黃芩中FNSII-1與CHS-2真核表達載體的構(gòu)建

咸珅，王德富，裴燕妮，牛顏冰*

(1.山西農(nóng)業(yè)大學 動物科技學院，山西 太谷 030801；2.山西農(nóng)業(yè)大學 生命科學學院，山西 太谷 030801)

黃芩(ScutellariabaicalensisGeorgi)為唇形科(Labiatae)黃芩屬多年生草本植物，具有清熱燥濕、瀉火解毒、安胎、止血等功效[1]，是我國的傳統(tǒng)中藥材[2]。黃酮類化合物是黃芩中主要活性成分，其含量積累對疾病治療療效起著重要作用，主要包括黃芩苷(baicalin)、黃芩素(baicalein)等化合物[3,4]。近年來，對黃芩黃酮類化合物的研究不斷深入，研究表明黃芩苷及黃芩素有抗菌、抗病毒、抗腫瘤、抗感染、抗HIV、抗氧化、清除氧自由基以及治療心血管疾病等作用[5]。隨著黃芩的藥效價值被日益重視，臨床上對黃芩藥材的需求量也在逐年上升，導致其野生資源遭到嚴重破壞。目前，國內(nèi)外對黃芩活性成分的研究則多集中于制備工藝、測定方法、生化特性及藥理作用等[6～8]，而對其生物合成的分子機理與代謝調(diào)控研究相對較少，通過傳統(tǒng)的細胞工程技術(shù)，雖在一定程度上促進了黃芩苷的合成和積累，但其含量增幅尚不穩(wěn)定[9]。研究表明黃芩活性成分的合成主要分為地上地下2種途徑，通過對黃芩的根、莖、葉和花進行轉(zhuǎn)錄組測序和分析，從黃芩轉(zhuǎn)錄組中發(fā)現(xiàn)了5個與黃芩苷生物合成相關(guān)的關(guān)鍵酶候選基因，分別為PAL、C4H、4CL、CHS和FNS。研究明確了黃芩葉中黃酮生物合成途徑的相關(guān)酶主要有苯丙氨酸解氨酶(PAL)、肉桂酸-4-羥化酶(C4H)和4-香豆酸輔酶A連接酶(4CL)。3個丙二酰CoA和1個香豆酰CoA在查爾酮合成酶(CHS)的作用下生成查耳酮，接著查耳酮異構(gòu)酶催化查耳酮形成黃烷酮或二氫黃酮，進而在黃酮合成酶I(FNSII-1)的催化下形成黃芩苷；黃芩根部黃酮生物合成途徑主要由肉桂酸CoA經(jīng)查爾酮合成酶II(CHS-2)合成并異構(gòu)化，再由黃酮合成酶II(FNSII-2)生成黃芩素[10]。

本研究通過篩選葉中關(guān)鍵酶基因黃酮合成酶I(FNSII-1)與根中關(guān)鍵酶基因查爾酮合成酶II(CHS-2)為目的基因，通過Gateway重組技術(shù)將目的基因FNSII-1和CHS-2整合到目的載體pYES-dest52中，從而獲得酵母表達載體pYES-dest52-FNSII-1、pYES-dest52-CHS-2的重組質(zhì)粒[11]。進而將已構(gòu)建的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入酵母菌株中進行真核表達[12]，從而獲得高效表達工程菌，旨在為進一步的大規(guī)模生物轉(zhuǎn)化試驗提供足夠底物，并為探索黃芩活性物質(zhì)體外大規(guī)模合成途徑的研究奠定基礎(chǔ)[13]。

1 材料和方法

1.1 材料

黃芩植物材料采自山西農(nóng)業(yè)大學生命科學學院實驗基地，于-80 ℃低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

本試驗所用主要試劑及菌種：Transzol Up Plus RNA Kiit、Fastfu DNA Polymerase購自TransGen Biotech公司；Gateway Cloning Enzymes購自美國Thermo Fisher Scientific公司；Gel Extraction Kit、Plasmid Mini Kit購自O(shè)mega Bio-tek公司；酵母蛋白提取試劑盒購自華越洋生物科技有限公司；農(nóng)桿菌菌株A4 由本試驗室保存；釀酒酵母菌株INVSc1購自唯地生物技術(shù)有限公司；大腸桿菌DB3.1、DH5α感受態(tài)購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；pYES-dest52質(zhì)粒、pDONR221質(zhì)粒由山西農(nóng)業(yè)大學王文斌老師惠贈。

1.2 黃芩總RNA的提取

分別提取黃芩葉與根中的總RNA，具體步驟按照RNA提取試劑盒說明書進行。經(jīng)NanoDrop核酸定量檢測儀檢測其純度，瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性后，-80 ℃保存。

