微小RNA在卵巢顆粒細(xì)胞中的研究進(jìn)展

魏超峰，連方

卵泡的發(fā)生需要卵母細(xì)胞和周圍體細(xì)胞間密切的交流。始基卵泡被單層扁平顆粒細(xì)胞包裹。當(dāng)顆粒細(xì)胞變成柱狀時(shí)，形成初級卵泡；然后顆粒細(xì)胞增殖，變?yōu)閺?fù)層形成次級卵泡。隨后在卵泡內(nèi)形成充滿液體的小空腔，這些空腔合并形成早期竇狀卵泡。垂體卵泡刺激素（follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH）刺激卵泡進(jìn)一步生長，空腔繼續(xù)擴(kuò)大，形成排卵前卵泡。黃體生成激素（luteinizing hormone，LH）峰到來后，激活排卵前卵泡，卵丘細(xì)胞擴(kuò)張，同時(shí)卵母細(xì)胞恢復(fù)減數(shù)分裂，開始成熟過程。最終形成成熟的卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體（cumulus-oocyte complex，COC），準(zhǔn)備排卵和隨后的受精。卵母細(xì)胞的生長需要足夠的能量、信息來完成許多重要的細(xì)胞事件，包括蛋白質(zhì)和轉(zhuǎn)錄物的積累以及表觀遺傳學(xué)的修飾。卵丘顆粒細(xì)胞通過特殊的縫隙連接吸收葡萄糖并將代謝產(chǎn)物及信息轉(zhuǎn)運(yùn)傳遞到卵母細(xì)胞[1]?？梢娫诼涯讣?xì)胞發(fā)生直至成熟、排卵的過程中，顆粒細(xì)胞發(fā)揮了重要的作用。顆粒細(xì)胞的功能受到多個(gè)水平調(diào)控，其中微小RNA（microRNAs，miRNAs）作為轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控分子，近年在顆粒細(xì)胞中的作用受到廣泛關(guān)注。MiRNAs是一些5′端帶磷酸基團(tuán)、3′端帶羥基，長度約為19～25個(gè)核苷酸的非編碼調(diào)控RNA。其通過與靶mRNA的3′端非翻譯區(qū)（untranslated region，UTR）結(jié)合，介導(dǎo)翻譯調(diào)控miRNAs與靶mRNA的3′-UTR區(qū)是一種非完全互補(bǔ)結(jié)合，阻止靶mRNA的翻譯，影響蛋白質(zhì)表達(dá)水平，從而抑制基因表達(dá)。綜述miRNAs在顆粒細(xì)胞中的研究進(jìn)展。

