抗蘋(píng)果輪紋病菌植物篩選及反式茴香腦抑菌機(jī)理

谷曉杰，安麗，何曉婷，馮雪，楊春，武文卿，李少華，曹揮

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院,山西 太谷 030801)

由貝氏葡萄座腔菌(Botryosphaeriadothidea)引起的蘋(píng)果輪紋病是目前制約蘋(píng)果品質(zhì)提升、產(chǎn)量提高的“頭號(hào)禍根”,其在被害枝干上以菌絲體、分生孢子器及子囊殼進(jìn)行越冬,條件適宜時(shí)產(chǎn)生的分生孢子成為該病的侵染源[1,2]。蘋(píng)果輪紋病主要危害蘋(píng)果樹(shù)的枝干及果實(shí)。病菌侵染枝干后發(fā)病部位凸起,周圍樹(shù)皮裂開(kāi)并翹起。次年以此發(fā)病部位為中心向四周不斷擴(kuò)展,形成同心輪紋狀病斑。該病害具有潛伏期,田間青果被侵染后有近50%不表現(xiàn)癥狀,在果實(shí)成熟或儲(chǔ)藏過(guò)程中才開(kāi)始發(fā)病,侵染后期出現(xiàn)黑色僵果,并在表面產(chǎn)生子實(shí)體[3～7]。

利用植物自身防御功能及植物與有害生物協(xié)同進(jìn)化產(chǎn)物—次生代謝物質(zhì)進(jìn)行植物源農(nóng)藥研發(fā)是當(dāng)前農(nóng)藥研究的一個(gè)熱點(diǎn)[8～10]。八角茴香(Illiciumverum)屬于木蘭科八角屬,主要分布在我國(guó)云南、貴州、四川等省,是我國(guó)重要的“藥食同源”樹(shù)種之一[11]。八角茴香作為調(diào)料與香辛料在食品加工及香料工業(yè)中被廣泛應(yīng)用；同時(shí)八角茴香作為一種藥材,可用于治療消化不良,神經(jīng)衰弱等病癥[12,13]。有研究發(fā)現(xiàn)八角茴香精油對(duì)醫(yī)學(xué)和食品中的致病細(xì)菌具有較強(qiáng)的抑制作用[14]；八角茴香精油對(duì)于一些貯糧害蟲(chóng)也具有良好的滅殺和趨避作用[15,16]。同時(shí),八角茴香油精對(duì)棉花枯萎病菌也表現(xiàn)出較明顯的抑制作用[17],但有關(guān)八角茴香精油抑菌機(jī)理的報(bào)道相對(duì)較少。

本研究以蘋(píng)果輪紋病為研究對(duì)象,篩選了17種植物試驗(yàn)其抑菌活性,并對(duì)效果最好的八角茴香中的主要活性成分反式茴香腦展開(kāi)進(jìn)一步研究,為新型植物源殺菌劑的開(kāi)發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試植物:分別為13個(gè)科17個(gè)種(表1)；

反式茴香腦:購(gòu)自上海麥克林生化科技有限公司；

供試菌種:蘋(píng)果輪紋病菌(Botryosphaeria),由山西農(nóng)大植物病理系提供。

表1 供試植物樣品Table 1 Test plant samples

1.2 方法

1.2.1 17種植物提取物對(duì)蘋(píng)果輪紋病的抑制作用

采用菌絲生長(zhǎng)速率法[18]進(jìn)行抑菌活性測(cè)定。

1.2.2 八角茴香與博落回2種植物提取物對(duì)蘋(píng)果輪紋病菌的抑制中濃度

針對(duì)蘋(píng)果輪紋病菌,選取抑制效果最好的植物提取物,利用二倍稀釋法[19]將八角茴香與博落回2種植物提取物配制成2、1、0.5、0.25、0.125 g·L-1共5個(gè)濃度并制作加藥培養(yǎng)基,測(cè)定各濃度對(duì)應(yīng)的抑菌率,統(tǒng)計(jì)分析得到不同植物提取物對(duì)病原菌的抑制中濃度。

1.2.3 反式茴香腦對(duì)蘋(píng)果輪紋病菌的抑制中濃度

反式茴香腦為八角茴香提取物中的主要有效成分,利用二倍稀釋法將反式茴香腦配制成成1、0.5、0.25、0.125、0.063 g·L-1共5個(gè)濃度并制作加藥培養(yǎng)基,測(cè)定各濃度對(duì)應(yīng)的抑菌率,統(tǒng)計(jì)分析得到反式茴香腦對(duì)蘋(píng)果輪紋病菌的抑制中濃度。

1.2.4 反式茴香腦對(duì)蘋(píng)果輪紋病菌菌絲體內(nèi)可溶性蛋白含量的影響

采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定[20]菌絲體內(nèi)可溶性蛋白含量。

1.2.5 反式茴香腦對(duì)蘋(píng)果輪紋病菌菌絲體內(nèi)丙酮酸含量的影響

采用紫外分光光度法測(cè)定[21]菌絲體內(nèi)丙酮酸含量。

1.2.6 反式茴香腦對(duì)蘋(píng)果輪紋病菌菌絲體內(nèi)還原糖含量的影響

采用DNS法測(cè)定[22]菌絲體內(nèi)還原糖含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 17種植物提取物對(duì)蘋(píng)果輪紋病菌的抑制作用

