銅綠假單胞菌性角膜炎發(fā)病機(jī)制的研究進(jìn)展

王 嵐，李 妍，孫子雯，胡竹林

0 引言

角膜作為眼球最先接觸外界的部分，容易受外傷，易與細(xì)菌、真菌、病毒等各類微生物接觸，從而引發(fā)感染性角膜炎[1]。銅綠假單胞菌(pseudomonas aeruginosa,PA)是角膜細(xì)菌感染最常見的病原菌之一[2]。PA誘發(fā)的角膜炎發(fā)展迅速，并且極具破壞性[3]，通常在24～48h內(nèi)迅速發(fā)展為急性化膿性潰瘍,角膜中央會(huì)形成白色浸潤(rùn)，分泌膿性分泌物，角膜基質(zhì)凝固性壞死[4]。若治療不及時(shí)，隨著病情的快速發(fā)展，角膜可溶解穿孔，甚至造成不可逆結(jié)局，最終需摘除眼球[5]。即使積極治療，在潰瘍治愈后也可能會(huì)留有后遺癥，患者甚至最終會(huì)出現(xiàn)永久性視力障礙[6]。銅綠假單胞菌性角膜炎(以下簡(jiǎn)稱PA角膜炎)不但發(fā)病率高，而且臨床治療棘手，主要原因是針對(duì)PA角膜炎的發(fā)病機(jī)制沒(méi)有明確的研究結(jié)果[7]。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外對(duì)于PA引起角膜炎癥的發(fā)病機(jī)制已有較多研究與報(bào)道，目的是針對(duì)發(fā)病各環(huán)節(jié)的特異性治療靶點(diǎn)，為尋找有效的治療提供理論依據(jù)[8-9]?，F(xiàn)階段研究發(fā)現(xiàn)，造成PA角膜炎的主要發(fā)病機(jī)制與PA的侵襲力、毒力因子以及角膜的免疫應(yīng)答有關(guān)。本文就有關(guān)的發(fā)病機(jī)制的研究進(jìn)展進(jìn)行總結(jié)。

1 PA侵襲力

PA能入侵并定植于角膜，大量繁殖、進(jìn)行侵襲，短時(shí)間內(nèi)形成潰瘍?cè)畈⑻颖芩拗髅庖?，這有賴于PA的侵襲力。PA的侵襲力包括粘附性、群體感應(yīng)及生物膜形成。

1.1 粘附性PA不能附著于完整的角膜上皮，只有在缺損的角膜表面粘附才有機(jī)會(huì)進(jìn)行繁殖擴(kuò)散、聚積毒力直至侵入組織并導(dǎo)致感染。PA表面可產(chǎn)生多種粘附因子，其中鞭毛、菌毛和凝集素與角膜上皮細(xì)胞表面受體相互作用，參與細(xì)菌在人角膜的定植和感染。PA鞭毛可與受損角膜上皮的唾液酸鞘糖脂GM1(sialo-GM1)結(jié)合，介導(dǎo)細(xì)菌脂多糖(lipopolysaeeharide，LPS)的粘附作用[10]，并且缺失鞭毛后PA不能粘附于角膜。Ⅳ型菌毛產(chǎn)生的菌毛蛋白可粘附于細(xì)胞表面的黏蛋白，參與感染過(guò)程中的定植[9]。凝集素可識(shí)別宿主細(xì)胞的細(xì)菌胞外糖蛋白，介導(dǎo)PA粘附，加重角膜損傷[11]?？贡廾贵w對(duì)PA定植有潛在的預(yù)防作用，針對(duì)Ⅳ型菌毛的小分子抑制劑可阻礙菌毛的組裝與分離，降低PA粘附性[12]，目前已有報(bào)道可證明凝集素抑制劑能阻斷凝集素與受損角膜表面的細(xì)胞結(jié)合，減少PA對(duì)上皮細(xì)胞的粘附[13]。

