文冠果果殼提取物對植物病原菌的抑菌活性

王志玲，張家興，王曉瞳，楊秀云，谷曉杰，閆冬佳，曹揮*

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，北方功能油料樹種培育與研發(fā)山西省重點實驗室，山西 太谷 030801；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，山西 太谷 030801)

文冠果(XanthocerassorbifoliumBunge)是無患子科文冠果屬植物，原產(chǎn)于我國黃土高原地區(qū)，目前主要分布在內(nèi)蒙、陜西、山西、河北、甘肅等地[1]。文冠果果實包括果殼和種子2部分，果殼約占果實總重的50%[2]。文冠果果殼具有多種生物活性，如抗阿爾茨海默病[3]、抗腫瘤[4]、改善學(xué)習(xí)記憶障礙等[5]。也有研究指出文冠果果殼可作為牛羊的飼養(yǎng)材料[6]或新型的高密度聚乙烯復(fù)合材料[7]。另外文冠果果殼提取物對一些人體致病菌，如肺炎克雷伯菌、大腸桿菌、綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌均有不同程度的抑制活性[8,9]。前人報道，次生代謝產(chǎn)物單寧[10]、類黃酮[11]、皂苷[12]等成分是提取物產(chǎn)生抑菌活性的主要原因。

文冠果種子含油率達(dá)35%～40%，是一種良好的生物柴油原料。隨著全球能源危機(jī)和環(huán)境污染問題的日益嚴(yán)重，國家林業(yè)局早在本世紀(jì)初已開展文冠果種子制備生物柴油的研究和推廣工作[13]。目前我國北方地區(qū)已發(fā)展文冠果十萬余畝，按照中石油生產(chǎn)生物柴油標(biāo)準(zhǔn)，小規(guī)模標(biāo)準(zhǔn)廠房年消耗文冠果種子約30萬t，同時會產(chǎn)生30萬t果殼[13]。如何有效利用文冠果果殼這一重要資源、是我們面臨的一個重要問題。

蘋果輪紋病菌(Botryosphaeriadothidea)[14]、葡萄圓斑根腐病菌(Fusariumoxysporum)[15]、山核桃根腐病菌(Fusariumspp.)[16]、番茄枯萎病菌(Fusariumoxysporumf.sp.lycopersici)[17]、番茄灰霉病菌(Botrytiscinerea)[18]、梨黑斑病菌(Alternariaalternata)[19]是果蔬上的重要病害，顯著影響了我省蘋果、葡萄、梨、番茄等經(jīng)濟(jì)果蔬的產(chǎn)量和質(zhì)量，發(fā)病嚴(yán)重時造成了全部植株的死亡。現(xiàn)階段對這些病害的防治措施主要是噴灑化學(xué)農(nóng)藥，但大量使用化學(xué)農(nóng)藥會造成嚴(yán)重的食品農(nóng)藥超標(biāo)及環(huán)境污染。由于植物源農(nóng)藥對生態(tài)環(huán)境比較安全、對非靶標(biāo)生物影響較小、原材料來源廣泛等特點，在病蟲害的防治過程中備受關(guān)注。文冠果果殼富含生物活性物質(zhì)，但大量果殼作為廢棄物處理、未得到充分應(yīng)用。因此本文擬對果殼提取物進(jìn)行初步的成分分析和抗植物病原菌活性試驗，以期為文冠果果殼做殺菌劑的研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 植物材料

文冠果果殼購自山西忻州市河曲縣晉野草藥，經(jīng)咨詢采自忻州東部黃土丘陵區(qū)，為當(dāng)?shù)匾吧墓诠贩N，含水量<5%。

1.1.2 供試菌種

蘋果輪紋病菌(B.berengeriana)、葡萄圓斑根腐病菌(F.oxysporum)、山核桃根腐病菌(Fusariumspp.)、番茄枯萎病菌(F.oxysporumf.sp.lycopersici)、番茄灰霉病菌(B.cinerea)和梨黑斑病菌(A.alternata)由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理實驗室提供。

