環(huán)狀RNA在女性生殖系統(tǒng)中的研究進展

張雪穎，應(yīng)小燕，許波群

環(huán)狀RNA（circular RNA，circRNA）是一類共價閉合的成環(huán)非編碼RNA，最早在研究植物類病毒時發(fā)現(xiàn)，但當(dāng)時被當(dāng)作基因剪切廢物未受重視。CircRNA不含5′端帽子和3′端Poly尾巴，可抵抗核酸外切酶的降解作用，具有保守性、穩(wěn)定性、組織特異性[1-2]等特點，這為其作為疾病診斷標(biāo)志物及疾病靶向藥物的研制提供可能。近幾年，隨著測序技術(shù)和生物信息學(xué)的發(fā)展，越來越多的circRNA被鑒定出。CircRNA廣泛存在于各種生命體內(nèi)，可發(fā)揮細胞信號傳導(dǎo)、基因調(diào)控、蛋白質(zhì)翻譯等生物功能，參與各種生理和病理過程，其異常表達影響乳腺癌[3]、糖尿病[4]、椎間盤退變[5]等疾病的發(fā)生、發(fā)展。隨著研究進展，其在女性生殖系統(tǒng)疾病的研究也逐漸深入。本文就circRNA的生物學(xué)特性、功能以及近年來其在女性生殖系統(tǒng)疾病中研究進展及潛在臨床價值進行綜述。

1 CircRNA概述

1.1 CircRNA的分類及形成、降解機制 CircRNA是一種具有閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)的非編碼RNA，即前體mRNA（pre-mRNA）經(jīng)選擇性剪切后5′端和3′端反向以共價結(jié)合的方式拼接而成，其廣泛存在于多種組織、細胞、外泌體中，且在不同物種間高度保守[1]。人體存在內(nèi)源性circRNA和外源性circRNA，前者廣泛存在于真核細胞的細胞質(zhì)中，而后者則多存在于血液、體液、唾液等。

CircRNA由編碼基因環(huán)化而成，根據(jù)其來源，可分為外顯子circRNA（exonic circRNA，ecircRNA）、內(nèi)含子circRNA（circular intronic RNA，ciRNA）、外顯子-內(nèi)含子circRNA（exon-intron circular RNA，EIciRNA）和基因間區(qū)circRNA（intragenic circular RNA，icircRNA）四大類，其中ecircRNA占circRNA的絕大多數(shù)且位于細胞質(zhì)，其他則主要位于細胞核。關(guān)于各類circRNA的成環(huán)機制，主要有外顯子套索環(huán)化、內(nèi)含子互補配對環(huán)化、RNA結(jié)合蛋白驅(qū)動環(huán)化及內(nèi)含子套索環(huán)化等模型。Jeck等[6]研究認(rèn)為，在轉(zhuǎn)錄過程中，pre-mRNA發(fā)生折疊，拉近原本不相鄰的外顯子，通過套索剪接形成ecircRNA或EIciRNA；內(nèi)含子區(qū)域存在的反向互補序列或ALU重復(fù)序列使其本身互補配對，從而介導(dǎo)pre-mRNA反向剪切，形成ecircRNA或EIciRNA。Pre-mRNA經(jīng)典剪切過程中形成內(nèi)含子套索，5′端富含的GU、3′端富含的C重復(fù)序列使其穩(wěn)定，最終形成ciRNA[7]。RNA結(jié)合蛋白與內(nèi)含子相互作用，使內(nèi)含子側(cè)翼序列相互靠近，介導(dǎo)反向剪接，外顯子頭尾相接形成circRNA[8]。

有學(xué)者提出RNA內(nèi)切酶降解circRNA的假設(shè)，但未深入探究驗證。既往有學(xué)者發(fā)現(xiàn)微小RNA-671（miR-671）可介導(dǎo)RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物（RNA-induced silencing complex，RISC）的核心元件AGO2區(qū)域切割以降解小腦變性相關(guān)蛋白1（CDR1）及其來源的circRNA[9]。近期，Jia等[10]研究發(fā)現(xiàn)進化保守因子GW182參與大量circRNA的降解過程。然而，circRNA的降解機制仍無成熟理論體系，有待進一步研究。

1.2 CircRNA的生物學(xué)功能與機制 CircRNA廣泛參與各種生理病理過程，具有以下生物功能：①調(diào)節(jié)細胞增殖，研究表明circRNA可通過磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B（phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B，PI3K/AKT）[11]信號通路或影響細胞周期進展[3]而調(diào)控細胞增殖；②促進上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）以加速癌變[12]；③參與細胞分化[13]；④促進胰島素分泌[4]；⑤調(diào)控細胞凋亡[5]。