1.2 群體感應(yīng)系統(tǒng)群體感應(yīng)系統(tǒng)(quorum sensing system,QS)是PA與宿主細(xì)胞之間進(jìn)行信號(hào)傳導(dǎo)的通訊系統(tǒng)。PA粘附于受損角膜后，可分泌大量信號(hào)分子，QS感知信號(hào)分子濃度來(lái)感應(yīng)群體的密度，并調(diào)控與毒力產(chǎn)生、生物膜形成、生長(zhǎng)定植等相關(guān)的基因[14]，來(lái)增強(qiáng)PA對(duì)角膜微環(huán)境的適應(yīng)性，最終形成利于PA侵襲、定植于角膜的優(yōu)勢(shì)表型[14-15]，造成角膜的急性感染。

目前研究報(bào)道的PA有4個(gè)群體感應(yīng)子系統(tǒng)：Las、Rhl、Pqs、Iqs。PA角膜炎主要受Las和Rhl系統(tǒng)調(diào)控[16]。這兩個(gè)系統(tǒng)的共同點(diǎn)是以AHL(N-acylhomoserine lactose)作為信號(hào)分子。Las系統(tǒng)編碼LasI和LasR，LasI促3OC12-HSL(N-3-oxo-dodecanoyl-homoserine lactone)信號(hào)分子產(chǎn)生。當(dāng)PA群體濃度達(dá)到閾濃度時(shí)，3OC12-HSL分子與LasR結(jié)合，啟動(dòng)QS調(diào)控基因的表達(dá)。LasR調(diào)節(jié)如彈性蛋白酶(LasB)、外毒素A(ToxA)、氰化氫(hcnABC)等多種毒力因子的表達(dá)[17]。這些毒力因子不僅能夠增強(qiáng)細(xì)菌自身侵襲力，破壞角膜上皮細(xì)胞的屏障功能，還可以刺激宿主產(chǎn)生免疫應(yīng)答，誘導(dǎo)急性炎癥導(dǎo)致嚴(yán)重的角膜損害。Rhl系統(tǒng)由RhlI和RhlR組成。RhlI參與促C4-HSL(N-butanoyl-homoserine lacton)產(chǎn)生，并調(diào)控次級(jí)代謝產(chǎn)物如鼠李糖脂、綠膿菌素的釋放[2,14]，協(xié)同毒力因子，對(duì)宿主免疫系統(tǒng)進(jìn)行攻擊，降低宿主對(duì)細(xì)菌的吞噬，抵抗宿主防御機(jī)制。在Zhu等[18]進(jìn)行的臨床報(bào)道中指出他們納入研究的所有細(xì)菌性角膜炎患者，角膜潰瘍組織培養(yǎng)物中均含LasI，LasR，RhlI和RhlR，表明QS在角膜炎致病機(jī)制中起重要作用。

Las和Rhl系統(tǒng)的群體感應(yīng)抑制劑可降低AHL合酶的活性，通過(guò)與LasR和RhlR結(jié)合競(jìng)爭(zhēng)性抑制AHL產(chǎn)生，從而阻斷毒力因子的表達(dá)[19]。該方法能預(yù)防或減少病原菌生物膜形成，降低細(xì)菌毒力，降低產(chǎn)生抗生素耐藥性的風(fēng)險(xiǎn)。

1.3 生物膜形成當(dāng)PA粘附于宿主表面時(shí)，細(xì)菌可以向胞外分泌粘性物質(zhì)，將形成的微菌落包裹并在QS的調(diào)節(jié)下逐漸形成生物膜[9]。生物膜除了可以牢固粘附于宿主細(xì)胞表面之外，還可以分泌胞外聚合物和毒力因子，不但使生物膜具有自身的空間結(jié)構(gòu)，保護(hù)細(xì)菌免受宿主的免疫攻擊，還能改變菌體結(jié)構(gòu)或表型，逃避免疫識(shí)別，因此生物膜可能是PA角膜炎產(chǎn)生抗生素抗藥性，導(dǎo)致治療效果不佳的主要原因[20]。細(xì)菌性角膜炎傾向于急性感染，而生物膜多引起持續(xù)性感染，因此以往對(duì)于生物膜的形成在角膜炎致病機(jī)制中的研究較少。Saraswathi等[21]建立PA角膜炎小鼠模型，并通過(guò)裂隙燈、共聚焦顯微鏡及電鏡等多種成像方法證明PA感染角膜后可形成成熟的細(xì)菌生物膜，并且成像結(jié)果顯示生物膜發(fā)育的所有階段都存在于該動(dòng)物模型中。該研究為生物膜的形成是PA角膜炎的致病因素提供了強(qiáng)有力的證據(jù)。

