GSNO上調(diào)人血管內(nèi)皮細(xì)胞系EA.hy926 PDK1和LDHA mRNA的表達(dá)

嚴(yán)潔萍，張麗玉

(1.浙江省人民醫(yī)院 杭州醫(yī)學(xué)院附屬人民醫(yī)院 藥學(xué)部， 浙江 杭州 310014；2.浙江大學(xué)城市學(xué)院 藥學(xué)院， 浙江 杭州 310015)

S-亞硝基谷胱甘肽(S-nitrosoglutathione，GSNO)是機(jī)體內(nèi)源性S-硫醇，具有影響蛋白質(zhì)活性、穩(wěn)定性及核質(zhì)分布的作用，參與血管性疾病發(fā)生[1]。

在大鼠心肌缺血損傷模型中，GSNO可通過(guò)修飾三重基序蛋白TRIM72減輕缺血引起的心臟損傷和減少梗塞面積。低氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia inducible factor-1α, HIF-1α)cys533位點(diǎn)經(jīng)GSNO S-亞硝基化修飾可減少大鼠腦缺血再灌注的繼發(fā)性損傷[1-2]。體外研究發(fā)現(xiàn)GSNO還可誘發(fā)線粒體關(guān)聯(lián)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。目前，GSNO對(duì)血管的作用仍有爭(zhēng)議，探索其對(duì)線粒體關(guān)聯(lián)代謝功能的影響及HIF-1α參與調(diào)控的可能分子機(jī)制，對(duì)血管內(nèi)皮早期病理生理評(píng)估具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑:血管內(nèi)皮細(xì)胞系EA.hy926細(xì)胞(ATCC公司)。GSNO和四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)(Sigma-Aldrich公司)；DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清(Gibco公司); PCR相關(guān)試劑、引物、乳酸檢測(cè)試劑盒和核蛋白提取試劑盒(上海生工生物工程產(chǎn)品)；HIF-1α、β-actin、Lamin B抗體及辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記抗體(CST公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞的分組及處理：將血管內(nèi)皮細(xì)胞EA.hy926分為：1)對(duì)照組及2)GSNO組，加入GSNO 使其總濃度為500 μmol/L。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。

1.2.2 MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率：細(xì)胞與GSNO共培養(yǎng)1、3、6和12 h，檢測(cè)其細(xì)胞存活率。

1.2.3 比色法檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞乳酸水平：按測(cè)定試劑盒說(shuō)明書操作。

1.2.4 RT-qPCR檢測(cè)細(xì)胞乳酸脫氫酶A(lactate dehydro-genase A,LDHA)和丙酮酸脫氫酶激酶1(phosphoinositide dependent protein kinase-1,PDK1)mRNA表達(dá)：各組細(xì)胞樣本加入0.5 mL Trizol試劑提供總RNA。用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)為cDNA進(jìn)行擴(kuò)增。以下為引物序列：LDHA：上游：5′-CAAA GTCCAAGATGGCAACCC-3′，下游：5′-AGCACCAACCCCAA CAACTG-3′；PDK1：上游：5′-TTACGGATTGCCCATATCACG-3′，下游：5′-CCCGGTCACTCATCTTCACAGT-3′；β-actin：上游：5′-ATGGAATCCTGTGGCATCCAT-3′，下游：5′-TCCTGCATC CTGTCAGCAATG-3′。 反應(yīng)條件：90 ℃變性30 s，95 ℃ 5 s，55 ℃ 30 s共35個(gè)循環(huán)。以β-actin為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt計(jì)算各組mRNA相對(duì)表達(dá)水平。

1.2.5 Western blot檢測(cè)HIF-1α的核質(zhì)表達(dá)：按試劑盒說(shuō)明分別提取細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中蛋白。BCA法檢測(cè)蛋白濃度，-80 ℃保存。蛋白于沸水中變性10 min，在10% SDS-PAGE中電泳約1 h，用電轉(zhuǎn)膜儀將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜上；5% BSA封閉，加入稀釋的一抗(HIF-1α，Lamin B和β-actin)，4 ℃過(guò)夜；次日加入HRP標(biāo)記二抗室溫孵育1～2 h，采用ECL法檢測(cè)蛋白表達(dá)。采用Image J 5.0軟件分析蛋白表達(dá)結(jié)果。