通過(guò)對(duì)比分析,濃度為2 g·L-1時(shí),八角茴香、博落回2種植物提取物對(duì)蘋(píng)果輪紋病菌菌絲抑制率最好,96 h均無(wú)菌絲生長(zhǎng),達(dá)到了100%(圖1)。17種植物提取物對(duì)蘋(píng)果輪紋病菌菌絲生長(zhǎng)的抑制作用見(jiàn)表2。

A：空白對(duì)照；B：八角茴香提取物；C:博落回提取物A:CK; B:Illicium verum extract; C：Macleaya cordata extrat圖1 八角茴香與博落回提取物對(duì)蘋(píng)果輪紋病菌菌絲生長(zhǎng)抑制圖Fig.1 Inhibition of the growth of apple ringworm mycelium by Illicium verum and Macleaya cordata

2.2 八角茴香與博落回2種植物提取物對(duì)蘋(píng)果輪紋病原菌的抑制中濃度

運(yùn)用DPS軟件對(duì)96 h的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,分別求出八角茴香、博落回2種植物提取物在處理蘋(píng)果輪紋病菌后的毒力回歸方程和抑制中濃度(EC50)(表3)。

由表3可知,在96 h下八角茴香與博落回提取物對(duì)蘋(píng)果輪紋病病原菌的EC50分別為0.297 6、0.265 0 g·L-1,兩者相比,八角茴香提取物的抑菌效果更好。

表2 17種植物提取物對(duì)蘋(píng)果輪紋病菌菌絲的抑制作用Table 2 Inhibition of 17 plant extracts on the hyphae of Botryosphaeria

表3 八角茴香和博落回提取物在96 h對(duì)蘋(píng)果輪紋病菌的毒力作用Table 3 The toxicity of extract from I.verum and M.cordata against Botryosphaeria at 96 h

2.3 反式茴香腦對(duì)蘋(píng)果輪紋病原菌的抑制中濃度

運(yùn)用DPS軟件對(duì)48 h、72 h、96 h后的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,分別求出反式茴香腦作用蘋(píng)果輪紋病菌后的毒力回歸方程和抑制中濃度(EC50)(表4)。由表可知,反式茴香腦對(duì)蘋(píng)果輪紋病菌的抑菌作用與時(shí)間呈反比,時(shí)間越長(zhǎng)抑菌作用逐漸減弱。

表4 反式茴香腦在不同時(shí)間對(duì)蘋(píng)果輪紋病菌的毒力作用Table 4 The toxicity of extract from trans-Anethole against Botryosphaeria at different times

2.4 反式茴香腦對(duì)蘋(píng)果輪紋病菌菌絲體內(nèi)可溶性蛋白含量的影響

經(jīng)反式茴香腦處理3 d后蘋(píng)果輪紋病菌絲體內(nèi)可溶性蛋白含量見(jiàn)表5。從表中可知,經(jīng)反式茴香腦處理后菌絲體內(nèi)的可溶性蛋白含量隨著濃度的升高而降低。當(dāng)反式茴香腦濃度為1 g·L-1時(shí)菌絲體內(nèi)的可溶性蛋白含量最低,與CK相比在5%水平下存在顯著性差異。當(dāng)反式茴香腦濃度為0.063 g·L-1時(shí)菌絲體內(nèi)的可溶性蛋白含量與CK相比幾乎沒(méi)有變化,在5%水平下無(wú)顯著性差異。

表5 不同濃度處理下菌絲體內(nèi)可溶性蛋白的含量

2.5 反式茴香腦對(duì)蘋(píng)果輪紋病菌菌絲體內(nèi)丙酮酸含量的影響

經(jīng)反式茴香腦處理3 d后蘋(píng)果輪紋病菌絲體內(nèi)丙酮酸含量見(jiàn)表6。從表中可知,蘋(píng)果輪紋病菌絲體經(jīng)反式茴香腦處理后菌絲體內(nèi)的丙酮酸含量隨著其濃度的增大呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)。當(dāng)反式茴香腦濃度為1 g·L-1與CK之間菌絲體內(nèi)丙酮酸含量在5%水平下存在顯著性差異。

2.6 反式茴香腦對(duì)蘋(píng)果輪紋病菌菌絲體內(nèi)還原糖含量的影響

經(jīng)反式茴香腦處理3 d后供試菌菌絲體內(nèi)還原糖含量見(jiàn)表7。從表中可知,經(jīng)反式茴香腦處理的菌絲體內(nèi)的還原糖都有減少,且反式茴香腦的濃度與還原糖的含量成反比。當(dāng)濃度為0.5 g·L-1、1.0 g·L-1與CK之間菌絲體還原糖含量在5%水平下存在顯著性差異,反式茴香腦濃度為0.063 g·L-1與CK之間菌體內(nèi)還原糖含量上無(wú)顯著性差異。