CircRNA發(fā)揮生物功能的機制主要取決于其類型。廣泛分布于細胞質(zhì)的ecircRNA具有微小RNA（miRNA）結(jié)合序列，可發(fā)揮海綿吸附作用[14]，競爭性結(jié)合miRNA，使后者活性大大降低，從而解除其對mRNA上靶基因的抑制作用，從而調(diào)控下游信號傳導(dǎo)。CircRNA也可以直接與RNA結(jié)合蛋白相互作用，有研究證明ecircRNA可作為mRNA編碼蛋白或多肽[15]。CiRNA、EIciRNA多位于核內(nèi)，ciRNA通過與RNA聚合酶Ⅱ（RNA-polⅡ）的相互作用順式調(diào)控其來源基因的表達[7]；EIciRNA通過招募U1小RNA蛋白復(fù)合物（U1snRNP），與polⅡ在基因啟動子區(qū)相互作用，促進其來源基因的轉(zhuǎn)錄表達[16]。

CircRNA生物學(xué)功能如圖1[17]所示，circRNA經(jīng)反向互補序列或RNA結(jié)合蛋白的結(jié)合而生成，并從細胞核輸出（見圖1①）。在細胞質(zhì)中circRNA可與多種物質(zhì)結(jié)合，可結(jié)合RNA結(jié)合蛋白（見圖1②）、海綿效應(yīng)吸附miRNA（見圖1③）、核糖體（見圖1④），也可結(jié)合內(nèi)切酶形成退化的circRNA（見圖1⑥）、或直接降解（見圖1⑤）。從非降解途徑看，circRNA結(jié)合復(fù)合物可在細胞質(zhì)中擴散，也可主動運輸?shù)郊毎奶囟▍^(qū)域從而進行物質(zhì)釋放或翻譯（見圖1⑦）。囊泡將circRNA或結(jié)合復(fù)合物包裹并運送出細胞質(zhì)（見圖1⑧）。在囊泡的保護下，circRNA及其復(fù)合物可到達其他細胞或組織，作為信使分子或完成未知的功能（見圖1⑨）。

2 CircRNA與女性生殖系統(tǒng)腫瘤

女性生殖系統(tǒng)腫瘤有良性、交界性（卵巢）及惡性之分，可發(fā)生于女性生殖系統(tǒng)的各個部位，惡性腫瘤以宮頸癌、子宮內(nèi)膜癌和卵巢癌最多發(fā)，卵巢上皮癌在女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤中死亡率最高[18]。惡性腫瘤的病理分期對制定治療方案、判斷預(yù)后有重要指導(dǎo)意義，早期診斷尤為重要。CircRNA保守、穩(wěn)定、組織特異的生物學(xué)特性，使其有可能成為婦科惡性腫瘤的特異報警標(biāo)志物，也為研制疾病靶向藥提供新方向。近年來，circRNA在婦科腫瘤方面的研究成為熱點。

2.1 CircRNA與宮頸癌 高通量測序及微陣列等技術(shù)[19]鑒定出越來越多與宮頸癌相關(guān)的circRNA，進一步加速circRNA在宮頸癌發(fā)生、發(fā)展中的機制研究。研究發(fā)現(xiàn)，has_circ_0023404在宮頸癌患者及多種人宮頸癌細胞系中過表達，熒光免疫實驗表明其靶向調(diào)節(jié)miR-136，而后者則為多種腫瘤的抑制因子；功能試驗表明，has_circ_0023404經(jīng)miR-136促進轉(zhuǎn)錄因子CP（TFCP）表達以激活Yes相關(guān)蛋白（Yes-associated protein，YAP）通路，最終促進宮頸癌發(fā)展[20]。Liu等[18]研究發(fā)現(xiàn)circRNA8924（has_circ_0141539）在宮頸癌患者中表達升高，并與腫瘤大小、國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟（FIGO）分期、子宮肌層浸潤等臨床病理因素相關(guān)，其與miR-518-5p/miR-519-5p家族競爭結(jié)合以調(diào)節(jié)CBX8表達，促進宮頸癌細胞的增殖、遷移和侵襲。研究發(fā)現(xiàn)，circRNA000284在5種宮頸癌細胞系中表達均上調(diào)，并經(jīng)海綿吸附miR-506從而使抑制Snail-2的降解，最終促進宮頸癌的發(fā)展[21]。CircRNA充當(dāng)競爭性內(nèi)源RNA（competing endogenous RNA，ceRNA），經(jīng)海綿吸附miRNA以調(diào)控細胞間信號傳導(dǎo)，最終影響惡性腫瘤進展，這類機制研究成果豐富[3，11-12，18，22-24]，見表1。而Abdelmohsen等[25]從蛋白調(diào)節(jié)的角度證實了circRNA在宮頸癌中的作用。HuR是一種RNA結(jié)合蛋白，可與多種RNA結(jié)合進而調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)表達，該研究發(fā)現(xiàn)circPABPN1（has_circ_0031288）為HuR靶標(biāo)，其可顯著抑制HuR與PABPN1 mRNA結(jié)合，從而抑制PABPN1翻譯為蛋白，最終減弱宮頸癌細胞增殖。

