卵母細胞滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)聚集體的研究進展

梁麒，湯小晗，盧美松

在輔助生殖操作過程中，促排卵后獲得的卵母細胞可能出現(xiàn)各種各樣的形態(tài)學異常。這些異常按定位可分為胞質(zhì)內(nèi)異常和胞質(zhì)外異常。有專家認為，單獨存在的某一種形態(tài)學異常并不能否定卵母細胞的發(fā)育潛能，但卵母細胞滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)聚集體（smooth endoplasmic reticulum aggregates，SERA）除外，其是由于滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)異常造成的卵母細胞畸形。于卵母細胞的胞質(zhì)出現(xiàn)的圓形、扁平的清晰盤狀物，折光性強于空泡，可單個或多個出現(xiàn)，其直徑大小不等，一般不超過20 nm。

在正常的卵母細胞中，許多Ca2＋囊泡儲存在滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的質(zhì)膜下。隨著卵子成熟，滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)發(fā)生結(jié)構(gòu)變化，促進Ca2+的釋放，引起受精時皮質(zhì)顆粒胞吐作用，對卵母細胞受精及胚胎發(fā)育具有重要意義。卵母細胞SERA的形成影響這一過程，對卵母細胞及胚胎發(fā)育產(chǎn)生嚴重影響，可造成流產(chǎn)、死胎及先天性疾病等嚴重后果。

1997年文獻中首次報道SERA的存在，當時認為其與較低的妊娠率及種植率密切相關(guān)[1]。2004年之后，在日本學者Otsuki等[2]的啟發(fā)下，越來越多的科學家們重視到SERA的存在，并著手研究胞漿內(nèi)單精子注射（intracytoplasmic sperm injection，ICSI）周期中的SERA。SERA在ICSI周期中的發(fā)生率在各類文獻報道中也大相徑庭，5.4%~23.1%不等[3]。大量文獻指出，未經(jīng)超促排卵自然周期中取得的卵母細胞并不會出現(xiàn)SERA，從而認定其出現(xiàn)可能與卵巢接受藥物刺激相關(guān)。但是2008年Ebner等[4]的一項研究推翻了這一觀點。2016年，Itoi等[5]首次尋找到常規(guī)體外受精（invitro fertilization，IVF）周期中的SERA，并成功發(fā)現(xiàn)：在排卵的5~6 h后，有8.8%的IVF卵母細胞中出現(xiàn)SERA?？梢园l(fā)現(xiàn)，SERA在自然周期、IVF、ICSI這3種情況下均有可能發(fā)生。在臨床工作中，SERA真正的發(fā)生率還要更高一些，因為有些卵母細胞顯示出SERA的時間與顯微鏡下觀察的時間不同步。還有些SERA由于體積過小易在觀察中被忽略。Shaw-Jackson等[6]研究指出，ICSI周期中SERA的復(fù)發(fā)率為32%。SERA發(fā)生率及復(fù)發(fā)率均較高，需要胚胎學家們對其加以重視。

1 卵母細胞SERA對受精率的影響

研究表明，SERA陽性（+）卵母細胞受精率會下降[4,7]。甚至有研究發(fā)現(xiàn)，同周期的所有卵母細胞受精率均會下降[7-8]，這可能是因為這些卵母細胞中的SERA太小，在鏡下觀察時被忽略。但亦有研究發(fā)現(xiàn)，SERA（+）與SERA陰性（-）周期的受精率差異無統(tǒng)計學意義[2,9]。

鈣離子震蕩在卵母細胞受精過程中起到重要作用，這是因為Ca2+信號控制著精子的許多行為反應(yīng)：包括獲能、頂體反應(yīng)、亢奮的鞭毛運動和趨化等[10]。強烈的鈣離子震蕩開始于受精時期卵母細胞胞質(zhì)的外側(cè)。而到了合子階段，鈣離子震蕩開始減弱，并從中心向外播散[11]。SERA（+）卵母細胞的鈣離子震蕩與正常者相比有許多不同：一項研究表明，在SERA（+）卵母細胞中鈣離子振蕩的頻率更低，首次鈣離子高峰持續(xù)的時間較長，鈣離子的總釋放量較高[11]。另一項實驗也證實了此觀點，熒光化的Ca2+報告基因在被Ca2+離子載體A23187激活后，可見Ca2+分散在SERA（+）卵母細胞的不同區(qū)域，且持續(xù)時間更長，而正常卵母細胞中呈現(xiàn)的是均一、瞬時的信號[12]。所以鈣離子震蕩受阻可能是SERA（+）卵母細胞受精失敗的原因[13]。

