姜黃素減輕小鼠深部組織壓力性損傷

劉盼盼，張子銳，楊 旭，韓 晶，陸連芳，王愛敏，張 菊*

(1.青島大學(xué) 護理學(xué)院 山東 青島 266000； 2.青島大學(xué)附屬醫(yī)院 肝膽外科， 山東 青島 266000)

壓力性損傷(pressure injury, PI)，又名壓力性潰瘍或褥瘡，據(jù)統(tǒng)計，在中國綜合性醫(yī)院壓力性損傷發(fā)生率為3% ～ 14%[1]。其中深部組織壓力性損傷(deep tissue pressure injury, DTPI)由于其病情隱匿、發(fā)展迅速以及治療成本高等特點引起臨床傷口專家們的高度重視。其常見于移動能力受限患者的骨突強烈或長期受力部位，主要因局部組織缺血-再灌注(ischemia-reperfusion)引起血管內(nèi)皮損傷并啟動炎性反應(yīng)，進而導(dǎo)致微循環(huán)障礙、毛細血管網(wǎng)密度減少[2]。因此，選擇有效的藥物治療深部組織壓力性損傷，已成為近年來醫(yī)學(xué)研究的熱點。

姜黃素(curcumin,Cur)是一種從中藥材姜黃中提取的植物多酚，也是姜黃最主要的活性成分[3]。研究表明，姜黃素能夠減輕小鼠糖尿病足潰瘍損傷，提示姜黃素可能對慢性傷口損傷有一定的保護作用，但其能否減輕缺血-再灌注導(dǎo)致的深部組織壓力性損傷尚有待研究[4-5]?；诖?，本實驗擬評價姜黃素對缺血-再灌注導(dǎo)致的小鼠深部組織壓力性損傷的影響，初步探討其分子作用機制，為臨床治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 藥品與試劑：姜黃素(Sigma-Aldrich公司)；IL-6、IL-10、VEGF-α、TGF-β和TNF-α引物(青島德羅海達生物技術(shù)有限公司合成)；Stat3、p-Stat3、VEGF-α和TGF-β單克隆抗體(萬類生物科技有限公司)；其他有機分析純試劑(青島德瑞康生物科技有限公司)。

1.1.2 實驗動物：SPF級8 ～ 10周齡雄性C57BL/6小鼠30只，體質(zhì)量20 ～ 22 g(北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)合格證：SCXK京2016-0006)。

1.2 方法

1.2.1 小鼠的分組及處理：按照以往文獻報道的方法建立小鼠深部組織壓力性損傷模型[6]。腹腔注射4%水合氯醛7.5 mL/kg麻醉小鼠后，用剃毛器除去背部被毛，選擇小鼠坐骨棘突附近皮膚組織施壓，在施壓處上下兩側(cè)各放置一塊相同磁鐵(直徑12 mm，厚5 mm，重2.4 g，表面磁通量為1 000高斯)。施壓12 h后釋放12 h為1個循環(huán)，共1個循環(huán)。施壓期間小鼠正常進食、活動。采用隨機數(shù)字表法將小鼠隨機分為模型組(Mod)、姜黃素4 mg/kg組(Cur 4)、姜黃素8 mg/kg組(Cur 8)，每組10只。另取10只正常小鼠作為對照組 (Con)。以模型構(gòu)建成功為第0天，于1、3、5、7、9、11和13天，平均每只小鼠體質(zhì)量按20 g計算，Cur 4組的每只小鼠創(chuàng)面皮下注射0.8 g/L姜黃素0.1 mL，Cur 8組的每只小鼠創(chuàng)面皮下注射1.6 g/L姜黃素0.1 mL。對照組和模型組小鼠不做任何處理。

1.2.2 傷口愈合狀況測定：建模后第1、3、5、7、10、12和14天在相同條件下于小鼠局部創(chuàng)面拍照，使用Image J軟件統(tǒng)計傷口面積。以第3天傷口面積為基準(zhǔn)，傷口愈合百分比=未愈合傷口面積/第3天傷口面積。

