雌激素促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞系U-87增殖和侵襲

劉艷敏，費(fèi)以琳，黎星淼，王 寧，陳 沫，江秀秀*

(1.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院 婦科, 浙江 杭州 310006; 2.海寧市中心醫(yī)院 婦產(chǎn)科, 浙江 海寧 314408)

子宮內(nèi)膜異位癥(endometriosis, EMS)患病率在育齡婦女中達(dá)到10%～15%，嚴(yán)重影響到婦女的身心健康。有研究報(bào)道，子宮內(nèi)膜異位癥患者中星形膠質(zhì)細(xì)胞被活化[1]，但是其具體機(jī)制仍不明確。子宮內(nèi)膜異位癥是雌激素依賴性疾病，因此推測雌激素可能促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞的增殖和侵襲。水通道蛋白(aquaporins, AQPs)是一類膜通道蛋白，其主要功能是提升水穿過質(zhì)膜的效率， 維持細(xì)胞滲透壓平衡[2-3]。AQP2是AQPs家族中的一員，對(duì)不同時(shí)期子宮內(nèi)膜AQP2的免疫組化分析發(fā)現(xiàn)，AQP2在人子宮內(nèi)膜中均有表達(dá)，且其表達(dá)量隨月經(jīng)周期而周期性變化[4-5]，表明AQP2可能在性激素作用下對(duì)子宮內(nèi)液體平衡起著重要作用。同時(shí)最新的研究表明AQP2在外周神經(jīng)病理性疼痛中扮演重要作用[6-7]，但是AQP2與星形膠質(zhì)細(xì)胞的增殖和侵襲仍待進(jìn)一步探究。本研究通過體外培養(yǎng)星形膠質(zhì)細(xì)胞系U-87進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)，分析雌激素與星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖和侵襲之間的關(guān)系以及可能的機(jī)制。

1 材料及方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

星形膠質(zhì)細(xì)胞系U-87、17-β雌二醇和cell counting kit-8 細(xì)胞增殖-毒性檢測試劑盒(東仁化學(xué)科技有限公司)；兔抗PGE2抗體(Bioss公司)；兔抗NGF抗體和兔抗AQP2抗體(Affinity公司)；兔抗GAPDH抗體(Proteintech公司);PrimeScri? RT Reagent Kit with gDNA Eraser和 qPCR Kit(SYBR Premix Ex Taq)(TaKaRa公司);IL-1β酶聯(lián)免疫試劑盒、TNF-α酶聯(lián)免疫試劑盒和IL-6酶聯(lián)免疫試劑盒(杭州達(dá)文生物有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞的分組處理：細(xì)胞以1 500個(gè)/孔鋪96孔板(每孔100 μL培養(yǎng)基)，細(xì)胞貼壁后，取U-87細(xì)胞進(jìn)行分組處理：使用不同濃度的雌激素(0、10-12、10-10、10-8和10-6mol/L)處理U-87細(xì)胞，每個(gè)濃度3個(gè)復(fù)孔。分別在雌激素處理的0、24、48和96 h檢測細(xì)胞增殖侵襲情況，為保證雌激素的濃度，48 h后給細(xì)胞換液，仍然保證雌激素的濃度為0、10-12、10-10、10-8和10-6mol/L。

1.2.2 RT-qPCR 檢測mRNA：細(xì)胞貼壁后分別使用不同濃度雌激素處理細(xì)胞，24 h收樣，提取mRNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，熒光定量分析PGE2、NGF、IL-1β、TNF-α、IL-6、PGE2、NGF、AQP2、AQP5和AQP8的mRNA表達(dá)變化。

1.2.3 Western blot 和ELISA檢測蛋白：取不同濃度雌激素處理的U-87細(xì)胞，提取細(xì)胞蛋白，分析雌激素處理后U-87細(xì)胞的PGE2、NGF、AQP2表達(dá)量變化。根據(jù)ELISA試劑盒根據(jù)說明書檢測不同濃度雌激素處理的U-87細(xì)胞上清中IL-1β、TNF-α、IL-6含量的變化。