1 MiRNAs與顆粒細(xì)胞增殖、分化

顆粒細(xì)胞是支持卵泡生長和卵母細(xì)胞發(fā)育的關(guān)鍵部分，顆粒細(xì)胞的增殖和終末分化對卵泡成熟及排卵至關(guān)重要。既往研究發(fā)現(xiàn)小鼠中負(fù)責(zé)增殖和分化的基因周期蛋白D2（cyclinD2，CCND2）和分子質(zhì)量為27 ku的熱穩(wěn)定蛋白（p27 kinase inhibit protein1，P27）的缺失，導(dǎo)致顆粒細(xì)胞增殖減少和黃體生成受損，從而導(dǎo)致不成熟卵泡生成和排卵失敗。Andreas等[2]通過對牛卵巢顆粒細(xì)胞研究，發(fā)現(xiàn)miR-17-92簇通過靶向人第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源的基因（phosphataseand tensin homologuedeleted on chromosometen，PTEN）和骨形成蛋白受體2基因（bone morphogenetic protein receptorⅡ，BMPR2）調(diào)控顆粒細(xì)胞增殖和分化，miR-17-92簇的過度表達(dá)促進(jìn)了顆粒細(xì)胞的增殖，降低了分化細(xì)胞的比例，抑制miR-17-92簇的表達(dá)導(dǎo)致顆粒細(xì)胞增殖減少和分化增強(qiáng)。有研究發(fā)現(xiàn)miR-93通過靶向細(xì)胞周期蛋白依賴激酶抑制因子1A（cyclin-dependent kinase inhibitor1A，CDKN1A）促進(jìn)多囊卵巢綜合征（polycystic ovary syndrome，PCOS）患者卵巢顆粒細(xì)胞增殖以及從G1期向S期轉(zhuǎn)化[3]。另有研究發(fā)現(xiàn)在PCOS患者中miR-335-5p通過靶向抑制血清和糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的蛋白激酶3（serum-and glucocorticoid regulated protein kinase 3，SGK3）的表達(dá)，抑制顆粒細(xì)胞的增殖[4]。陳龍等[5]發(fā)現(xiàn)miR-184在PCOS組織中呈高表達(dá)，且miR-184能夠促進(jìn)卵巢顆粒細(xì)胞的增殖，其作用機(jī)制與絲裂原激活的蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號通路的激活有關(guān)。這些結(jié)果提示miRNA可能是改善PCOS顆粒細(xì)胞功能紊亂的新的分子靶點(diǎn)。對早發(fā)性卵巢功能不全（premature ovarian insufficiency，POI） 患者的研究發(fā)現(xiàn)，miR-379-5p在顆粒細(xì)胞中差異表達(dá)，隨后的功能研究證實(shí)miR-379-5p的過度表達(dá)通過靶向聚腺苷二磷酸核糖基聚合酶基因（poly ADP-ribose polymerase 1，PARP1）和X-射線損傷修復(fù)基因6（X-ray complementing defective repair inchinese hamster cells 6，XRCC6）抑制了顆粒細(xì)胞的增殖，這可能是miRNAs參與POI發(fā)病機(jī)制的一種途徑[6]。Ai等[7]發(fā)現(xiàn)miR-181b、miR-15a和 miR-30d 在 卵 巢 早 衰（premature ovarian failure，POF）患者中的表達(dá)顯著升高，進(jìn)一步研究證實(shí)miR-15a靶向大腫瘤抑制因子1（large tumor suppressor gene 1，Lats1）3′UTR不僅抑制了顆粒細(xì)胞的增殖和生長，而且誘導(dǎo)了顆粒細(xì)胞的衰老。Zhang等[8]對卵巢反應(yīng)不良（poor ovarian response，POR）的年輕患者研究發(fā)現(xiàn)，miR-15a-5p表達(dá)顯著升高，其通過調(diào)節(jié)磷脂酰肌醇3激酶-蛋白激酶B-哺乳動物的雷帕霉素靶（phosphatidylinositol 3-kinase-protein kinase B-mammalian target of rapamycin，PI3K-AKT-mTOR）信號途徑抑制顆粒細(xì)胞增殖?？梢妋iRNAs在POF、POR發(fā)病過程中扮演了相關(guān)角色。

顆粒細(xì)胞的增殖-凋亡平衡對于卵巢內(nèi)的激素微環(huán)境、卵子及之后胚胎的形成和生長發(fā)育都具有極其重要的影響。蔣秀敏等[9]通過人為調(diào)控對miR-483-5p進(jìn)行超表達(dá)，發(fā)現(xiàn)超表達(dá)后顆粒細(xì)胞的增殖受抑制，凋亡率增加，并證實(shí)miR-483-5p通過靶向細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶1（extracelluar signal regulated kinase 1，ERK1）參與調(diào)控人類顆粒細(xì)胞增殖凋亡平衡。研究發(fā)現(xiàn)miR-383可通過抑制細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)，將顆粒細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期，進(jìn)而抑制卵泡顆粒細(xì)胞的增殖[10]。Yerushalmi等[11]對從未成熟卵體外成熟培養(yǎng)技術(shù)（in vitro maturation，IVM）獲得的生發(fā)泡COC中獲得的卵丘顆粒細(xì)胞和從體外受精 技 術(shù) （in vitro fertilization，IVF） 獲 得 的 M Ⅱ（metaphaseⅡ）COC中獲得的卵丘顆粒細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組和微單體進(jìn)行了綜合分析，鑒定出43個(gè)差異表達(dá)的miRNAs，且在MⅡCOC細(xì)胞中所表達(dá)的miRNAs均上調(diào)，這表明miRNAs在排卵后期的主要作用是控制和抑制顆粒細(xì)胞的增殖。