1.1.3 藥品與試劑

藥品：人參皂苷Rb1(Ginsenoside Rb1，HPLC>98%，成都植標(biāo)化純生物技術(shù)有限公司)。

試劑：單寧、總酚、類黃酮檢測試劑盒/測試方法(上海信帆生物科技有限公司)。乙醇/水(75%±5%，批號：170302，河北康濟(jì)藥械有限公司)、石油醚(分析純，天津市北辰方正試劑場)、乙酸乙酯(分析純，天津市凱通化學(xué)試劑有限公司)、甲醇(分析純，天津市天力化學(xué)試劑有限公司)、高氯酸(優(yōu)級純，天津政成化學(xué)制品有限公司)。

1.1.4 供試培養(yǎng)基

本試驗采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)[20]：將馬鈴薯洗凈去皮，稱取200 g馬鈴薯切塊放入鍋中加水1 000 mL煮20～30 min，以4層紗布過濾后，加入20 g葡萄糖及20 g瓊脂粉搖勻冷卻后，補(bǔ)加至 1 000 mL，三角瓶分裝后，塞上棉塞以報紙包裹瓶口放入滅菌鍋滅菌，冷卻至室溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要儀器設(shè)備

儀器設(shè)備：粉碎機(jī)(上海壘固儀器有限公司)、BSA224S-CW電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司)、DL-400循環(huán)冷卻器(鄭州長城科中貿(mào)有限公司)、RE-52旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠)、SHZ-Ⅲ型循環(huán)水真空泵(上海亞榮生化儀器廠)、超聲波清洗儀(上海亞榮生化儀器廠)、721G可見分光光度計(上海儀電分析儀器有限公司)、Eppendorf生物光譜計、水浴鍋(天津市泰斯特儀器有限公司)、超凈工作臺(北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限責(zé)任公司)、滅菌鍋(江陰濱江醫(yī)療設(shè)備有限公司)、恒溫培養(yǎng)箱(哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司)。

1.3 試驗方法

1.3.1 文冠果果殼不同提取物的制備

將文冠果果殼通過粉碎機(jī)磨至粉末(200目)，取60 g粉末于1 000 mL三角瓶中，加入420 mL 75%乙醇-水溶液(以下簡稱為75%乙醇或乙醇)，封膜后放于超聲波清洗儀中萃取30 min，得到萃取液后，于濾渣中再次加入420 mL 75%乙醇重復(fù)萃取30 min，將2次萃取液混合并通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，蒸干即得到文冠果果殼的乙醇提取物，4 ℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

采用相似的方法，取60 g粉末于1 000 mL三角瓶中，加入500 mL乙酸乙酯或石油醚，做3組重復(fù)，每組按上述方法萃取2次后，3組萃取液混合濃縮后蒸干，得到乙酸乙酯及石油醚提取物，4 ℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 不同提取物中單寧、總酚、類黃酮以及皂苷含量檢測

1.3.2.1 單寧含量測定及計算[21,22]

稱取0.1 g提取物，加入1 mL蒸餾水，充分勻漿后轉(zhuǎn)移至2 mL離心管中，80 ℃水浴提取30 min，于25 ℃離心10 min后(RCF=8 000×g)，取上清液待測。具體檢測方法如下：將磷鉬酸溶液、氫氧化鈉溶液在37 ℃預(yù)熱10 min，取2支試管分別標(biāo)記為對照管和測定管，對照管中加入1 330 μL蒸餾水、350 μL磷鉬酸溶液；測定管中加入30 μL待測液樣本、1 300 μL蒸餾水和350 μL磷鉬酸溶液。分別靜置5 min后，向2試管中加入320 μL的氫氧化鈉溶液。由于單寧在堿性環(huán)境下與磷鉬酸反應(yīng)，生成藍(lán)色化合物，可運用可見分光光度法(760 nm)測定其吸光值。

