7.5、溫度 30℃進行全細胞催化反應，海藻糖的轉(zhuǎn)化率為65.6%，反復催化20批次之后，轉(zhuǎn)化率仍維持在62.5%[25]。婁倩芳等以聚丙烯腈膜(PAN)為載體，在pH 7.6、溫度30℃、加酶量0.1 mg/cm2條件下震蕩吸附3 h制備固定化海藻糖合成酶粗酶液，其熱穩(wěn)定性比游離酶提高10℃，酸堿穩(wěn)定性由pH 6.6～7.4擴展至pH 5.4～8.0；利用固定化酶催化反應生成海藻糖的最佳工藝參數(shù)為：初始麥芽糖底物濃度200 g/L、pH 7.4、溫度40℃，反應達到平衡時較游離酶降低6個百分點，海藻糖含量為 50.9%，副產(chǎn)物葡萄糖含量為9.1%；將固定化酶重復使用72 h后，與初始酶活為對照，其酶活保留了 64.4%[26]。封金云等以大米淀粉為底物多酶復配制備海藻糖，研究了多酶復配生產(chǎn)海藻糖的最佳工藝參數(shù)：以質(zhì)量體積分數(shù)15%的大米淀粉為底物，在溫度45℃、pH 6.0、DE值16、α/β-CGTase加量為1.4 U/mL的條件下，催化 28 h后糖化處理12 h，海藻糖轉(zhuǎn)化率達到73%，與普通雙酶法相比，轉(zhuǎn)化率提高了23個百分點；在底物濃度為25%時，海藻糖產(chǎn)量最高達到182.5 g/L[27]。

3 海藻糖的分析方法

海藻糖要進行生產(chǎn)及應用研究，則分析方法是關(guān)鍵，目前用于海藻糖定量分析的方法有蒽酮比色法、紙層析法、薄層層析法、DNS比色法、高效液相色譜法等，不同的分析方法各有其不同的特點與性能，可以根據(jù)分析樣品中含有的各種糖成分的復雜程度和含量多寡，選擇合適的定量分析方法。由于海藻糖主要是從酵母等含量豐富的微生物中提取，以及利用酶法由淀粉或淀粉水解物轉(zhuǎn)化而制備，生產(chǎn)過程的中間產(chǎn)物和制成品中除了海藻糖以外，還含有不同含量的其他糖類，如麥芽糖、葡萄糖、寡糖等，海藻糖的定量分析往往是分離和分析過程的結(jié)合。

3.1 蒽酮比色法

蒽酮比色法是一個快速而簡便的定糖方法，糖類(包括多糖)遇濃硫酸脫水生成糠醛及其衍生物，蒽酮與糠醛及其衍生物經(jīng)脫水縮合，反應后溶液呈現(xiàn)藍綠色，顏色的深淺即可作為海藻糖定量的依據(jù)。

譚海剛等采用蒽酮比色法測定酵母中海藻糖的含量，在0.2%蒽酮-硫酸溶液(料液比1∶4)的條件下加熱2 min，顯色后于波長590 nm處測定，樣品需在30 min內(nèi)測完；然后在冰水浴中加入0.5 mol/L三氯乙酸溶液15 mL，研究發(fā)現(xiàn)，以活性干酵母為提取對象，每30 min提取1次，共提取海藻糖8次，可獲得149.42 mg海藻糖，即155.05 mg/g酵母(干基)[28]。李艷玲等探討了蒽酮濃硫酸法、硫酸水合加熱法、蒽酮稀硫酸法3種蒽酮比色測定海藻糖含量；當硫酸濃度98%，蒽酮濃硫酸試劑4.0 mL，海藻糖標準溶液2.0 mL，煮沸加熱5 min或室溫3 min時，得到蒽酮濃硫酸法和硫酸水合加熱法于波長625 nm處的吸光度值最大；當硫酸濃度為85%，蒽酮硫酸試劑3.0 mL，海藻糖標準溶液1.0 mL，煮沸加熱10 min時，得到蒽酮稀硫酸法于波長625 nm處的吸光度值最大；采用蒽酮濃硫酸法、硫酸水合加熱法、蒽酮稀硫酸法在 60 min內(nèi)吸光值的 SD分別為0.0041、0.0065、0.0067，3種方法的 RSD 分別為0.49%、0.84%、0.99%，在 10～100 μg/mL范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)分別為 0.9996、0.9989、0.9988[29]。