2 MiRNAs與顆粒細(xì)胞凋亡

女性出生時(shí)卵巢中約有200萬個(gè)原始卵泡，最終僅有約400個(gè)卵泡可成功排出，99%的卵泡因?yàn)殚]鎖而均未得到利用，因此提高卵泡的利用率尤為重要。而卵泡閉鎖的基本機(jī)制是顆粒細(xì)胞凋亡，研究發(fā)現(xiàn)過早去除未成熟卵母細(xì)胞中的卵丘顆粒細(xì)胞，會導(dǎo)致成熟促進(jìn)因子水平持續(xù)降低，存活因子、營養(yǎng)素和細(xì)胞周期蛋白的耗竭，減數(shù)分裂能力的降低、促凋亡因子以及凋亡因子的增加，最終導(dǎo)致卵母細(xì)胞凋亡[12]。已有研究發(fā)現(xiàn)顆粒細(xì)胞凋亡受到miRNAs的影響。研究發(fā)現(xiàn)miR-1275通過直接與肝受體同源物1（LRH-1）的3′UTR結(jié)合來減弱LRH-1的表達(dá)，阻止了LRH-1蛋白與細(xì)胞色素P450家族19亞家族A多肽1（cytochrome P450 family 19 subfamily Amember 1，CYP19A1）啟動子的相互作用，抑制了雌二醇（E2）的合成，促進(jìn)了顆粒細(xì)胞的凋亡[13]。Sun等[14]研究發(fā)現(xiàn)miR-204通過靶向腫瘤蛋白翻譯控制1（tumor protein translationally-controlled 1，TPT1，一種腫瘤生長相關(guān)蛋白）抑制卵巢顆粒細(xì)胞增殖、促進(jìn)凋亡。miR-204在PCOS患者的顆粒細(xì)胞和卵巢皮質(zhì)組織中表達(dá)下降，使得TPT1過度表達(dá)，抑制了miR-204誘導(dǎo)的顆粒細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期改變。miR-204提高G2/M期細(xì)胞比例，降低S期細(xì)胞比例，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。研究發(fā)現(xiàn)與PCOS患者和正?；颊叩念w粒細(xì)胞水平相比，POR患者的顆粒細(xì)胞中miR-23a水平升高，miR-23a的過度表達(dá)降低了抗凋亡蛋白B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2（B-cell lymphoma/leukemia-2，Bcl-2）的水平，升高了凋亡相關(guān)蛋白半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶3（caspase-3）的水平，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，與抑制劑組和陰性對照組相比，miR-23a模擬物轉(zhuǎn)染細(xì)胞的ERK1/2磷酸化明顯降低[15]。這些結(jié)果提示miR-23a通過激活ERK1/2信號通路誘導(dǎo)人卵巢顆粒細(xì)胞凋亡。此外，在對卵巢儲備功能減退（diminished ovarian reserve，DOR）患者的研究中發(fā)現(xiàn)，有15種miRNAs在DOR患者的顆粒細(xì)胞及血清中差異表達(dá)，其中miR-106a顯著下調(diào)，證實(shí)其可能通過凋亡信號調(diào)節(jié)激酶1（apoptosis signal-regulating kinase 1，ASK1） 信號通路，降低顆粒細(xì)胞活力，促進(jìn)顆粒細(xì)胞凋亡，從而參與DOR的發(fā)病機(jī)制[16]。對鼠POF模型的研究發(fā)現(xiàn)，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來源的外顯子攜帶的miR-644-5p，通過靶向p53基因抑制卵巢顆粒細(xì)胞凋亡，提示miR-644-5p具有治療POF和恢復(fù)卵巢功能的作用[17]。MiR-21和miR-132/212在人絨毛膜促性腺激素誘導(dǎo)的排卵過程中表達(dá)增加，影響顆粒細(xì)胞的凋亡，調(diào)節(jié)排卵過程[18]。Zhang等[19]研究發(fā)現(xiàn)miR-21參與了去甲腎上腺素介導(dǎo)的顆粒細(xì)胞凋亡，且通過靶向與果蠅Mad蛋白及線蟲Sma蛋白具有同源性的蛋白質(zhì)家族7（Smad7）阻斷顆粒細(xì)胞凋亡。有證據(jù)表明miR-Let7g可通過線粒體途徑促進(jìn)顆粒細(xì)胞凋亡，進(jìn)而引起卵泡閉鎖[20]。Du等[21]發(fā)現(xiàn)miR-143通過靶向下調(diào)FSH受體的表達(dá)，降低細(xì)胞內(nèi)蛋白激酶A（protein kinase A，PKA）和蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）等信號分子水平，誘導(dǎo)豬顆粒細(xì)胞凋亡和卵泡閉鎖。miR-34a可通過調(diào)控Bcl-2、Bcl相關(guān)X蛋白 （Bclassociated X protein，Bax）等凋亡相關(guān)的蛋白與基因的表達(dá)，促進(jìn)人顆粒細(xì)胞凋亡[22]?？梢妋iRNAs在顆粒細(xì)胞凋亡的調(diào)控過程中占據(jù)重要地位，對于與顆粒細(xì)胞凋亡異常密切相關(guān)的疾病，如PCOS、DOR和POF等，特定的miRNAs水平可在一定程度上反映疾病的狀態(tài)，miRNAs類似物或抑制劑有望成為新的治療手段。

