標準桃金娘油減輕PM2.5致大鼠氣道黏液纖毛的損傷

杜 寧，劉小強，段 爭

(1.邯鄲市第一醫(yī)院東區(qū) 呼吸內(nèi)科，河北 邯鄲 056001；2.河北省環(huán)境監(jiān)測中心，河北 石家莊 050051； 3.河北醫(yī)科大學第二醫(yī)院 呼吸二科，河北 石家莊 050000)

呼吸系統(tǒng)作為細顆粒物進入人體的門戶，可受到大氣細顆粒物(動力學當量直徑小于或等于2.5 μm,fine particulate matter,PM2.5)直接或間接的影響，是其暴露的重要靶器官[1-2]。黏液纖毛清除系統(tǒng)(mucociliary clearance,MCC)作為呼吸道重要的防御機制之一，當機體受到香煙煙霧、粉塵和感染等因素影響，可引起黏液纖毛清除系統(tǒng)功能損傷。PM2.5對黏液纖毛清除系統(tǒng)的影響在多種呼吸系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展中起促進作用[3-4]。對機體的影響受PM2.5來源、暴露濃度和暴露時間等多種因素的影響。目前研究多為急性暴露模型，長期慢性暴露模型因造模困難、暴露周期長、花費較大和耗費人力等原因使用較少，但其對機體的損傷機制多不同于急性暴露，能更好的模擬人群自然生存條件下的健康效應。標準桃金娘油腸溶膠囊(myrtol standardized，又稱標準桃金娘油)是一種黏液溶解性祛痰藥，作用于上、下呼吸道黏膜發(fā)揮溶解黏液、刺激纖毛擺動，增強黏液纖毛清除系統(tǒng)功能[6]。本實驗通過采取直接暴露于大氣污染比較嚴重的石家莊市自然霧霾大氣中，觀察接近自然狀態(tài)下PM2.5暴露對MCC的影響及標準桃金娘油干預的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物：SPF級雄性SD大鼠，6～8周齡，(220±20)g，48只(河北醫(yī)科大學實驗動物中心提供，合格證編號：1501089)。

1.1.2 主要試劑：標準桃金娘油腸溶膠囊(德國希爾制藥有限公司)；小鼠抗大鼠MUC5AC單克隆抗體(GeneTex公司)；小鼠SP檢測試劑盒和DAB試劑盒(北京中杉金橋生物技術有限公司)；AB-PAS(alcian blue-periodic acid sthiff)染色試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、蛋白marker(30～460 ku)(Thermo Fisher公司)；擴增試劑盒(浙江愛必夢生物科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 動物的分組及處理：N(N3,N6)組大鼠吸入空氣凈化器過濾的清潔大氣，PM(PM3,PM6)組大鼠吸入室外霧霾空氣(PM2.5濃度的范圍29.90～99.65 mg/m3)，PM+CS組大鼠灌胃標準桃金娘油混懸液300 mg/(kg·d)。暴露3和6個月后，麻醉處死大鼠，留取標本。

1.2.2 氣管和肺組織染色：常規(guī)制片，行HE和AB-PAS染色，光鏡觀察黏液細胞化生及行病理炎行反應分級(參照文獻分4級)，采集圖像，以Image Pro-P1us 6.0醫(yī)學圖像分析軟件分析，得出數(shù)據(jù)。

1.2.3 掃描電鏡觀察氣管：取上段氣管，2.5%戊二醛固定液固定，送檢掃描電鏡。

1.2.4 BALF中細胞計數(shù)和分類：常規(guī)收集BALF液，4 ℃ 1 000 r/min 離心6 min。細胞計數(shù)板行細胞計數(shù)，瑞士-吉姆薩染色后行細胞分類，共計數(shù)200個細胞。

1.2.5 Real-time PCR：Trizol法提取總RNA，用紫外分光光度計測定總RNA濃度和純度(A260/A280比值)；按反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，-20 ℃或-80 ℃存儲。引物由上海英濰捷基貿(mào)易有限公司設計合成，序列如下：GAPDH：上游引物5′-ACTCTACCCACGGCAAGTTC-3′，下游引物5′-TGGGTTTCCCGTTGATGACC-3′；MUC5AC：上游引物5′-ACCGACCAGGTACACCGATA-3′，下游引物5′-CAACCTCCCATGCCATCTGT-3′；AQP5：上游引物5′-AAAGGGACGACAGCTTGCTT-3′，下游引物5′-TCCG TGAGCCATCTATCCCT-3′；按擴增試劑盒操作說明進行cDNA擴增，采用F=2-△△CT計算各組基因相對表達量。

1.2.6 免疫組化染色檢測MUC5AC蛋白表達：石蠟切片經(jīng)烤片、脫蠟至水、3% H2O2滅活內(nèi)源性過氧化物酶、微波抗原修復，余步驟按說明書進行。采集圖像，以Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件分析。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 肺及氣管組織病理學改變

PM組氣管壁充血、水腫和炎性細胞浸潤，鱗狀上皮細胞增生，纖毛排列紊亂，肺組織可見不同程度的炎性浸潤、肺泡壁斷裂融合、肺泡腔萎陷和肺間質(zhì)增生等損傷(圖1)。