1.3 RT-PCR擴增及克隆

以提取的總RNA為模板，利用引物Oligo(dT)18將總RNA反轉(zhuǎn)錄為成第一鏈cDNA；參照NCBI收錄的FNSII-1基因組序列(登錄號：KT963453)、CHS-2基因組序列(登錄號： KT963461)，利用Primmer 5設(shè)計特異性引物，并在引物前后加上Gateway重組位點，分別對黃芩葉中FNSII-1序列和根中CHS-2基因組序列進行PCR擴增(表1)。本試驗PCR使用高保真酶Fastfu DNA Polymerase(TransGen)，反應(yīng)體系具體如下：95 ℃ 2 min；94 ℃ 20 s，X ℃ 20 s，72 ℃ 2 min，35 cycles；72 ℃ 5 min；4 ℃ 保存。

表1 兩個關(guān)鍵基因的PCR引物序列Table 1 two key genes sequence primers used for PCR

PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測鑒定大小后，采用OMEGA公司的Gel Extraction Kit回收，將PCR產(chǎn)物與pEASY-blunt Vector(TransGen)連接并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α(TransGen)中，通過菌液PCR挑選3個陽性克隆送至武漢金開瑞公司測序。利用在線軟件NCBI將測序結(jié)果進行BLAST比對，去除多余的載體序列，保存獲得黃芩中FNSII-1、CHS-2基因組序列。

1.4 FNSII-1、CHS-2真核表達載體的構(gòu)建

本試驗采用Gateway重組技術(shù)構(gòu)建真核表達載體，將FNSII-1、CHS-2整合至目的載體pYES-dest52中，具體包括BP反應(yīng)和LR反應(yīng)[14]。利用BP反應(yīng)將FNSII-1、CHS-2與載體pDONR221連接，獲得入門載體pDONR221-FNSII-1、pDONR221-CHS-2。然后與表達載體pYES-dest52進行LR反應(yīng)，產(chǎn)生重組表達質(zhì)粒pYES-dest52-FNSII-1、pYES-dest52-CHS-2，具體操作為：于室溫添加LR克隆反應(yīng)體系：入門克隆產(chǎn)物100 ng，目的載體150 ng，加ddH2O至終體積8 μL于離心管；每管加2 μL的LR Clonase Ⅱ，輕輕混勻后于25 ℃孵育12 h；加1 μL Proteinase K于37 ℃孵育10 min。將測序正確的重組表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至釀酒酵母INVSc1感受態(tài)細胞后均勻涂布于尿嘧啶缺陷的合成完全培養(yǎng)基SD-Ura固體培養(yǎng)基上，置于29 ℃培養(yǎng)箱中36～48 h，直至長出酵母單菌落。

1.5 重組載體的真核表達

挑取酵母單菌落作為模板，通過特異性引物進行菌液PCR，并將PCR篩選出的有目的片段的菌液送至武漢金凱瑞測序公司進行測序，通過SnapGene軟件將測序結(jié)果與FNSII-1基因序列(登錄號：KT963453)、CHS-2基因序列(登錄號：KT963461)進行比對，從而篩選出釀酒酵母INVSc1陽性轉(zhuǎn)化菌株。挑取陽性轉(zhuǎn)化酵母菌株接種于50 mL含有2%葡萄糖和2%半乳糖的SD-Ura液體培養(yǎng)基中，29 ℃振蕩培養(yǎng)，挑選出5個OD600值分別為0.5、0.8、1.0、1.2、1.5的酵母菌液進行蛋白表達。使用酵母提取試劑盒提取酵母蛋白，具體步驟參照說明書，并進行SDS-PAGE凝膠檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 FNSII-1和CHS-2的體外擴增

以黃芩葉片和根組織所提RNA為模板，分別利用含Gateway重組位點的FNSII-1、CHS-2特異性引物進行克隆，獲得與預(yù)期結(jié)果大小基本相符的目的片段，分別為1 491 bp和1 205 bp(圖1)；通過NCBI將所獲序列進行Blast比對，結(jié)果顯示所獲FNSII-1、CHS-2序列與已上傳的相應(yīng)關(guān)鍵基因相似性高達99%。

A：FNSII-1電泳圖； B：CHS-2電泳圖。M：DL 2000TM DNA marker；1-3為目的條帶；CK為空白對照A: Electrophoresis of FNSII-1 products; B: Electrophoresis of CHS-2 products. M: DL 2000TM DNA marker; Lane 1-3: target gene; CK: Blank control圖1 兩個關(guān)鍵基因擴增結(jié)果Fig.1 Amplification results of two key genes

2.2 pYES-dest52-FNSII-1和pYES-dest52-CHS-2重組載體的構(gòu)建

利用Gateway重組技術(shù)，經(jīng)BP、LR反應(yīng)后，將目的基因FNSII-1和CHS-2分別連接到目的載體pYES-dest52上，獲得重組載體pYES-dest52-FNSII-1和pYES-dest52-CHS-2。將重組表達載體轉(zhuǎn)化至釀酒酵母INVSc1感受態(tài)細胞后，經(jīng)測序獲得目的序列，測序結(jié)果經(jīng)Blast比對發(fā)現(xiàn)，2個基因與各自相應(yīng)基因的相似性達到94.18%和91.77%。使用SnapGene軟件將測序結(jié)果分別與NCBI已上傳的FNSII-1基因序列(登錄號：KT963453)、CHS-2基因序列(登錄號：KT963461)進行對比，載體上兩個關(guān)鍵基因的編碼序列與預(yù)期一致，pYES-dest52-FNSII-1和pYES-dest52-CHS-2重組載體的構(gòu)建成功(圖2)。