生物膜的形成主要依賴于PA群落的粘附，所以目前普遍認(rèn)為主要以減少PA粘附及抑制群體感應(yīng)是抑制生物膜形成的有效策略[22]。噬菌體通過(guò)裂解感染的PA，降低生物膜的活性，也可成為輔助治療角膜炎的手段之一。Fukuda等[23]建立重度感染的PA角膜炎小鼠模型，隨后使用噬菌體在受損角膜局部給藥，接受噬菌體治療的小鼠比未接受噬菌體治療的病程明顯縮短，且炎癥反應(yīng)也更輕，顯示了未來(lái)局部使用噬菌體作為抗生素替代品治療角膜炎的可能性。

2 PA的毒力因子

毒力因子對(duì)PA的致病性也有影響。PA釋放毒力因子可損傷宿主細(xì)胞正常結(jié)構(gòu)，破壞宿主的生理功能。內(nèi)毒素是革蘭氏陰性菌的細(xì)胞壁成分,主要是LPS介導(dǎo)PA侵犯角膜，在細(xì)菌粘附、生物膜形成、誘導(dǎo)炎癥因子表達(dá)中起作用。但是PA所分泌的胞外產(chǎn)物和毒素才是造成角膜炎病情發(fā)展迅速的重要原因。除了毒力因子本身對(duì)角膜造成直接損傷外，這些成分還可以使角膜蛋白被分解，造成角膜溶解，引起免疫應(yīng)答等介導(dǎo)損傷[24]。在已有的研究報(bào)道中可證明PA的Ⅱ型分泌系統(tǒng)、Ⅲ型分泌系統(tǒng)及其毒力因子(即效應(yīng)蛋白)是PA角膜炎的致病機(jī)制之一。

2.1 Ⅱ型分泌系統(tǒng)Ⅱ型分泌系統(tǒng)負(fù)責(zé)釋放分泌性毒力因子，如LasB、ToxA、綠膿菌素等。LasB可分解彈性蛋白、纖維蛋白和角膜基質(zhì)成分中的膠原蛋白，降解宿主免疫系統(tǒng)內(nèi)的組分。還能進(jìn)一步激活角膜基質(zhì)的金屬蛋白酶和激肽釋放酶，快速降解細(xì)胞外基質(zhì)，破壞角膜組織，促血管通透性增加，引起組織水腫[25]。ToxA一方面使細(xì)胞蛋白質(zhì)合成障礙，另一方面與抗體結(jié)合加重角膜組織損傷。Hazllet等[26]通過(guò)電鏡觀察到ToxA對(duì)角膜上皮、內(nèi)皮細(xì)胞有細(xì)胞毒作用，導(dǎo)致基質(zhì)細(xì)胞腫脹，在造成角膜潰瘍起到了重要作用。在Caballero等[27]的研究中，蛋白酶Ⅳ已被證明是PA角膜炎的關(guān)鍵毒力因子，可以直接毒性損傷角膜，并且能降解宿主免疫過(guò)程中起重要作用的免疫蛋白，如補(bǔ)體和IgG，造成細(xì)菌感染[25]。

2.2 Ⅲ型分泌系統(tǒng)Ⅲ型分泌系統(tǒng)具有類似針管的特殊結(jié)構(gòu)，Ⅲ型分泌蛋白(即毒力因子)可直接從細(xì)菌胞質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞，發(fā)揮毒力，引起急性角膜炎癥[28]。Ⅲ型分泌系統(tǒng)分泌的效應(yīng)蛋白主要是4種胞外酶，與眼損傷最為相關(guān)的是ADPR轉(zhuǎn)移酶ExoS和脂酶ExoU[29]。ExoS可減弱巨噬細(xì)胞對(duì)PA的清除，并且ExoS可干擾宿主細(xì)胞的信號(hào)傳導(dǎo)，誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞凋亡而抑制對(duì)細(xì)菌的殺傷，增強(qiáng)PA對(duì)角膜的侵襲力[30]。ExoU自身具有較強(qiáng)破壞性，對(duì)組織危害極大?；罨蟮腅xoU注入角膜上皮細(xì)胞時(shí)，引起上皮細(xì)胞急性細(xì)胞毒反應(yīng)[24]，導(dǎo)致細(xì)胞快速裂解，釋放大量炎癥因子，破壞大量角膜組織。并且ExoU還與細(xì)菌的免疫逃避有關(guān)，該酶攻擊中性粒細(xì)胞，抑制中性粒細(xì)胞在炎癥部位的募集，造成局部免疫抑制[31]。近年來(lái)已發(fā)現(xiàn)多種小分子抑制劑或抗體疫苗[32]。通過(guò)調(diào)控分泌系統(tǒng)的轉(zhuǎn)錄過(guò)程，破壞轉(zhuǎn)位裝置，影響蛋白功能，直接或間接影響分泌系統(tǒng)的表達(dá)或功能，減輕PA感染對(duì)角膜造成的病理?yè)p傷。