標(biāo)準(zhǔn)條件下測定的回歸方程為y=0.008x-0.002 1；x為標(biāo)準(zhǔn)品單寧酸的濃度(mg·L-1)，y為吸光值。

單寧含量(mg·g-1)=(C×V)/(W×1000)；C為根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求得的測定管單寧酸含量(mg·L-1), V為單寧粗提液總體積(2 mL)，W為提取物質(zhì)量(0.1 g)。

1.3.2.2 總酚含量測定及計算[23]

稱取0.25 g提取物與10 mL離心管中，加入甲醇-鹽酸緩沖液至8 mL。4 ℃下避光靜置20 min，期間搖動2～3次，然后過濾至離心管中，濾液即為總酚粗提液。吸取2 mL總酚粗提液待測。具體檢測方法如下：分別吸取沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1.0 mL于試管中，加蒸餾水至1 mL，配置成0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1.0 g·L-1的系列總酚標(biāo)準(zhǔn)溶液。以甲醇-鹽酸緩沖液作為空白對照調(diào)零，在280 nm下測定其吸光值。以同樣方式測量樣品中吸光值的大小，并通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出粗提物的總酚含量。

標(biāo)準(zhǔn)條件下測定的回歸方程為y=1.739 3x-0.040 2；x為標(biāo)準(zhǔn)品沒食子酸的濃度/(g·L-1)，y為吸光值。

總酚含量/(mg·g-1)=(C×V)/W；C為根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求得的測定管沒食子酸含量/(g·L-1), V為總酚粗提液總體積(8 mL)，W為提取物質(zhì)量(0.25 g)。

1.3.2.3 類黃酮含量測定及計算[24]

類黃酮的測定與總酚測定方法相似，以甲醇-鹽酸緩沖液為對照進(jìn)行調(diào)零，在325 nm處測定。標(biāo)準(zhǔn)條件下測定的回歸方程為y=0.004 1x+0.035；x為標(biāo)準(zhǔn)品蘆丁的濃度/(mg·L-1)，y為吸光值。

類黃酮含量/(mg·g-1)=(C×V)/(W×1000)；C為根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求得的測定管蘆丁的含量/(mg·L-1), V為總酚粗提液總體積(8 mL)，W為提取物質(zhì)量(0.25 g)。

1.3.2.4 皂苷含量的測定[25]

以人參皂苷作為標(biāo)準(zhǔn)品，甲醇作為溶劑，配置成0.312 g·L-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液，取6只試管編號，分別吸取0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6 mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液于試管中，另取1只試管加入1 mL甲醇溶液做空白對照，將7只試管100 ℃水浴加熱，使甲醇烘干。而后加入10 mL高氯酸溶液，65 ℃水浴加熱15 min，待反應(yīng)結(jié)束后放入冰水中冷卻，使其停止反應(yīng)。將各試管溶液轉(zhuǎn)移至比色皿中，以對照管調(diào)零，于321 nm處測量吸光值并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=2.437 3x+0.091 4；x為標(biāo)準(zhǔn)品人參皂苷的濃度(g·L-1)，y為吸光值。

分別稱取10 mg乙醇提取物、乙酸乙酯提取物、石油醚提取物于試管中，加入少量甲醇于燒杯中溶解后，轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，洗滌燒杯3次并將洗滌液轉(zhuǎn)移至容量瓶中，滴加溶液至刻度線后搖勻，對配置成的0.1 g·L-1的3種溶液進(jìn)行測定并計算。

1.3.3 抑菌活性檢測

利用二倍稀釋法[26]將乙醇、乙酸乙酯和石油醚3種不同提取物配置成2 g·L-1的加藥培養(yǎng)基，按1∶10的比例與培養(yǎng)基混合后，倒平板。采用生長速率測定法[20]進(jìn)行抑菌活性檢測：分別利用6 mm孔徑的打孔器在菌絲生長旺盛的地方打取6種菌餅，接種至加藥后的PDA平板中，在25 ℃下恒溫培養(yǎng)，每種提取物重復(fù)3次，以無菌水作為空白對照。分別于24、48、72、96 h后測量每個菌落的直徑，并根據(jù)以下公式計算出其抑制率。