3.2 紙層析法

紙層析法是用紙作為載體的一種色譜法，是一種古老的分析手段，目前仍廣泛應用在生物化學特別是糖類的分析中，使用合適的展開劑很容易將海藻糖和其它糖類分開。紙層析法依據(jù)極性相似相溶原理，是以濾紙纖維的結(jié)合水為固定相，而以有機溶劑作為流動相，由于樣品中各物質(zhì)分配系數(shù)不同，因而擴散速度不同，從而達到分離的目的。

王蘭等用紙層析分離洗脫法測定胞內(nèi)及發(fā)酵液內(nèi)海藻糖，展開劑為正丁醇∶丙酮∶水∶醋酸=10∶3∶6∶2，顯色劑由 A液(AgNO3的水-丙酮飽和液)和B液(NaOH的乙醇水溶液)組成，采用0.1 mol/L HCl作為洗脫劑洗脫16 h；當點樣量為40～120 μg時，定量測定的吸光度與海藻糖含量呈線性關(guān)系，得到的線性回歸方程為Y=0.0021X+0.002，其相關(guān)系數(shù)R2=0.9985[30]。李仁茂等采用紙層析法和蒽酮比色法對含水量為85%的濕平菇和干燥平菇中的海藻糖進行定性定量分析；采用的展層劑為正丁醇∶丙酮∶水∶醋酸=10∶6∶6∶2，其中 AgNO3的水-丙酮飽和液(水∶丙酮=1∶20)為 A 液顯色劑，NaOH的乙醇水溶液(乙醇：水=1∶1)為B液顯色劑，試驗測得的海藻糖Rf值約為0.29；研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，濕平菇和干平菇中的海藻糖含量分別為 2.06%、13.7%[31]。

3.3 薄層層析法

薄層層析法是一種用來分離混合物的技術(shù)，其原理是以涂布于支持板上的支持物作為固定相，以合適的溶劑為流動相，對混合樣品進行分離、鑒定和定量的一種層析分離技術(shù)。利用薄層層析法可對菌種篩選、培養(yǎng)及提取過程中的大量海藻糖進行快速的定性定量分析。

譚海剛利用薄層層析法定性分析海藻糖合酶酶反應終產(chǎn)物，應用于篩選產(chǎn)海藻糖合酶菌株；反應條件為：3 g硅膠G+4 mL 0.05% CMC-Na+4 mL 0.1 mol/L NaH2PO4制備薄板(8 cm×18 cm)，正丁醇∶吡啶∶水=6∶4∶1或正丁醇∶吡啶∶2%脲水=3∶2∶1為展開劑，30%硫酸甲醇溶液為顯色劑，其檢出靈敏度可達0.2 μg；薄層層析Rf值的重現(xiàn)性較好，對海藻糖與麥芽糖、海藻糖與葡萄糖的分離效果很好；以山東鄒平的采集土樣為對象，利用薄層層析法可篩選出5株產(chǎn)海藻糖合酶菌株[32]。劉德海等采用硅膠板GF254薄層層析法定性分析葡萄糖、麥芽糖、海藻糖，確定了最佳展開劑為乙醇∶乙醇乙酯∶水＝10∶3∶1，最佳顯色劑為濃硫酸∶蒸餾水＝10∶90；試驗結(jié)果顯示，薄層層析法能較好地將葡萄糖、麥芽糖、海藻糖分離開，顯色后糖的斑點清晰，靈敏度高；用蒽酮-硫酸法對分離的海藻糖進行定量分析，根據(jù)海藻糖產(chǎn)量篩選出高產(chǎn)海藻糖的菌株[33]。

3.4 DNS比色法

在酶法轉(zhuǎn)化淀粉生產(chǎn)海藻糖時，經(jīng)α-淀粉酶和糖化酶處理的海藻糖中間樣品，其主要成分僅為海藻糖和葡萄糖，因此可運用還原糖測定方法-DNS即3,5-二硝基水楊酸法在堿性條件下分別測出其中還原糖和總糖的量，再計算出非還原糖即海藻糖的含量。該方法操作簡單、成本低廉，可用于酶法海藻糖生產(chǎn)過程中中間產(chǎn)物的檢測。