在ICSI或IVF周期中，SERA均會在第二極體釋放數(shù)小時后消失，此時原核尚未形成[14]。有研究表明，拆除顆粒細胞后的卵母細胞中，若SERA持續(xù)存在則意味著受精失敗[14]。一項關(guān)于未受精卵的統(tǒng)計顯示，1%的未受精卵會出現(xiàn)SERA。在IVF中，此概率提高到了2.5%[7]。這可能是因為在IVF過程中，取卵及脫顆粒細胞等機械操作擠壓卵母細胞，可造成SERA破裂，導(dǎo)致部分Ca2+提前釋放，引起皮質(zhì)顆粒胞吐作用。加強皮質(zhì)顆粒膜形成、透明帶變硬，阻止精子進入，影響IVF的卵母細胞受精。

存在SERA的卵母細胞促排卵刺激的時間較長，卵泡刺激素（FSH）的起始量和總量更大，黃體生成激素（LH）峰提前，會導(dǎo)致卵母細胞的細胞質(zhì)過度成熟、細胞器聚集，以及卵母細胞的生長過快和顆粒細胞的增殖加速。一方面，聚集的細胞器會破壞細胞骨架，使肌動蛋白的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)被破壞，擾亂減數(shù)分裂中紡錘體的調(diào)控作用[15]。另一方面，過快的增長可能導(dǎo)致卵母細胞處于缺氧狀態(tài)，導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能障礙，形成SERA[16]。最終使卵母細胞受精失敗。

2 卵母細胞SERA對囊胚形成率的影響

即使成功受精后，SERA（+）胚胎的囊胚形成率也會有所降低[4-5,7]。在一項回顧性分析中，SERA（+）周期的所有受精卵均無囊胚形成[9]。有研究指出，SERA的存在減少了囊胚的擴張和孵出程度，并使內(nèi)細胞團（inner cell mass，ICM）質(zhì)量下降了35%[12]。有學者認為，如果SERA（+）卵母細胞避開了鈣離子震蕩變化對其成熟和受精的影響，那在后期發(fā)育過程中，其與SERA（-）卵母細胞擁有同樣的發(fā)育潛能。雖然SERA（+）的卵母細胞受精率、第3天的優(yōu)質(zhì)胚胎率與卵母細胞形態(tài)正常組差異無統(tǒng)計學意義，但是到了胚胎發(fā)育的第5~6天，囊胚形成率會有所下降[2,4]。這種現(xiàn)象亦證實，SERA（+）胚胎內(nèi)細胞團質(zhì)量更低，發(fā)育潛能更差。這可能是不恰當?shù)穆殉泊碳な孤涯讣毎a(chǎn)生了SERA之外的某些內(nèi)在缺陷所導(dǎo)致的[4]。但亦有部分研究顯示，SERA（+）卵母細胞與正常卵母細胞的囊胚形成率相差不大[9]。

有研究指出，減數(shù)分裂過程中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)的變化可能與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)[17]。SERA可導(dǎo)致Ca2+攝取釋放紊亂，繼而造成大量蛋白未折疊或錯誤折疊，最終引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，以及發(fā)生未折疊蛋白反應(yīng)（unfolded protein response，UPR）[17]。有研究表明，此反應(yīng)的激活會導(dǎo)致囊胚形成率較低[18]。此外，體外培養(yǎng)的植入前胚胎易受剪切力、溫度變化、pH值改變、氧分壓升高等影響。這些物理條件的變化，會誘導(dǎo)產(chǎn)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，從而使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)變化，改變胚胎發(fā)育能力基因的表達、表觀遺傳機制和代謝[17,19]，從而影響囊胚形成以及隨后的胚胎進一步發(fā)育。

3 卵母細胞SERA對妊娠結(jié)局的影響

SERA會從多方面影響妊娠結(jié)局，其會增加生化妊娠率[2,4]、異位妊娠率[7]、流產(chǎn)率[4,12]及早產(chǎn)率[7]，使新生兒體質(zhì)量降低[4]。SERA還會導(dǎo)致許多產(chǎn)科并發(fā)癥[4,20]。一項針對13個相關(guān)研究的系統(tǒng)分析顯示，SERA（＋）周期中出生的183例嬰兒，171例正常，8例存在畸形，3例死胎，1例夭折[6]。另一項統(tǒng)計顯示，選擇了移植SERA（+）胚胎后，患者的妊娠率下降了67%，流產(chǎn)的可能性增加了20%[12]。在同一個周期里，SERA（+）卵母細胞數(shù)量越多，活產(chǎn)率越低[21]。