菌絲生長抑制率=(對照菌落直徑-處理菌落直徑)/(對照菌落直徑-0.6)×100%

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2010和SPSS22.0對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行系統(tǒng)處理，采用單因素方差分析法(one-way ANOVA)對數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和差異顯著性檢驗(α=0.05)，采用逐步回歸模型對抑菌活性以及提取物活性成分進(jìn)行分析，并建立了回歸方程。

2 結(jié)果與分析

2.1 各提取物成分分析

研究發(fā)現(xiàn)不同溶劑提取物中，單寧、總酚、類黃酮和皂苷含量各有所不同。除類黃酮含量在乙醇/水(75%)和乙酸乙酯提取物中沒有顯著差異外，其余成分含量均為乙醇/水(75%)提取物中最高，乙酸乙酯次之，而石油醚中最低。乙醇/水(75%)提取物中單寧、總酚、類黃酮和皂苷的含量分別是石油醚提取物的20、4、5和10倍(表1)。

2.2 不同提取物對致病菌的抑制活性

不同溶劑提取物對6種致病菌的抑制活性普遍表現(xiàn)為75%乙醇>乙酸乙酯>石油醚(圖1)。在不同的處理時間，乙醇提取物的抑菌效果相對穩(wěn)定，乙酸乙酯和石油醚提取物的抑菌效果在處理48 h后趨于穩(wěn)定。24 h時，乙酸乙酯提取物對蘋果輪紋病菌的抑制率為100%，大于75%乙醇，隨著時間的推移，其抑制效果逐漸減弱，于96 h降到了50%；石油醚提取物在24 h時對蘋果輪紋病菌的抑制率與75%乙醇無顯著差異，之后大幅度降低(圖1A)。乙酸乙酯提取物對葡萄根腐病菌的抑制率于24 h時為87%，與75%乙醇提取物無顯著性差異，之后逐漸降低，于96 h后降到46%；石油醚提取物的抑制率最初為63%，之后大幅度降低，于96 h降低到27%(圖1B)。乙酸乙酯提取物在24 h時對山核桃根腐病菌的抑制率與75%乙醇無顯著差異，之后降低，于96 h后降到38%；24 h時，石油醚提取物的抑制率與75%乙醇無顯著差異，后大幅度降低，于96 h后降至46%(圖1C)。乙酸乙酯提取物在24 h時對番茄灰霉病菌的抑制率與75%的乙醇提取物相似，之后緩慢降低，于96 h后降到29%；24 h時，石油醚提取物對番茄灰霉病菌的抑制率為56%，在48 h時陡然下降至9%，之后逐步趨于穩(wěn)定(圖1D)。乙酸乙酯提取物在24 h時對番茄枯萎病菌的抑制率為50%，遠(yuǎn)低于75%乙醇提取物，之后逐漸降低，于96 h降到29%；石油醚提取物在24 h時的抑制率為0%，之后緩慢增加，經(jīng)過小幅度增長與降低，于96 h后穩(wěn)定到5%(圖1E)。乙酸乙酯提取物在24 h時對梨黑斑病菌的抑制率為76%，與75%乙醇提取物沒有顯著差異，之后逐漸降低，于96 h后降到28%，石油醚提取物對梨黑斑病菌的抑制率抑制保持在較低水平(圖1F)。

表1 不同溶劑提取物成分分析Table 1 Component analysis of different solvent extracts 單位:(mg·g-1)

圖中小寫字母不同表示差異性顯著(P<0.05)The different lowercase letters in the figure indicate significant difference(P<0.05)圖1 文冠果果殼提取物對不同植物病原菌的抑制效果Fig.1 Inhibitory effect of Shells extracts from X. Sorbifolium on different plant pathogens