2.3 FNSII-1和CHS-2的真核表達

將篩選出的陽性酵母菌株振蕩培養(yǎng)誘導表達蛋白，收集OD600值分別為0.5、0.8、1.0、1.2、1.5的菌液，進行SDS-PAGE檢測。2個關(guān)鍵蛋白在不同OD值下均有表達，其中FNSII-1的蛋白大小為57.36 kDa,，CHS-2的蛋白大小為42.9 kDa，與預(yù)期值相符，黃芩中FNSII-1與CHS-2真核表達載體的構(gòu)建成功(圖3)。

3 討論與結(jié)論

黃芩為《中華人民共和國藥典》(2015版)收錄的正品，隨著中藥現(xiàn)代化的快速發(fā)展，黃芩中藥用活性成分日漸受到重視，臨床上對黃芩藥材的需求量逐年上升導致其野生資源遭到嚴重破壞，黃芩已被列為國家三級瀕危保護物種[15]。目前，國內(nèi)外對黃芩黃酮類物質(zhì)的研究多集中于提取和測定等方面，有關(guān)其合成的分子機制研究較少。已有相關(guān)文獻指出黃芩活性成分的合成通路分為葉和根兩部分，其中葉通路中黃酮合酶FNSII-1可催化二氫黃酮形成5,7-二羥黃酮，該化合物是黃芩中合成黃芩素及黃芩苷的重要前體，其含量直接影響黃芩中有效成分黃芩苷的儲量。根通路中的查耳酮合成酶CHS-2能催化香豆酰CoA和丙二酸單酰CoA縮合產(chǎn)生查耳酮，該酶是在黃酮類化合物合成中起到限速作用的關(guān)鍵酶，也是高等植物中黃酮類化合物合成途徑中的首個關(guān)鍵酶[16]。酵母表達系統(tǒng)作為真核表達系統(tǒng)，卻具備像原核生物一樣快速繁殖、易于培養(yǎng)的特點，所以在動物、植物、微生物的轉(zhuǎn)基因功能鑒定研究中被廣泛應(yīng)用。而Gateway技術(shù)能夠克隆一個或多個基因進入到任何蛋白表達系統(tǒng)，這項強大的體外技術(shù)大大地簡化了基因克隆和亞克隆的步驟，而且典型的克隆效率高達95%具有簡單高效的優(yōu)點。

FNSII-1為pYES-dest52-FNSII-1重組載體中FNSII-1與KT963453比對結(jié)果；CHS-2為pYES-dest52-CHS-2重組載體中CHS-2與KT963461比對結(jié)果FNSII-1 is the result of the alignment of KT963453 and FNSII-1 in the pYES-dest52-FNSII-1 recombinant vector; CHS-2 is the result of the comparison of KT963461 and CHS-2 in the pYES-dest52-CHS-2 recombinant vector圖2 重組載體中目的基因序列比對Fig.2 Sequence alignment of target genes in recombinant vector

圖中的M為彩虹蛋白marker；1、2、3、4、5代表不同的OD600值，分別為0.5、0.8、1.0、1.2、1.5；CK為空白對照M in the figure is marker of rainbow protein; 1, 2, 3, 4 and 5 represent different OD600 value is 0.5, 0.8, 1.0, 1.2 and 1.5, respectively； CK is a blank control圖3 2個關(guān)鍵酶基因的蛋白電泳圖Fig.3 Protein electrophoresis of 2 key enzyme genes

本研究通過提取道地產(chǎn)區(qū)黃芩葉與根組織中總RNA，經(jīng)RT-PCR獲得目的基因FNSII-1和CHS-2，其序列長度分別為1 491 bp和1 205 bp；利用Gateway重組技術(shù)成功構(gòu)建pYES-dest52-FNSII-1和pYES-dest52-CHS-2酵母表達載體。經(jīng)SDS-PAGE檢測表明2個表達載體在酵母菌液OD600值分別為0.5、0.8、1.0、1.2、1.5時均能獲得目的大小蛋白且穩(wěn)定表達，由于酵母在OD600值為0.8～1.0時活力最強，且隨著OD值升高會伴隨著菌絲出現(xiàn)，因此篩選出OD值為0.8～1.0時使酵母表達載體最適表達條件。本研究構(gòu)建FNSII-1和CHS-2蛋白的酵母表達體系，通過分子手段對黃芩活性物質(zhì)進行體外表達，從而為研究黃芩活性物質(zhì)體外合成奠定基礎(chǔ)。