表7 不同濃度處理下菌絲體內(nèi)還原糖的含量

3 討論與結(jié)論

目前,已有學(xué)者研究了植物源殺菌劑對(duì)蘋(píng)果輪紋病菌的抑制作用。如程永芳[23]、趙剛[24]、劉保友[25]等研究了對(duì)蘋(píng)果輪紋病菌抑制效果明顯的植物提取物,分別為5 g·L-1的黎蘆乙醇提取物、50 g·L-1韭菜提取液和0.002 g·L-1丁子香酚,其抑制率為74.3%、100%、90%。本研究測(cè)定了17種植物提取物對(duì)蘋(píng)果輪紋病菌的抑菌活性,結(jié)果表明處理濃度2 g·L-1,處理時(shí)間96 h時(shí),八角茴香與博落回提取物對(duì)蘋(píng)果輪紋病菌的抑制率均達(dá)到100%。分別對(duì)其進(jìn)行毒力測(cè)定,八角茴香提取物對(duì)蘋(píng)果輪紋病菌的抑菌作用更強(qiáng),其EC50為0.265 0 g·L-1。

八角茴香揮發(fā)精油是從八角枝、葉、果實(shí)通過(guò)蒸餾法或萃取法進(jìn)行提取的一種芳香精油,其常溫呈無(wú)色至淡黃色液體,而低溫時(shí)凝結(jié)為白色的晶體,氣芳香,味辛甜[26]。郭勇[27]、李祖光[28]、陽(yáng)小勇[29]等采用不同的提取方法均得到八角茴香揮發(fā)精油中的主要成分為反式茴香腦。本研究進(jìn)一步對(duì)反式茴香腦對(duì)蘋(píng)果輪紋病菌的抑菌作用進(jìn)行了研究,結(jié)果表明該物質(zhì)對(duì)病原菌的EC50為0.160 0 g·L-1,抑菌效果強(qiáng)于八角茴香提取物,結(jié)合前期試驗(yàn)結(jié)果表明該物質(zhì)確實(shí)是八角茴香提取物中抑制蘋(píng)果輪紋病菌的有效成分。

真菌的細(xì)胞膜與細(xì)胞壁是殺菌劑的重要靶位,植物源抑菌物質(zhì)會(huì)破壞真菌細(xì)胞的細(xì)胞壁,增大細(xì)胞膜的通透性,從而導(dǎo)致細(xì)胞中的內(nèi)含物外滲,病原菌的生長(zhǎng)受到抑制[30]。曾志紅等[31]發(fā)現(xiàn)枝孢霉菌菌絲細(xì)胞膜是丁香提取物重要的作用靶位?？扇苄缘鞍?、還原糖、丙酮酸等是反映病菌菌絲體細(xì)胞壁和細(xì)胞膜受到外界刺激后生理變化的重要指標(biāo)。可溶性蛋白是菌體細(xì)胞的重要滲透調(diào)節(jié)物質(zhì),是細(xì)胞生物膜的保護(hù)物質(zhì),可以提高細(xì)胞的保水能力。還原糖是菌體細(xì)胞內(nèi)的主要能量物質(zhì),是構(gòu)筑菌體結(jié)構(gòu)的物質(zhì)前體。丙酮酸是糖代謝途徑的中間產(chǎn)物之一,在糖、脂肪、蛋白質(zhì)這3大營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的代謝過(guò)程中起著中心作用。

本研究通過(guò)分光光度法研究反式茴香腦對(duì)蘋(píng)果輪紋病菌的病菌菌體內(nèi)可溶性蛋白、丙酮酸、還原糖的含量的影響,結(jié)果表明病原菌菌體內(nèi)可溶性蛋白、丙酮酸、還原糖的含量隨著反式茴香腦濃度的增大而有不同程度的降低。菌絲體內(nèi)可溶性蛋白含量減少表現(xiàn)在兩方面,其一可能是是反式茴香腦抑制供試菌體內(nèi)蛋白質(zhì)的合成,其二可能是反式茴香腦作用于菌體細(xì)胞膜導(dǎo)致菌體內(nèi)可溶性蛋白外滲。還原糖含量減少,可能是反式茴香腦影響菌體的糖代謝途徑使得還原糖合成受阻,同時(shí)導(dǎo)致丙酮酸合成受阻,丙酮酸含量減少；或是膜結(jié)構(gòu)的變化導(dǎo)致還原糖外滲,導(dǎo)致最終菌體應(yīng)能量供應(yīng)不足而死亡。這些均表明反式茴香腦能通過(guò)干擾菌絲體的物質(zhì)代謝從而阻止其正常的發(fā)育。

綜上所述,反式茴香腦增大蘋(píng)果輪紋病菌菌體細(xì)胞膜的滲透性,導(dǎo)致菌體內(nèi)可溶性蛋白及還原糖外滲,或是抑制其菌體內(nèi)物質(zhì)的合成代謝,關(guān)于反式茴香腦對(duì)蘋(píng)果輪紋病菌的具體作用靶點(diǎn)、代謝途徑及信號(hào)通路等可采用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序進(jìn)一步研究。