2.3 逐步回歸分析

逐步回歸分析總偏回歸方程標(biāo)準(zhǔn)化系數(shù)(NC)的大小代表對應(yīng)自變量影響力的強(qiáng)弱，標(biāo)準(zhǔn)化系數(shù)正負(fù)值分別代表自變量對因變量起到促進(jìn)或抑制作用[27]，P為拒絕原假設(shè)的值，P<0.05表示促進(jìn)或抑制作用顯著，P<0.01表示極顯著。本文設(shè)48 h提取物對不同致病菌的抑制率為因變量，不同提取物中各活性組分的含量為自變量，通過逐步回歸分析，剔除無關(guān)變量后得到以下回歸方程(表2)。結(jié)果表明，影響蘋果輪紋病菌的主導(dǎo)因素為單寧(NC=0.917,P<0.01)。類黃酮是葡萄根腐病菌的主導(dǎo)影響因子(NC=0.927，P<0.05)；皂苷是山核桃根腐病菌(NC=0.940,P<0.01)和梨黑斑病菌(NC=0.945,P<0.05)的主導(dǎo)影響因子；番茄枯萎病菌的主導(dǎo)影響因子是單寧與總酚(NC=1.043，P<0.01)；回歸方程顯示單寧也是番茄灰霉病菌的影響因子，但差異不顯著(NC=0.995，P>0.05)。

表2 逐步回歸分析Table 2 Stepwise regression analysis

3 討論與結(jié)論

本試驗以文冠果果殼為研究材料，檢測其活性成分及抑菌效果。結(jié)果表明乙醇提取物對總酚、單寧、類黃酮和皂苷的提取率均為最佳，并且對6種病原菌的抑制效果最好，最穩(wěn)定。段蘇珍等[28]測試了煙草乙醇提取物對4種細(xì)菌、11種真菌的抑制效果，發(fā)現(xiàn)乙醇溶液提取物對蘋果炭疽、蘋果腐爛病菌、番茄枯萎、棉花枯萎和黃瓜枯萎病菌抑制效果最佳。相對于其它有機(jī)溶劑，乙醇為相對安全、溫和，在植物化學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。乙醇提取物對番茄枯萎病菌的抑制率達(dá)到了100%，對其它5種病原菌的抑制活性均大于80%，表現(xiàn)出良好的抑菌效果。楊蘇蘇等[29]人曾比較了20多種不同的植物提取物對番茄枯萎病菌的抑制效果，發(fā)現(xiàn)所選材料中只有丁香莖提取物對其抑制效果達(dá)到100%，與文冠果果殼提取物相似，因此文冠果果殼可作為研究番茄枯萎病菌抑制效果的良好原材料。

逐步回歸分析結(jié)果表明，單寧為蘋果輪紋病菌和番茄灰霉病菌的主導(dǎo)影響因子。單寧具有調(diào)節(jié)植物生長代謝和殺蟲抑菌的作用[30]，比如五倍子單寧提取物對綠膿假單胞菌、鼠傷寒桿菌、李斯特桿菌、白色念珠球菌、蘋果青霉、耐熱菌繁殖體、巨大芽孢桿菌均有顯著的抑菌作用[31]，目前已應(yīng)用到殺菌劑的生產(chǎn)中[32]。皂苷是山核桃根腐病菌和梨黑斑病菌2種病菌的主導(dǎo)抑制因子，但并不意味著皂苷對其余4種植物病原菌沒有效果，有可能是提取物中皂苷含量相對較低，還未能達(dá)到抑制相關(guān)病原菌的濃度。比如同為無患子科的無患子，其皂苷提取液對獼猴桃腐爛病菌、桉樹潰瘍病菌、歐美楊樹潰瘍病細(xì)菌均有較強(qiáng)的抑制活性[12]。

目前對文冠果果殼生物活性的篩選和評價大多停留在粗提物水平，對化學(xué)成分和生物活性結(jié)合的研究不多，活性物質(zhì)與作用機(jī)制尚不清晰，在植物保護(hù)領(lǐng)域的報道相對較少。后續(xù)對文冠果果殼活性成分的提取、分離以及生物活性測試，能夠驗證此類成分的殺菌效果以及起作用的關(guān)鍵化合物，為開發(fā)以文冠果果殼為原料的植物殺菌劑的提供數(shù)據(jù)支撐。