王蘭等確定了以酶-DNS比色法定量測定胞內(nèi)及發(fā)酵液內(nèi)海藻糖，其中胞內(nèi)海藻糖需在溫度95℃下處理20 min，發(fā)酵液海藻糖測定過程中應進行適當?shù)南♂專辉?7℃下反應4 h，利用酶-DNS比色法測定海藻糖濃度，實際所加酶量為理論所需酶活的9倍以上[34]。王蕾等建立了DNS法定量測定海藻糖，其標準曲線回歸方程為y=1.722x-0.009，通過對濃度在0～22.8 mg/mL范圍內(nèi)的各海藻糖對照品溶液的測定，得出其相對偏差≤3.9%，平均相對偏差為1.4%[35]。王青云等建立了酶解法測定含多種糖的混合體系中海藻糖含量的測定方法，即利用海藻糖水解酶水解海藻糖為葡萄糖，再采用DNS法測定酶解前后樣品中還原糖含量并計算其差值，折算出樣品中海藻糖含量；結(jié)果表明，樣品回收率為91.12%～105.92%，相對標準偏差為 2.22%～3.43%，檢出限為 70 μg/mL[36]。

3.5 高效液相色譜法

在海藻糖的生產(chǎn)過程中，發(fā)酵液、酶反應液中除了主要成分海藻糖外，還會有少量的麥芽糖、葡萄糖、寡糖、多糖等，因此，只有將這幾種糖類完全分離，才能得到準確的測定結(jié)果。高效液相色譜法(HPLC)在定量分析海藻糖的方法中，準確度和重現(xiàn)性都非常好。HPLC法是利用同一時刻進入色譜柱的各組分，由于在流動相和固定相之間溶解、吸附、滲透或離子交換等作用的不同，隨流動相在色譜柱兩相之間反復多次的分配，由于各組分在色譜柱中的移動速度不同，經(jīng)過一定長度的色譜柱后，彼此分離開來，按順序流出色譜柱，進入信號檢測器，在記錄儀上或數(shù)據(jù)處理裝置上顯示出各組分的譜峰數(shù)值，根據(jù)保留時間用歸一化法或外標法定量。