2.2 各組AB-PAS染色相對著色面積比較

PM組細胞黏液化生情況較N組顯著增加(P<0.05)，而標準桃金娘油可減輕細胞黏液化生情況(P<0.05)(圖2，表1)。

2.3 掃描電鏡結(jié)果比較

PM2.5可致大鼠纖毛呈不同程度損傷，纖毛稀疏，排列紊亂，黏連及倒伏明顯，而標準桃金娘油可減輕纖毛損傷情況(圖3)。

2.4 BALF中細胞計數(shù)及分類的比較

PM2.5可致BALF中白細胞總數(shù)、中性粒細胞計數(shù)、中性粒細胞百分比升高，PM組顯著高于N組、PM+CS組(P<0.05)(表2)。

2.5 基因表達水平比較

MUC5AC mRNA表達水平PM組顯著高于N組、PM+CS組(P<0.05)，而AQP5 mRNA表達水平PM組顯著低于N組、PM+CS組(P<0.05)(表3)。

2.6 MUC5AC蛋白表達水平比較

PM組MUC5AC蛋白表達顯著高于N組、PM+CS組(P<0.05)(圖4，5，表4，5)。

3 討論

肺臟作為細顆粒物進入人體的門戶， 根據(jù)吸入氣體顆粒物粒徑大小、形態(tài)、電荷等特性的不同，人體通過鼻腔的濾過作用、MCC的清除功能、巨噬細胞的吞噬功能等多種方式清除吸入的顆粒物[7-8]。MCC作為呼吸道重要的防御機制之一，當其受損時，可引起微生物及顆粒物清除障礙，進而導致呼吸系統(tǒng)疾病的發(fā)生。PM2.5暴露損傷MCC的具體的損傷機制尚不明確。本研究采取大鼠直接暴露于石家莊市自然霧霾大氣中，建立PM2.5慢性暴露的動物模型，探討PM2.5慢性暴露對MCC的損傷機制。黏液纖毛清除系統(tǒng)高效的工作需要鹽和水的轉(zhuǎn)運、黏蛋白的合成和分泌、纖毛協(xié)調(diào)擺動三者之間恰當?shù)恼{(diào)節(jié)過程。黏液細胞化生可表現(xiàn)為黏蛋白基因和編碼黏蛋白糖基化的基因表達水平的改變，從而黏蛋白分泌增加。實驗證實PM2.5暴露可使致敏大鼠黏液細胞化生[9-10]，破壞氣道黏膜-纖毛屏障，使微生物及異物的清除障礙[3-4]。MUC5AC是呼吸道黏液的主要組成部分，PM2.5暴露可刺激MUC5AC分泌增加[11]。AQP5是介導水跨膜轉(zhuǎn)運的膜蛋白，在氣管水的轉(zhuǎn)運并維持細胞內(nèi)外水平衡、調(diào)節(jié)黏液分泌等過程中發(fā)揮重要作用，但AQP5與MUC5AC表達之間的相關性尚不明確[12-13]。本研究顯示PM2.5可致纖毛結(jié)構(gòu)損傷和肺炎性損傷，并誘導黏液高分泌，標準桃金娘油在一定程度可減輕PM2.5對黏液纖毛清除系統(tǒng)損傷，但不能逆轉(zhuǎn)和阻止其損傷作用。

A.N3 group; B.PM3 group; C.PM3+CS group; D.N6 group; E.PM6 group; F.PM6+CS group圖1 各組大鼠支氣管HE染色Fig 1 Bronchium tissues of rats among groups(×200,HE)

A.N3 group; B.PM3 group; C.PM3+CS group; D.N6 group; E.PM6 group; F.PM6+CS group圖2 各組大鼠AB-PAS染色結(jié)果Fig 2 AB-PAS staining results of rat in different groups (×200)

表1 各組大鼠肺組織AB-PAS染色陽性表達面積的比較Table 1 Comparison of positive expression acreage(Aep) by AB-PAS staining in rat lung tissues of different

*P<0.05 compared with N group;#P<0.05 compared with PM group.

A.N3 group; B.PM3 group; C.PM3+CS group; D.N6 group; E.PM6 group; F.PM6+CS group圖3 各組大鼠掃描電鏡觀察結(jié)果Fig 3 Observed results by scanning electron microscopy in different groups(×2 000)

表2 各組大鼠BALF細胞計數(shù)和分類的比較Table 2 Comparison of cell count and classification in BALF of different

*P<0.05 compared with N group;#P<0.05 compared with PM group.

表3 各組大鼠肺組織MUC5AC mRNA和AQP5 mRNA表達水平的比較Table 3 Comparison of MUC5AC and AQP5 gene expression level in lung tissue of n=8)

*P<0.05 compared with N group;#P<0.05 compared with PM group.

圖5 Western blot檢測MUC5AC蛋白表達Fig 5 Expression of MUC5AC protein detected by Western blot

綜上所述，PM2.5作為大氣污染物，可損傷氣道防御機制，引起黏液纖毛清除系統(tǒng)功能減低，微生物和顆粒物清除障礙，從而反復感染加重肺臟損傷，這可能是PM2.5引起呼吸系統(tǒng)損傷的重要機制之一，而標準桃金娘油作為一種黏液溶解性祛痰藥，能一定程度減輕其損傷作用。目前PM2.5參與損傷的具體信號傳導途徑尚不明確，需進一步實驗闡明。

表4 各組大鼠肺組織MUC5AC蛋白表達水平的比較Table 4 Immumohistochemical staining of MUC5AC protein in different

*P<0.05 compared with N group;#P<0.05 compared with PM group.

表5 各組大鼠肺組織MUC5AC蛋白表達水平的比較Table 5 MUC5AC protein levels in lung tissue of

*P<0.05 compared with N group;#P<0.05 compared with PM group.