1.2.3 HE染色：于第14天頸椎脫臼法處死小鼠，取創(chuàng)面及周圍1 cm皮膚組織，固定于4%多聚甲醛，制作石蠟切片，進行HE染色，光鏡下觀察。

1.2.4 Real-time PCR檢測mRNA表達：Trizol法提取傷口組織總mRNA，反轉(zhuǎn)錄試劑盒構(gòu)建cDNA。Q-PCR檢測借助熒光定量PCR試劑盒，設(shè)置程序：95 ℃ 15 min; 95 ℃ 10 s、55 ℃ 20 s、72 ℃ 30 s，40次循環(huán)；擴增反應(yīng)完成后進行熔解曲線制作。結(jié)果以2-ΔΔCt表示。引物序列見表1。

1.2.5 Western blot檢測目的蛋白：取凍存的皮膚肌肉組織樣本，勻漿化后向裂解液內(nèi)加入等體積含十二烷基硫酸鈉的蛋白緩沖液，水浴鍋內(nèi)煮沸10 min，4 ℃ 10 000 r/min離心10 min后收集上清液。采用BCA蛋白分析試劑盒測定樣本內(nèi)蛋白濃度，用SDS-PAGE分離蛋白質(zhì)，并將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜。常溫下用含5%脫脂奶粉封閉1 h，經(jīng)TBST溶液清洗2次后加入適度稀釋的第一抗體(VEGF-α、TGF-β、Stat3、p-Stat3、β-actin)，4 ℃孵育過夜。加入辣根過氧化物酶偶聯(lián)的第二抗體孵育1 h，最后加入底物并曝光、顯影。

表1 引物序列Table 1 Sequence of the primers

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 創(chuàng)面愈合過程大體觀察

3組小鼠建模后第1天，創(chuàng)面呈蒼白色圓形，創(chuàng)周清晰整齊。深部組織壓力性損傷第3天，3組創(chuàng)面邊緣逐漸模糊，顏色加深。第5天，3組創(chuàng)面均擴大、不同程度凹陷，顏色進一步加深呈黃褐色。第7天，模型組創(chuàng)面進一步惡化發(fā)展，而干預(yù)組創(chuàng)面出現(xiàn)縮小態(tài)勢。第10天，模型組創(chuàng)面縮小但是顏色加深呈深褐色，Cur 8組傷口面積明顯縮小，創(chuàng)緣處可見結(jié)痂。第12～14天，模型組創(chuàng)面緩慢縮小，部分結(jié)痂覆蓋；Cur 8組創(chuàng)面完全結(jié)痂覆蓋，且見結(jié)痂與創(chuàng)緣分離，周圍粉色新生上皮覆蓋明顯。3組小鼠的創(chuàng)面愈合宏觀情況見圖1。

圖1 小鼠DTPI的創(chuàng)面愈合情況Fig 1 Wound healing of DTPI in mice

2.2 創(chuàng)面愈合比

以完全上皮覆蓋作為創(chuàng)面愈合的依據(jù)，不同時間點的創(chuàng)面愈合比(表2)。深部組織壓力性損傷后第7、10、12和14天，Cur 8組小鼠創(chuàng)面愈合比均分別顯著低于模型組(P<0.05)；Cur 4組只在第7、10天創(chuàng)面愈合比低于模型組(P<0.05)，其第14天創(chuàng)面愈合比與模型組無顯著差別。

表2 姜黃素對小鼠創(chuàng)面愈合比的影響Table 2 Effect of curcumin on wound healing ratio in n=3)

*P<0.05 compared with model group.

2.3 傷口組織形態(tài)學(xué)觀察

實驗第14 天，組織切片染色結(jié)果(圖2)。相比對照組，模型組創(chuàng)面肉芽組織較少，可見少量成纖維細胞、中性粒細胞及毛細血管。相比模型組，Cur 8組肉芽組織更為豐富，可見較多的成纖維細胞、膠原纖維及新生毛細血管。Cur 4組病理改變介于模型組與Cur 8組之間。

*P<0.05 compared with model group圖2 DTPI后第14天的組織形態(tài)學(xué)觀察Fig 2 Histological examination at day 14 after DTPI(HE staining×100)

2.4 創(chuàng)面組織中相關(guān)因子mRNA的表達

深部組織壓力性損傷第14天，與對照組相比，模型組TGF-β、IL-10和VEGF-α的mRNA表達顯著減少(P<0.05)，IL-6和TNF-α的mRNA表達顯著增多(P<0.05)。Cur 4和Cur 8組創(chuàng)面組織中IL-6和TNF-α的mRNA表達水平均低于模型組(P<0.05)；而Cur 8組創(chuàng)面組織中VEGF-α、IL-10和TGF-β含量明顯高于模型組(P<0.05)(圖3)。