1.2.4 CCK8法檢測細(xì)胞增殖侵襲：CCK8法檢測不同濃度雌激素處理U87細(xì)胞增殖能力的影響。同時(shí)制備細(xì)胞懸液調(diào)整細(xì)胞至5×105個(gè)/mL，取細(xì)胞懸液100 μL加入Transwell上室；24孔板下室加入600 μL含20% FBS的培養(yǎng)基，設(shè)5個(gè)梯度，分別加入0，10-12、10-10、10-8和10-6mol/L雌激素；37 ℃培養(yǎng)24 h。取出Transwell小室，固定，結(jié)晶紫染色計(jì)數(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 雌激素下調(diào)U-87細(xì)胞細(xì)胞因子及AQP2的mRNA表達(dá)

與對(duì)照組相比，雌激素抑制IL-1β、TNF-α、AQP2、AQP5、AQP8的表達(dá)；抑制效應(yīng)呈一定范圍內(nèi)濃度依賴性，10-7mol/L濃度雌激素抑制作用最顯著；而對(duì)IL-6的表達(dá)，則呈現(xiàn)低濃度促進(jìn)，高濃度抑制的效應(yīng)(圖1)。

*P<0.05，**P<0.01 compared with control圖1 雌激素對(duì)U87細(xì)胞IL-1β、TNF-α、IL-6、AQP2、AQP5、AQP8 mRNA表達(dá)的影響Fig 1 Effects of the estrogen on the mRNA expression of IL-1β, TNF-α, IL-6, AQP2, AQP5 and AQP8 in U87 cells n=3)

2.2 雌激素促進(jìn)U87細(xì)胞PGE2、NGF mRNA表達(dá)

與對(duì)照組相比，雌激素對(duì)NGF、PGE2 mRNA表達(dá)均起到上調(diào)作用(圖2)。對(duì)于NGF的促進(jìn)作用在10-8mol/L最佳，而對(duì)于PGE2的促進(jìn)作用10-6mol/L 最佳。

*P<0.05，**P<0.01 compared with control圖2 雌激素對(duì)U87細(xì)胞NGF及PGE2 mRNA表達(dá)的影響Fig 2 Effects of the estrogen on expression of NGF and PGE2 mRNA in U87 cells n=3)

2.3 雌激素調(diào)控U-87細(xì)胞PGE2、NGF、AQP2的表達(dá)

與對(duì)照組相比，雌激素對(duì)NGF、PG蛋白表達(dá)均有一定的上調(diào)作用(圖3)，且隨激素濃度增加，上調(diào)作用增強(qiáng)；而雌激素對(duì)AQP2蛋白表達(dá)呈抑制作用，隨激素濃度增加，抑制作用增強(qiáng)，與基因表達(dá)趨勢一致。

圖3 雌激素對(duì)U87細(xì)胞中PGE2、NGF、AQP2蛋白表達(dá)的影響Fig 3 Effects of estrogen on U-87 cell PGE2, NGF, AQP2 protein expression

2.4 雌激素對(duì)U-87細(xì)胞IL-1β、TNF-α、IL-6蛋白的調(diào)控

相比對(duì)照組，雌激素對(duì)IL-1β、TNF-α、IL-6蛋白含量均有一定的下調(diào)作用(圖4)，呈現(xiàn)濃度依賴性，且以10-7mol/L濃度雌激素抑制作用最顯著，與qPCR結(jié)果相一致。雌激素抑制炎性細(xì)胞因子的表達(dá)。

*P<0.05，**P<0.01 compared with control圖4 雌激素對(duì)U87細(xì)胞IL-1β、TNF-α、IL-6表達(dá)的影響Fig 4 Effects of estrogen on U-87 cell IL-1β, TNF-α, IL-6 protein expression n=3)