3 宿主免疫反應(yīng)

在PA感染后期，即使及時(shí)使用抗生素進(jìn)行針對(duì)性治療，但角膜仍可出現(xiàn)明顯的上皮水腫基質(zhì)潰瘍,繼而導(dǎo)致角膜組織破壞，視力喪失。角膜浸潤(rùn)主要是感染早期的PA致病因子在起作用，而組織降解、角膜穿孔等過(guò)程更多是由宿主的炎癥反應(yīng)引起的。炎癥反應(yīng)是細(xì)菌清除的必要環(huán)節(jié)，可過(guò)度的宿主炎癥會(huì)加重病理組織損傷[33]。

3.1 固有免疫角膜固有免疫防御對(duì)阻止細(xì)菌入侵眼部至關(guān)重要。角膜上皮不僅是抵御細(xì)菌損害的物理屏障，角膜上皮細(xì)胞和角膜基質(zhì)成纖維細(xì)胞還可以表達(dá)Toll樣受體(Toll like receptor,TLR)。PA感染后，Toll樣受體識(shí)別細(xì)菌的毒力因子，激活促炎細(xì)胞因子的快速產(chǎn)生，例如IL-1、IL-6等。其中IL-1是角膜炎癥反應(yīng)起始因子之一，在Yan等[34]建立的動(dòng)物模型中可發(fā)現(xiàn)IL-1活性升高與炎癥程度相關(guān)，IL-1介導(dǎo)宿主防御的急性炎癥反應(yīng)，具有較強(qiáng)的破壞作用。IL-6被認(rèn)為在PA感染早期對(duì)保護(hù)角膜起重要作用。IL-1能刺激IL-6產(chǎn)生，IL-6可調(diào)節(jié)白細(xì)胞募集到炎癥部位，并調(diào)節(jié)補(bǔ)體的表達(dá)，殺傷細(xì)菌控制感染。Cole等[35]已經(jīng)證明IL-6在PA感染的角膜組織中快速上調(diào)，并且IL-6基因缺陷型小鼠與野生型相比，病程延長(zhǎng)，炎癥反應(yīng)更重，預(yù)后更差。IL-1、IL-6等可以趨化多核中性粒細(xì)胞(polymorphonuclear,PMN)向病變部位集中，募集的PMN浸潤(rùn)于感染角膜，引起炎癥反應(yīng)以清除細(xì)菌。但過(guò)量PMN浸潤(rùn)可使病情惡化，促角膜穿孔：(1)PMN產(chǎn)生的活性氧物質(zhì)可對(duì)角膜上皮和內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行氧化攻擊，導(dǎo)致角膜水腫。(2)PMN可釋放金屬蛋白酶，活化后使角膜基質(zhì)降解，導(dǎo)致潰瘍[24]。