周帥等為了測定17種食用菌中海藻糖、甘露醇和阿糖醇含量，采用了高效陰離子色譜-脈沖安培檢測法對其進行定量分析，研究顯示：阿糖醇、海藻糖和甘露醇的檢出限分別為0.41、0.04、2.11 μg/mL，定量限分別為1.14、0.10、5.79 μg/mL，線性范圍分別為 239.62～1.25、59.41～0.15、148.29～5.00 μg/mL，線性系數(shù)分別為 0.9990、0.9994、0.9989[37]。劉艷芳等以蛹蟲草子實體為材料，采用高效液相色譜法分析食用菌中海藻糖的含量，1 g子實體粉中加入 100 mL 90%乙醇熱回流提取 1 h，然后采用SUGAR SP0810柱(300 mm×8 mm)，超純水洗脫，流速0.5 mL/min，柱溫70℃，示差折光檢測器檢測，進樣量10 μL等色譜條件進行測定，研究結(jié)果顯示該方法準確度高，穩(wěn)定性、精密度、重現(xiàn)性好[38]。許麗等建立了一種高效陰離子交換-脈沖安培檢測(HPAE-PAD)測定化妝品中海藻糖的方法，采用METROSEP CARB 1分離柱(150 mm×4.0 mm)進行分離，以200.0 mmol/L的NaOH溶液為淋洗液，1.0 mL/min的流速，7 min內(nèi)測定樣品；海藻糖在1.0～40.0 mg/L內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)為0.99995，檢出限為 0.02 mg/L，峰面積的相對標準偏差為0.17%，保留時間的相對標準偏差為0.28%，平均回收率為95.2%～99.2%[39]。何秀全等利用高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測法(HPLC-ELSD)分析木薯葉片中海藻糖含量，樣品由水抽提，采用 Xbridge-NH2色譜柱，流動相乙腈∶水體積比為70∶30，水中含0.1% NH4OH；該方法在1～20 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(R2=0.9952)，精密度為 3.1%，平均回收率為100.7%，穩(wěn)定性試驗的RSD為3.1%[40]。劉海燕等用高效陰離子交換色譜-脈沖安培檢測食用菌中7種單糖和海藻糖，其中單糖提取的最佳工藝為：食用菌鮮樣需進行高速均質(zhì)處理2 min，食用菌干樣需在溫度 60℃下進行超聲處理 60 min；采用 CarboPac MA1色譜柱，流動相為去離子水∶600 mM NaOH溶液=20∶80等離子色譜檢測條件測定 7種單糖和海藻糖，研究發(fā)現(xiàn)，最低檢出限為5.5～63.6 μg/L，食用菌鮮樣和干樣的定量限分別為 0.37～4.24 mg/kg、3.68～42.39 mg/kg，方法加標回收率為76.1%～127.1%，相對標準偏差為1.44%～8.43%[41]。趙偉等建立了用 Xbridge-NH2色譜柱檢測葡萄糖、麥芽糖和海藻糖混合溶液中海藻糖的高效液相色譜方法，葡萄糖、麥芽糖、海藻糖的質(zhì)量濃度在0.1～4.0 g/100 mL時與峰面積呈良好線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.9998～0.9999，相對標準偏差為1.60%，回收率為98.2%～99.4%[42]。唐遠謀等利用高效液相色譜法測定卷柏全草中海藻糖的含量，采用 Sugar-D色譜柱(4.6 mm×250 mm×5 μm)示差檢測器，流動相為乙腈∶水=78∶22，流速為 1 mL/min；研究發(fā)現(xiàn)海藻糖在 0.3125～5 mL/min范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(R2=0.9999)，精密度為1.59%，穩(wěn)定性為3.05%，重復性為 3.99%，平均回收率為 104.9%，RSD為0.991%[43]。徐穎等建立了高效陰離子交換色譜-脈沖安培電化學檢測法測定海藻糖、葡萄糖和麥芽糖的分析方法，該方法可在15 min內(nèi)快速定量分析3種糖，其海藻糖、葡萄糖和麥芽糖峰面積與質(zhì)量濃度的線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)分別為0.9998、0.9998、0.9999，檢出限為0.010～0.100 mg/L，加標回收率為 89.4%～103.2%，檢測到海藻糖濃度為 101.084 g/L，轉(zhuǎn)化率達到了 50.5%[44]。張曰輝等建立了以Xbridge-NH2色譜柱檢測奶糖中海藻糖、葡萄糖、蔗糖和麥芽糖的高效液相色譜方法(HPLC)；葡萄糖、蔗糖、麥芽糖和海藻糖的精密度分別為1.6%、1.7%、1%、2.1%；在0～4 g/100 mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，其相關(guān)系數(shù)在 0.9997～0.9999之間，回收率在98.4%～99.9%之間；通過高效液相色譜法檢測結(jié)果可知，海藻糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖的含量分別為2.64%、1.0%、23.0%、15.1%[45]。宋金松等以土壤中篩選的產(chǎn)海藻糖合酶菌株發(fā)酵制得的粗酶液反應制取的轉(zhuǎn)化液為對象，加入糖化酶水解轉(zhuǎn)化液中剩余的麥芽糖，經(jīng)煮沸滅酶活后，采用以Sugar-PakTMⅠ為色譜柱的高效液相色譜法測定其海藻糖的含量，該方法所測的海藻糖含量與DNS比色法結(jié)果一致，均為1.5 g/100 mL[46]。

除了蒽酮比色法、紙層析法、薄層層析法、DNS比色法、高效液相色譜法定量分析海藻糖以外，研究發(fā)現(xiàn)還有其他檢測方法也可對海藻糖的含量進行測定。如胡磊等為了測定植物組織中海藻糖等糖類物質(zhì)的含量，采用氣相色譜分離、質(zhì)譜鑒定的分析方法對其進行乙?；苌幚?，其中溶劑和催化劑選用1-甲基咪唑，肟化和乙酰化試劑選用鹽酸羥胺和乙酸酐；以核糖醇為內(nèi)標，根據(jù)最佳衍生化條件下海藻糖所出峰高和樣品濃度、進樣量和分流比計算出海藻糖的最低檢測量為8.17×10-11g，適于植物樣品中微量海藻糖的分析測定[47]。陳暉等為了檢測藥用輔料的海藻糖含量，采取了離子色譜高效陰離子交換層析分離與高靈敏度、高選擇性的脈沖安培檢測器聯(lián)用技術(shù)對其進行定量分析；以30 mmol/L的NaOH溶液進行等度淋洗，海藻糖與雜質(zhì)的色譜分離度 R＞1.5；檢測限為 2 μg/L，定量限為 10 μg/L，精密度為0.42%，回收率為98.09%～100.0%，RSD為 0.58%[48]。苗佳等利用特異性海藻糖酶水解海藻糖生成葡萄糖，以固定化酶微電極為基礎的葡萄糖生物傳感分析儀對海藻糖水解產(chǎn)物進行快速定量檢測；該方法對海藻糖的檢測限為 0.019 mg/mL，定量限為0.1 mg/mL，在0.1～150.0 mg/mL范圍內(nèi)，樣品海藻糖含量與所得葡萄糖含量具有良好線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為 0.9998，回收率范圍為 98.80%～101.33%[49]。