1.2.6 免疫化學(xué)法檢測(cè)HIF-1α蛋白在細(xì)胞核中的熒光表達(dá)：細(xì)胞經(jīng)GSNO暴露后棄去上清液，加入-20 ℃甲醇固定15～20 min。10% BSA室溫封閉1h，加入HIF-1α一抗(1∶100)4 ℃孵育過(guò)夜。次日加入熒光二抗避光孵育2 h，加入DAPI染色1 min后拍照。

2 結(jié)果

2.1 GSNO對(duì)細(xì)胞存活率及內(nèi)皮細(xì)胞乳酸水平的影響:與對(duì)照組相比，GSNO組在1～12 h內(nèi)細(xì)胞存活率無(wú)明顯差異，乳酸水平升高(P<0.01)(表1)。

2.2 GSNO對(duì)PDK1和LDHA mRNA水平及HIF-1α蛋白核內(nèi)積聚的影響:血管內(nèi)皮細(xì)胞暴露GSNO 6和12 h后，LDHA和PDK1的mRNA水平上調(diào)(圖1A，B)。HIF-1α在細(xì)胞核中的表達(dá)呈時(shí)間依賴性上調(diào)(1～12 h)，而在細(xì)胞質(zhì)中無(wú)明顯表達(dá)(圖1C，D)。GSNO組中HIF-1α(綠色熒光)與DAPI(藍(lán)色熒光)表達(dá)一致(圖1E)。

表1 GSNO對(duì)EA.hy926細(xì)胞存活率及上清液的乳酸水平的影響Table 1 Cell viability and lactic acid level in the supernatant after GSNO treatment in EA.hy926

*P<0.01 compared with control group.

A, B.GSNO increased LDHA and PDK1 mRNA expression; C.HIF-1α protein upregulated in nucleus after GSNO treatment; D.quantification of HIF-1α protein expression was depicted in histogram; E.GSNO promoted HIF-1α protein into cell nucleus; HIF-1α protein (green) and cell nucleus (blue) were located the same plot by immunofluorescence analysis after GSNO treatment; scale bar=50 μm; *P<0.01 compared with control group圖1 GSNO對(duì)EA.hy926細(xì)胞LDHA、PDK1 mRNA水平及HIF-1α蛋白核內(nèi)積聚及入核活化的影響Fig 1 Effect of LDHA，PDK1 mRNA expression and HIF-1α accumulation in nucleus of EA.hy926 cells

3 討論

在完整的心肌細(xì)胞中，GSNO濃度小于25 mmol/L或大于100 mmol/L均導(dǎo)致生理或病理學(xué)變化。GSNOR-/-可易化HIF-1α S-亞硝基化，增加心肌毛細(xì)血管，減少急性心肌缺血面積，維持心室收縮和舒張功能[3]。GSNO可上調(diào)β-arrestin 2 S-亞硝基化水平，易化β2-adrenergic受體關(guān)聯(lián)信號(hào)通路發(fā)生，促進(jìn)周圍血管舒張，增加血液流量[4]。本研究發(fā)現(xiàn)GSNO促LDHA及PDK1等代謝酶mRNA表達(dá)上調(diào)，同時(shí)伴HIF-1α的穩(wěn)定持續(xù)表達(dá)。GSNO處理1h后α亞基在細(xì)胞核中表達(dá)，可能是由于蛋白翻譯后修飾的方式占有降解區(qū)域殘基，并受GSNO誘導(dǎo)入核活化，提示HIF-1α的核內(nèi)表達(dá)介導(dǎo)了GSNO上調(diào)LDHA和PDK1 mRNA水平。

總之，GSNO可通過(guò)促HIF-1α核內(nèi)積聚上調(diào)血管內(nèi)皮細(xì)胞PDK1和LDHA mRNA水平，同時(shí)伴乳酸水平升高，提示GSNO可能參與調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞能量代謝過(guò)程。