圖1 CircRNA生物學(xué)功能圖示[17]

2.2 CircRNA與子宮內(nèi)膜癌 分別取Ⅰ期、Ⅲ期子宮內(nèi)膜癌患者內(nèi)膜組織與正常人群內(nèi)膜組織進行circRNA轉(zhuǎn)錄組分析，發(fā)現(xiàn)大量差異表達的circRNA，其中多為ecircRNA[26-27]。Chen等[27]研究發(fā)現(xiàn)，與正常人相比，子宮內(nèi)膜癌患者內(nèi)膜組織中circRNA總豐度更低，這與Bachmayr-Heyda等[28]部分研究結(jié)果契合，提示形成circRNA的反向剪接機制可能在惡性組織中受損，也可能是細胞過度增殖導(dǎo)致circRNA被動稀薄。Xu等[29]從血清外泌體中提取circRNA進行分析，發(fā)現(xiàn)has_circ_0109046和has_circ_0002577在子宮內(nèi)膜癌患者中過表達，有望作為子宮內(nèi)膜癌的新型無創(chuàng)標(biāo)志物。

2.3 CircRNA與卵巢癌 卵巢腫瘤是常見的婦科腫瘤，因其早期病變不易發(fā)現(xiàn)，一旦出現(xiàn)癥狀多為晚期。上皮性卵巢癌好發(fā)于50～60歲的婦女，5年生存率約30%～40%，死亡率居婦科惡性腫瘤首位，應(yīng)予以高度重視。Ahmed等[30]對卵巢癌患者的原位病灶和轉(zhuǎn)移病灶（包括腹膜和淋巴結(jié)）進行對比鑒定研究，發(fā)現(xiàn)與mRNA相比，circRNA在原發(fā)病灶和轉(zhuǎn)移病灶之間的差異性更大；轉(zhuǎn)移病灶中的mRNA激活核因子κB （nuclear factor kappa-B，NF-κB）、PI3K/AKT、轉(zhuǎn)化生長因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）等細胞增殖信號通路，而circRNA卻抑制以上信號通路。因此該研究提出circRNA更適合作為癌癥的高度異質(zhì)性生物標(biāo)志物。CircPLEKHM3在卵巢癌中的低表達，其與患者預(yù)后呈正相關(guān)，而AKT抑制劑MK-2206可阻斷因circPLEKHM3低表達所引起的促腫瘤作用，還可增強紫杉醇的抗癌效應(yīng)[24]，為卵巢癌的治療帶來新希望。CircMAN1A2在鼻咽癌、口腔癌、甲狀腺癌、卵巢癌、肺癌等多種惡性腫瘤患者的血清中異常升高，受試者工作特征（ROC）曲線下面積分別為0.911、0.779、0.734、0.694、0.645[31]，提示circMAN1A2作為惡性腫瘤血清新型標(biāo)志物具有較大價值。隨著研究進展，circRNA經(jīng)海綿吸附miRNA進而調(diào)控各類卵巢癌進展的機制逐步顯現(xiàn)，靶向circRNA作用位點進而治療卵巢癌的新方法有望成功。

表1 CircRNA海綿吸附miRNA調(diào)控腫瘤的發(fā)生、發(fā)展

3 CircRNA與女性生殖內(nèi)分泌疾病

女性生殖內(nèi)分泌疾病主要表現(xiàn)為下丘腦-垂體-卵巢軸異常，常見疾病如多囊卵巢綜合征（PCOS）、高催乳素血癥等。雄激素異常增高、卵泡囊性擴張和無排卵是PCOS的主要表現(xiàn)。在PCOS患者卵丘細胞中已鑒定出大量差異表達的circRNA[32]。Zhang等[33]對顆粒細胞中的circRNA表達譜進行分析，發(fā)現(xiàn)has_circ_0001577在PCOS患者中顯著上調(diào)，而has_circ_0020093則顯著下調(diào)。研究表明，PCOS患者卵泡外泌體中的circRNA也存在差異表達[34]。鑒于卵丘細胞和顆粒細胞是合成、分泌雄激素的重要部位，卵泡液含有大量生殖細胞分泌物，這些部位的circRNA存在差異表達，說明其在PCOS發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。在垂體水平，circOMA1通過miR-145-5p靶向腫瘤蛋白翻譯調(diào)節(jié)因子1（tumor protein translationally-controlled 1，TPT1），從而抑制非功能性垂體腺瘤的生長[35]，從而引起垂體功能低下、不育。