以上各種異常中，造成后果最嚴重的是新生兒先天性疾病。此類疾病多數(shù)在母親孕期并不能通過檢查手段被發(fā)現(xiàn)，給患兒的家庭帶來較大痛苦。迄今為止，植入SERA（+）胚胎后造成先天性疾病的病例報告包括：1例Beckwith Wiedemann綜合征[2]，1例心血管畸形[7]，1例全前腦畸形[14]，1例因心臟驟停死亡的多發(fā)缺陷嬰兒[22]，1例膈疝[4]。還有1例18三體綜合征無法完全解釋的新生兒死亡及2例臨床上有客觀原因的早產(chǎn)兒死亡[6]。在1例病例報告中，SERA（+）胚胎發(fā)生了復(fù)雜的染色體重排，導(dǎo)致染色體2q31及1q32帶缺失了7 632 Mb，最后產(chǎn)下了死胎。但是產(chǎn)婦在孕期接受了羊水穿刺術(shù)。這種創(chuàng)傷性操作會對母親及胎兒健康造成影響。所以該操作導(dǎo)致死胎的可能尚不能排除[23]。但染色體重排的存在是可以肯定的，即使該胎兒成功出生，也可能會出現(xiàn)各種缺陷。

已證實非整倍體及染色體重排的發(fā)生率在SERA（+）胚胎中更高。SERA（+）卵母細胞組的有絲分裂錯誤率顯著高于非SERA卵母細胞。胚胎細胞在有絲分裂過程中發(fā)生分裂失敗，形成四倍體，并可能導(dǎo)致胚胎中染色體構(gòu)型異常[3]。如果在有絲分裂或減數(shù)分裂期間發(fā)生卵裂失敗就會導(dǎo)致胚胎染色體異常。一旦卵裂失敗的細胞發(fā)育為外胚層滋養(yǎng)細胞，就會出現(xiàn)胎盤異常；如果這些細胞發(fā)育為內(nèi)細胞團，則會導(dǎo)致進一步的卵裂失敗，加重胚胎異常，最終影響妊娠結(jié)局[3]。一項對SERA（+）卵母細胞的轉(zhuǎn)錄組學分析發(fā)現(xiàn)，紡錘體組裝、染色體分裂相關(guān)的基因表達有所下調(diào)，這可能會導(dǎo)致非整倍體及染色體重排的發(fā)生[24]。

全世界各研究中心對于卵母細胞中SERA（+）的研究結(jié)果存在爭議。目前這是因為研究中心納入的病例量均較小，異質(zhì)性較大。這種異質(zhì)性的存在可能和以下因素相關(guān)：各中心移植的胚胎可能是新鮮的或復(fù)蘇后的胚胎，但冷凍及復(fù)蘇胚胎的過程本身就是對胚胎的傷害，所以妊娠結(jié)局自然不同；即使都是新鮮胚胎，不同的時期發(fā)育潛能也會有差異；第3天的桑葚胚與第5天的優(yōu)質(zhì)囊胚植入后的效果自然會有所不同；不同研究中心的促排卵方案更是千變?nèi)f化；各個方案均是根據(jù)患者自身條件個體化制定的，即使是使用同種促排卵藥物，用量及使用天數(shù)上也會有所不同，難以保證完全統(tǒng)一；各實驗室胚胎學家經(jīng)驗不同，使用的顯微鏡種類及型號不同等等，均會對SERA的甄別及受精與否、胚胎評級產(chǎn)生影響[3]。足夠科學性的大樣本可重復(fù)實驗是解決此爭議的唯一方法。

4 結(jié)語與展望

鑒于已知的嚴重后果，歐洲人類生殖與胚胎協(xié)會（ESHRE）在2011年的大會達成共識：建議丟棄SERA（+）卵母細胞[25]。但一項全歐洲生殖中心范圍的調(diào)查顯示，只有少數(shù)中心按照ESHRE共識的建議系統(tǒng)性地廢棄SERA（+）卵母細胞[26]。而大約四分之三的生殖中心不會將SERA（+）的情況告知患者。21個生殖中心（17.1%）報告了SERA（+）新生兒出生，這其中還包括1例嚴重的胎兒畸形。盡管其中健康嬰兒的出生是令人振奮的，但不能排除某些并發(fā)癥被漏報的情況，且遠期安全性也有待探索。所以即使健康嬰兒出生，依舊缺乏足夠證據(jù)修正ESHRE共識[27]。

移植了SERA（+）胚胎后出生的嬰兒是否會在后期發(fā)育中顯現(xiàn)不同，目前尚無定論。因此建議生殖科醫(yī)生密切追蹤SERA（+）的卵母細胞，盡量避免移植SERA（+）胚胎。若別無選擇，則需充分與患者夫婦溝通，如果獲得了他們的同意，就必須對胎兒發(fā)育和出生時的嬰兒進行嚴格的隨訪[28]。以明確SERA（+）與不良臨床結(jié)局的相關(guān)性。收集到更加確切的第一手數(shù)據(jù)并對此進行分析，是將來研究SERA的重要途徑。只有進行大量的動物實驗研究及大樣本的臨床數(shù)據(jù)調(diào)研，才能對SERA（+）卵母細胞做出最恰當?shù)奶幚怼２艜樯持行呐咛嶒炇覍β涯讣毎牟僮骷耙浦才咛サ倪x擇提供參考。最終減輕患者輔助生殖過程中的痛苦，早日達到預(yù)期的臨床結(jié)局。