3 MiRNAs與顆粒細(xì)胞性激素分泌

女性生殖內(nèi)分泌功能受下丘腦-垂體-性腺（HPG）軸的調(diào)節(jié)，是一個(gè)具有層次性、具有反饋與負(fù)反饋的機(jī)制。下丘腦脈沖式分泌促性腺激素釋放激素（GnRH），刺激垂體分泌FSH與LH。其中FSH刺激次級卵泡的募集和顆粒細(xì)胞分泌E2，從而促進(jìn)卵泡成熟，LH觸發(fā)排卵，促進(jìn)黃體發(fā)育，刺激卵泡膜細(xì)胞產(chǎn)生雄激素。卵母細(xì)胞被內(nèi)層顆粒細(xì)胞和外層卵泡膜細(xì)胞所包圍。這2種類型的細(xì)胞在其整個(gè)生命周期中都具有類固醇活性。其中顆粒細(xì)胞在月經(jīng)周期中對FSH和LH均有反應(yīng)，卵泡膜細(xì)胞只對LH有反應(yīng)。研究顯示miR-7a2通過調(diào)節(jié)垂體前列腺素和骨形成蛋白4（bone morphogenetic protein 4，BMP4）信號通路，連接miR-7基因回路來調(diào)節(jié)FSH和LH的合成和分泌，從而對性成熟和生殖功能起關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用[23]。

生成類固醇激素是顆粒細(xì)胞在卵泡發(fā)育過程中的重要作用。CYP19A1基因編碼芳香化酶，而芳香化酶是合成E2的關(guān)鍵酶，研究發(fā)現(xiàn)CYP19A1可刺激豬卵巢顆粒細(xì)胞分泌E2，而miR-10b可直接與豬CYP19A1基因的3′-UTR相互作用，抑制其在豬顆粒細(xì)胞中的表達(dá)和功能[24]。另有研究發(fā)現(xiàn)在PCOS患者中，miR-27a-3p靶向環(huán)磷酸腺苷應(yīng)答元件結(jié)合蛋白1（cyclic-AMP response element binding protein 1，Creb1），負(fù)性調(diào)節(jié)其下游因子CYP19A1基因的表達(dá)，導(dǎo)致顆粒細(xì)胞中雌激素的產(chǎn)生減少、雄激素在顆粒細(xì)胞中積累[25]。miR-27a-3p可導(dǎo)致雌激素/雄激素失衡，表明其可能參與了PCOS的發(fā)生機(jī)制。PCOS患者的重要特征是無排卵，體內(nèi)高水平的E2可阻止FSH水平的升高，而FSH是卵泡生長和誘導(dǎo)排卵的重要因素，低水平的FSH會導(dǎo)致無排卵。Huang等[26]通過對比PCOS患者和正常人卵丘細(xì)胞miRNAs表達(dá)譜發(fā)現(xiàn)17個(gè)miRNAs在PCOS患者卵丘細(xì)胞中的表達(dá)有顯著差異，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)miR-509-3p通過抑制絲裂原活化蛋白3激酶8（mitogen-activated protein3 kinase8，MAP3K8）的表達(dá)，提高了E2的分泌，這可能是miRNAs參與PCOS患者無排卵的一種發(fā)病機(jī)制。據(jù)報(bào)道m(xù)iR-24和miR-19可減少培養(yǎng)的人卵巢細(xì)胞的睪酮釋放[27]。此外，miR-24、miR-150和miR-151轉(zhuǎn)染人卵巢細(xì)胞后，E2釋放降低，進(jìn)一步說明這些miRNAs可能對顆粒細(xì)胞分泌性激素有重要作用。研究表明miR-143、miR-132能夠促進(jìn)FSH介導(dǎo)的顆粒細(xì)胞孕酮的分泌[28-29]。另有研究發(fā)現(xiàn)miR-143負(fù)調(diào)控FSH介導(dǎo)的信號通路，通過靶向V-Ki-ras2 Kirsten大鼠肉瘤病毒同源癌基因（v-Ki-ras2 Kirsten ratsarcoma viral oncogenehomolog，KRAS）影響E2的產(chǎn)生[30]。許多miRNAs能降低孕酮、睪酮和E2，但目前只有miR-107能增加睪酮的釋放，這種特異性miRNAs在PCOS患者的顆粒細(xì)胞中也顯著上調(diào)?？梢妋iRNAs對顆粒細(xì)胞分泌性激素有重要影響，由此推測miRNAs水平在一定程度上可反映卵泡的成熟度及質(zhì)量。

綜上，miRNAs參與調(diào)控了顆粒細(xì)胞增殖、分化、凋亡、性激素合成等過程，雖然越來越多的miRNAs及其靶基因被發(fā)現(xiàn)，但具體機(jī)制以及潛在的宏觀調(diào)控網(wǎng)絡(luò)目前尚未完全闡釋清楚，且哪些miRNAs是敏感的、對臨床有實(shí)際意義的，仍需進(jìn)一步研究。隨著研究技術(shù)的不斷發(fā)展，miRNAs有望成為卵巢相關(guān)疾病的輔助診斷標(biāo)志物，miRNAs的類似物及抑制物有望成為新的治療方案。