3.2 特異性免疫機(jī)體抵抗PA的特異性免疫主要是由CD4+T細(xì)胞介導(dǎo)。CD4+T輔助細(xì)胞(Th細(xì)胞)可能的分化途徑包括Th1、Th2和Th17細(xì)胞。Th1細(xì)胞分泌IL-12、IFN-γ，激活細(xì)胞免疫應(yīng)答，產(chǎn)生的細(xì)胞因子可以活化巨噬細(xì)胞，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的殺傷效力，并參與CD8+T細(xì)胞增殖，發(fā)揮T細(xì)胞的細(xì)胞毒性，清除病原體。Th1細(xì)胞在促殺菌活性的同時(shí)，不斷募集的PMN促進(jìn)炎癥反應(yīng)可導(dǎo)致組織損傷，嚴(yán)重時(shí)可發(fā)展至不可逆階段[36]。Th2細(xì)胞主要分泌IL-4、IL-10，引起體液免疫應(yīng)答。這類細(xì)胞因子以抗炎為主，IL-4能夠抑制角膜新生血管的產(chǎn)生，IL-10能抑制活性氧物質(zhì)所產(chǎn)生的氧化作用，并拮抗Th1型反應(yīng)所引起的過(guò)度炎癥反應(yīng)對(duì)組織的破壞作用[37]，Th2細(xì)胞減輕了自身抗原所產(chǎn)生的免疫反應(yīng)，但是卻容易使病程遷延，造成慢性感染。在相關(guān)的研究中表明，傾向于Th1型反應(yīng)的C57BL/6小鼠角膜感染PA后在感染早期即可出現(xiàn)角膜混濁，角膜基質(zhì)及前房有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，病情較重，進(jìn)展迅速，極易導(dǎo)致角膜穿孔。BALB/c小鼠更傾向于Th2型反應(yīng)，感染后相較于C57BL/6小鼠病程更長(zhǎng)，但角膜潰瘍或穿孔的發(fā)生率卻明顯更低[38]。因此Th1和Th2型免疫應(yīng)答的促炎與抗炎平衡對(duì)角膜炎的病程發(fā)展起到重要作用。Th17細(xì)胞分泌IL-17協(xié)助PMN遷移至組織損傷部位，促局部炎癥加重。也有研究者提出Th17應(yīng)答通過(guò)促炎細(xì)胞因子IL-17與PA慢性感染中的Th2途徑合并[10]，與持續(xù)性的炎癥反應(yīng)有關(guān)。針對(duì)細(xì)胞因子，使用免疫調(diào)節(jié)劑調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答，能減輕炎性細(xì)胞浸潤(rùn)對(duì)角膜的損害[39]?；|(zhì)金屬蛋白酶抑制劑能抑制PA介導(dǎo)的對(duì)角膜細(xì)胞的膠原降解。IL-6受體阻斷劑現(xiàn)已應(yīng)用于IL-6介導(dǎo)的葡萄膜炎、角膜燒傷等眼部疾病[40]，局部應(yīng)用IL-1β的天然抑制劑IL-1Ra，可抑制角膜的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)[41]。

4 結(jié)語(yǔ)

PA角膜炎發(fā)病率高且起病急、發(fā)展快、易致盲。局部使用抗生素是治療的首選方法，然而，逐漸增加的抗生素耐藥性為角膜炎的治療增加了難度。當(dāng)PA接觸受損角膜表面后，可粘附于角膜進(jìn)行繁殖，產(chǎn)生粘附因子作用于角膜造成急性感染，并通過(guò)群體感應(yīng)系統(tǒng)和蛋白質(zhì)分泌系統(tǒng)釋放毒力因子，加重角膜損傷。浸潤(rùn)細(xì)胞快速募集至感染部位引起炎癥反應(yīng)清除細(xì)菌，除此之外，還可以協(xié)助激活特異性免疫反應(yīng)。特異性免疫應(yīng)答在清除細(xì)菌的同時(shí)，過(guò)強(qiáng)的炎性作用會(huì)加重炎性細(xì)胞浸潤(rùn)造成角膜組織的溶解壞死，相反，抗炎作用過(guò)強(qiáng)使未被清除的PA可繼續(xù)生長(zhǎng)繁殖形成生物膜，造成持續(xù)性的炎癥和損傷，因此特異性免疫應(yīng)答的促炎抗炎平衡也極為重要，綜上所述，PA角膜炎的發(fā)生發(fā)展及病情轉(zhuǎn)歸預(yù)后受PA致病因素與宿主免疫應(yīng)答共同影響。明確PA角膜炎的發(fā)病機(jī)制并進(jìn)行深入研究，阻斷發(fā)病過(guò)程中的各個(gè)環(huán)節(jié)，尋找相應(yīng)的抑制劑將有助于推動(dòng)替代治療的發(fā)展，為其治療提供新的策略。