4 CircRNA與子宮內(nèi)膜異位癥和子宮腺肌病

子宮內(nèi)膜異位導(dǎo)致子宮內(nèi)膜異位癥和子宮腺肌病，臨床表現(xiàn)為女性慢性盆腔痛、進行性痛經(jīng)及不孕，嚴(yán)重影響女性生活質(zhì)量。Xu等[36]對子宮內(nèi)膜異位癥患者和正常女性子宮內(nèi)膜中的circRNA進行鑒定分析，發(fā)現(xiàn)11個circRNA表達上調(diào)，77個circRNA表達下調(diào)，其中circ_0004712、circ_0002198表達明顯上調(diào)。Zhang等[37]經(jīng)微陣列分析在子宮內(nèi)膜異位癥患者中鑒定出2237個異常表達的circRNA，其中8個參與EMT過程。進一步的功能試驗表明，has_circ_0067301經(jīng)miR-145-5p調(diào)節(jié)Notch1癌基因信號通路，促進子宮內(nèi)膜異位的EMT發(fā)展[38]。CircRNA在子宮內(nèi)膜異位癥中作用機制的研究較少，進一步深入研究或許可挖掘circRNA的潛在治療價值。

5 CircRNA與產(chǎn)科并發(fā)疾病

體外受精-胚胎移植過程中，很多婦女胚胎質(zhì)量較好卻反復(fù)植入失敗，這與子宮內(nèi)膜容受性有關(guān)；而胚胎植入成功后流產(chǎn)，則與卵泡受損及早發(fā)性卵巢功能不全等相關(guān)。追蹤人類植入前胚胎的circRNA表達譜，發(fā)現(xiàn)大量circRNA在受精前即存在并于植入前持續(xù)存在，提示它們對母源RNA的降解有抵抗性，并在一定程度上影響子宮內(nèi)膜的容受性[39]。Cheng等[40]研究發(fā)現(xiàn)circRNA-103827和circRNA-104816的表達與母體年齡呈正相關(guān)，與優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)呈負相關(guān)，其可能是卵泡微環(huán)境受損的潛在指標(biāo)，進一步提示這些異常circRNA與卵巢衰老之間存在密切聯(lián)系。這些基礎(chǔ)研究為改善卵巢中卵泡微環(huán)境的治療帶來新思路，有望減少不明原因流產(chǎn)的發(fā)生。

妊娠期高血壓疾病是一類妊娠與高血壓并存的疾病，嚴(yán)重者可出現(xiàn)微小血管硬化痙攣，從而危及孕產(chǎn)婦及胎兒的健康。提前預(yù)測孕婦發(fā)病風(fēng)險并進行預(yù)防，將大大減少臨床發(fā)生風(fēng)險。Zhang等[41]通過微陣列分析子癇前期和正常孕婦的血清，發(fā)現(xiàn)大量異常表達circRNA可能與其發(fā)病有關(guān)。若檢測到circ101222上調(diào)，聯(lián)合血漿蛋白因子-內(nèi)皮糖蛋白（ENG）可大大提高子癇前期的預(yù)測率，敏感度為0.707 3，特異度為0.804 9。但該研究未區(qū)分子癇前期嚴(yán)重程度，這或許是其臨床應(yīng)用的局限性。早期胎盤的血管生成和抗血管生成失衡是妊娠并發(fā)癥（包括子癇前期）發(fā)病的主要原因。miR-17有促進早期胎盤血管生成的作用[42]，Qian等[43]在子癇前期孕婦胎盤組織中鑒定出較多上調(diào)的circRNA，其中多個circRNA與miR-17有預(yù)測結(jié)合位點，提示這些上調(diào)的circRNA可能在調(diào)控胎盤血管生成、滋養(yǎng)細胞分化及宿主防御等過程中發(fā)揮作用。

6 結(jié)語與展望

近年來circRNA研究較多，但目前對于circRNA的降解機制仍無完善的理論體系。CircRNA功能研究主要集中在ecircRNA海綿吸附miRNA機制，針對細胞核內(nèi)的調(diào)控研究較少。在研究方法上，應(yīng)著重減少實驗方法檢測的假陽性率。除腫瘤研究外，其他亟待解決的女性生殖問題也應(yīng)加大研究力度，尤其在女性內(nèi)分泌及不孕等領(lǐng)域中還有極大探索空間。CircRNA的生物學(xué)特性使其在血液、唾液中含量豐富穩(wěn)定，其組織特異性、各項生物功能預(yù)示其作為無創(chuàng)疾病診斷預(yù)測分子的可能。而其在腫瘤中確切的海綿吸附功能，也讓我們有機會創(chuàng)造人工circRNA靶向治療藥。

（收稿日期：2020-02-08）

[本文編輯 楊曉園]