2.5 不同濃度雌激素對(duì)U87細(xì)胞增殖侵襲能力的影響

細(xì)胞增殖結(jié)果顯示，相比對(duì)照組，在0～48 h內(nèi)，不同濃度雌激素組的細(xì)胞增殖均呈明顯上升趨勢，且在雌激素作用48 h時(shí)，10-10、10-8和10-6mol/L濃度組細(xì)胞增殖最強(qiáng)(P<0.05)，隨著雌激素作用時(shí)間的繼續(xù)延長，達(dá)到96 h后，各組細(xì)胞的增殖呈現(xiàn)下降趨勢。同時(shí)transwell結(jié)果顯示，相比對(duì)照組(0 mol/L)，雌激素濃度為10-8mol/L、10-6mol/L時(shí)，細(xì)胞遷移數(shù)顯著增加，且10-6mol/L相比10-8mol/L對(duì)細(xì)胞侵襲活性作用最顯著(圖5)。

*P<0.05，**P<0.01 compared with control圖5 雌激素對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞U-87增殖(左)、侵襲(右)的影響Fig 5 Effects of estrogen on the U87 cell proliferation (left), cell invasion n=3)

3 討論

EMS是雌激素依賴性疾病，子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)生發(fā)展與雌激素密切相關(guān)。有研究報(bào)道，子宮內(nèi)膜異位癥患者中星形膠質(zhì)細(xì)胞被活化，而雌激素可以促進(jìn)激活星形膠質(zhì)細(xì)胞[8]，但是機(jī)制尚不明確。本研究通過體外培養(yǎng)星形膠質(zhì)細(xì)胞，進(jìn)行不同濃度雌激素處理，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，不同濃度的雌激素處理星形膠質(zhì)細(xì)胞，抑制細(xì)胞因子IL-1β、TNF-α、IL-6的表達(dá)，促進(jìn)PGE2、NGF的表達(dá)，促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞的增殖和侵襲。星形膠質(zhì)細(xì)胞可以合成和釋放許多神經(jīng)元必需的神經(jīng)營養(yǎng)素和免疫細(xì)胞因子，如BDNF、NGF、IL-1、IL-6等。IL-1與星形膠質(zhì)細(xì)胞的增殖和侵襲相關(guān)，而IL-6可能促進(jìn)中樞神經(jīng)活化[9]，因此雌激素抑制IL-1和IL-6的表達(dá)，有助于促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞的增殖。神經(jīng)生長因子NGF作為神經(jīng)營養(yǎng)素家族中的一員， 激活的星形膠質(zhì)細(xì)胞可以產(chǎn)生大量的NGF促進(jìn)神經(jīng)損傷修復(fù)，研究表明在一定程度上NGF促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞的增殖和侵襲。

作為AQPs家族中的一員， AQP2除了介導(dǎo)液體轉(zhuǎn)運(yùn)、維持機(jī)體滲透平衡外，可能還參與促進(jìn)細(xì)胞遷移、調(diào)節(jié)脂肪和糖原代謝以及神經(jīng)信號(hào)傳導(dǎo)等過程。疼痛是子宮內(nèi)膜異位癥的重要表現(xiàn)之一，而最新的研究表明AQP2在外周神經(jīng)病理性疼痛中扮演重要作用，推測AQP2與子宮內(nèi)膜異位癥病理性疼痛相關(guān)。通過雌激素處理星形膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，雌激素處理組AQP2的表達(dá)顯著下降，雌激素抑制AQP2的表達(dá)，與之前研究一致[10]。同時(shí)AQP2與細(xì)胞的增殖和侵襲有關(guān)，有研究報(bào)道，在子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞中，雌激素反應(yīng)元件(estrogen response element，ERE)-AQP2信號(hào)通路調(diào)控雌激素促進(jìn)細(xì)胞的增殖和侵襲[11-12]。因此，雌激素可能通過ERα調(diào)控ERE-AQP2的結(jié)合，釋放細(xì)胞因子活化星形膠質(zhì)細(xì)胞，促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞的增殖和侵襲。

綜上所述，本研究通過研究雌激素處理星形膠質(zhì)細(xì)胞觀察AQP2、NGF及細(xì)胞因子的表達(dá)變化，探究雌激素與星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖和侵襲的關(guān)系，確立雌激素下調(diào)AQP2的表達(dá)，調(diào)控細(xì)胞因子和神經(jīng)營養(yǎng)素的表達(dá)，促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞的增殖和侵襲。