4 海藻糖的應用前景

隨著海藻糖生產(chǎn)的不斷發(fā)展，海藻糖的優(yōu)良特性不斷地被人們發(fā)現(xiàn)，海藻糖的優(yōu)良品質(zhì)和性能使其成為近年來的研究熱點，在生物醫(yī)藥、化妝品、農(nóng)業(yè)、食品等方面的應用日趨廣泛，應用前景非常廣闊。利用海藻糖對干燥脫水、高溫、冷凍、高滲等逆性環(huán)境優(yōu)良的抗逆保護作用，海藻糖可作為生物和醫(yī)學領(lǐng)域的活性大分子的優(yōu)良保護劑，作為疫苗、蛋白質(zhì)藥物、活菌制劑、血液制品、淋巴細胞、活體組織等生物活性物質(zhì)的穩(wěn)定劑。此外，海藻糖還可用于保存皮膚、血液、生殖細胞和活體器官等，其對骨質(zhì)疏松癥、亨廷頓舞蹈癥等也有一定的治療作用。海藻糖顯示的細胞保護能力、保濕性、抗輻射特性以及穩(wěn)定活性成分的作用，也使海藻糖和它的衍生物成為化妝品的重要原料之一。利用海藻糖對低溫、高溫、鹽堿、干旱等逆境條件下的抗性，可把海藻糖合成相關(guān)的酶基因?qū)胱魑锊⑹蛊湓谧魑矬w內(nèi)表達，以培育出能抗旱、抗寒、抗凍、耐鹽的作物新品種。海藻糖對酸和熱的穩(wěn)定性以及非還原性，在食品的加工穩(wěn)定性中也有廣泛的用途，利用海藻糖與水分子極易結(jié)合即水合性高這一特點，能夠抑制年糕、米飯、面制品等由于淀粉的老化產(chǎn)生的硬化等問題，顯著地延長含淀粉食品的貨架期[2]。

隨著海藻糖應用領(lǐng)域的快速拓展，目前國際市場對海藻糖的需求量很大，國內(nèi)過去所用的海藻糖基本都是從日本進口，用酶轉(zhuǎn)化法以及基因工程法生產(chǎn)海藻糖產(chǎn)品的市場空間很大，因此開發(fā)海藻糖制備新工藝，替代進口產(chǎn)品，對提高我國海藻糖制備技術(shù)的自主創(chuàng)新能力，滿足國內(nèi)外市場需求，具有重大意義。由于國內(nèi)現(xiàn)有的功能性糖生產(chǎn)設備和工藝可改造并用于海藻糖的生產(chǎn)，因此加快對海藻糖工業(yè)化生產(chǎn)的核心技術(shù)研究和應用開發(fā)，必將推動我國功能性糖行業(yè)產(chǎn)品的結(jié)構(gòu)調(diào)整和質(zhì)量提升，同時也給我國食品工業(yè)及相關(guān)行業(yè)新產(chǎn)品的開發(fā)帶來新的機遇。

5 展望

目前在實驗室和生產(chǎn)上制備海藻糖主要有4種方法：一是從生物細胞中提取；二是采用微生物發(fā)酵生產(chǎn)；三是以碳水化合物為底物采用海藻糖合成酶催化合成；四是利用工程微生物或構(gòu)建具有抗逆性的轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)。隨著生物技術(shù)的快速發(fā)展，對于海藻糖的研究也需更加深入，筆者建議可以從以下幾個方面加強研究：①對于海藻糖相關(guān)生產(chǎn)菌株需進一步探索，可以應用分子生物學方法如基因重排技術(shù)改良工程菌培育出產(chǎn)量較高的生產(chǎn)菌株；②應用定點突變技術(shù)對酶分子進行定向改造來嘗試增加海藻糖產(chǎn)物的得率，在基因組水平研究海藻糖合酶的結(jié)構(gòu)特性，分析相關(guān)酶類代謝機制以及酶三維結(jié)構(gòu)，并通過各種組學手段延長海藻糖合酶的使用周期，減少酶的失活機率；③通過宏基因組學提取環(huán)境中全部微生物的總基因組，克隆到合適的可培養(yǎng)微生物宿主中來篩選目的基因，拓展海藻糖合成相關(guān)基因的來源。