*P<0.05 compared with model group圖3 小鼠創(chuàng)面組織中TNF-α、IL-6、IL-10、VEGF-α、TGF-β mRNA表達Fig 3 mRNA expression of TNF-α, IL-6, IL-10, VEGF-α, TGF-β and HIF-1α in the wound n=3)

2.5 創(chuàng)面組織中相關(guān)因子蛋白的表達

與對照組相比，模型組VEGF-α、TGF-β和p-Stat3蛋白表達減少(P<0.05)。Cur 8組VEGF-α、TGF-β和p-Stat3蛋白較模型組明顯升高(P<0.05)，Cur 4組TGF-β和p-Stat3蛋白較模型組表達增加(P<0.05)，而3組實驗中Stat3蛋白含量無明顯區(qū)別(圖4)。

*P<0.05 compared with model group圖4 DTPI中p-Stat3、Stat3、 TGF-β 和 VEGF-α的蛋白表達Fig 4 Expression of p-Stat3, Stat3, TGF-β and VEGF-α in the DTPI in n=3)

3 討論

姜黃素具有抗感染、抗氧化、抗癌等多種藥理作用，臨床上常用于治療鼻炎、呼吸道疾病和腸道疾病等[7]，其對改善缺血-再灌注引起的腎損傷、腦損傷及炎性反應(yīng)等有很好的療效[8]，但姜黃素在缺血-再灌注引起的深部組織壓力性損傷中的保護作用及分子機制仍不明確。

深部組織壓力性損傷是由于骨突部位持續(xù)的機械力導(dǎo)致的多層組織壞死，持續(xù)的炎性反應(yīng)和血管密度驟減是其難以愈合的關(guān)鍵因素[9-10]。本實驗中局部注射姜黃素后， 創(chuàng)面愈合率優(yōu)于未處理模型組。HE結(jié)果表明，相比模型組，Cur 8組出現(xiàn)更多的毛細血管結(jié)構(gòu)、新生血管和血管壁增厚現(xiàn)象。與模型組相比，Cur 8組中IL-6和TNF-α的表達量顯著降低，而IL-10的表達量顯著增加。尤其，姜黃素可使深部組織壓力性損傷后組織中VEGF-α和TGF-β的表達量增加，該研究結(jié)果與報道一致[11]。IL-6和TNF-α是參與機體炎性反應(yīng)的重要炎性介質(zhì)，且TNF-α可誘導(dǎo)成纖維細胞凋亡，抑制膠原沉積，阻礙傷口愈合；而IL-10是一種存在于缺血組織中的抗炎細胞因子，能刺激創(chuàng)面肉芽組織形成，是組織修復(fù)中的重要細胞因子之一。說明姜黃素可以減輕深部組織壓力性損傷中的炎性反應(yīng)。

同時，本研究初步探索了姜黃素在深部組織壓力性損傷中的分子作用機制。JAK-STAT信號通路在機體的應(yīng)激與炎性反應(yīng)及創(chuàng)傷修復(fù)中發(fā)揮重要作用[12]。STATs對細胞因子信號的傳遞具有特異性， STAT3活化后成為p-STAT3, 能誘導(dǎo)細胞分化、凋亡及血管生成等生物學(xué)行為相關(guān)的下游靶基因的表達, 且VEGF啟動子上存有STAT3的結(jié)合位點序列[13]。Cur 8組p-STAT3、VEGF-α表達較模型組明顯增加，可見姜黃素激活STAT3進而誘導(dǎo)VEGF-α的表達，VEGF作為一種高度特異性的血管內(nèi)皮細胞有絲分裂源，進一步誘導(dǎo)新生血管形成，促進肉芽組織生成，從而加快創(chuàng)面愈合，實現(xiàn)促進小鼠深部組織壓力性損傷血管新生的作用。

綜上所述，8 mg/kg 姜黃素對于保護小鼠深部組織壓力性損傷效果顯著，且組織炎性反應(yīng)抑制及血管再生促進可能與姜黃素激活JAK-STAT信號通路直接相關(guān)。但姜黃素是否通過直接靶向作用于STAT3，姜黃素的治療劑量以及在臨床中是否具有同樣治療效果還有待后期進一步深入研究驗證。