基于空心微針陣列的連續(xù)監(jiān)測葡萄糖傳感器

劉 尚，岳瑞峰

(清華大學 微電子學研究所，北京100084)

0 引 言

近年來能夠?qū)崟r連續(xù)檢測血糖濃度的植入式傳感器，特別是可以做到微痛或無痛的傳感器已經(jīng)成為研發(fā)的熱點，如Ahyeon Koh 等人設(shè)計的超微孔聚氨酯涂覆的針形植入式葡萄糖傳感器［1］，RA Croce Jr 等人設(shè)計的繞線型經(jīng)皮測試系統(tǒng)［2］。相對于體外檢測，植入式葡萄糖傳感器無疑將面臨更多挑戰(zhàn)［3，4］，例如:連續(xù)檢測的檢測液通常是成分不斷變化的血液或組織液，且其中的抗壞血酸等多種電活性成分都會對檢測結(jié)果造成很大的干擾，為此，要求傳感器的響應(yīng)時間快、抗干擾能力強、植入及使用時無痛或微痛。

針型葡萄糖傳感器因為其易于制造和適合植入的特性而受到廣泛關(guān)注［5］?，F(xiàn)有的針形葡萄糖傳感器多采用雙電極結(jié)構(gòu)，為應(yīng)對復雜多變的體內(nèi)環(huán)境，增強傳感器抗干擾能力，通常需要進行多層膜修飾，無疑增加了傳感器的制作難度和復雜程度，同時也降低了傳感器的響應(yīng)值和靈敏度;對參比電極有較強的依賴性，而且傳感器制作多采用電極集成的方式，將多電極整合到單根針上，這使得傳感器難以實現(xiàn)小型化，在植入和使用時給患者帶來很大痛苦［1，2，6］。為避免植入過程中傳感器工作區(qū)域與皮膚組織直接接觸帶來的應(yīng)力與摩擦對膜層造成的破壞和損傷，也需要專門的植入裝置［7，8］，患者難以自行佩戴，存在很大的不便利性。植入后的傳感器工作區(qū)域與創(chuàng)口組織直接接觸，容易造成細胞粘附和炎癥發(fā)應(yīng)［9］，不利于血液或組織液與工作區(qū)域的大面積接觸，導致植入后傳感器響應(yīng)值和靈敏度的降低。

本文提出的葡萄糖傳感器采用了3 根微針組成的三電極結(jié)構(gòu)，其利用工作電極和輔助電極的差分來消除工作時的共模干擾以提高抗干擾性能，同時降低了傳感器背景電流和參比電極電位變化對測試的影響，而且響應(yīng)時間較快。

1 傳感器工作原理與設(shè)計

1.1 傳感器工作原理

如圖1 所示，基于葡萄糖氧化酶(glucose oxidase，GOD)對葡萄糖的如下酶促反應(yīng)

圖1 酶電極工作原理圖Fig 1 Working principle diagram of enzyme electrode

葡萄糖的濃度和生成的H2O2的量之間的當量關(guān)系，在一定電位下，金屬Pt 對H2O2具有催化分解作用

電荷轉(zhuǎn)移至酶電極產(chǎn)生電流信號，電流大小與H2O2濃度呈正比，故與葡萄糖濃度也存在當量關(guān)系，可通過檢測產(chǎn)生電流的大小來反映被檢測葡萄糖的濃度。

1.2 結(jié)構(gòu)設(shè)計

設(shè)計的傳感器采用由3 根微針組成的三電極結(jié)構(gòu)，分別用作工作電極(working electrode，WE)、輔助電極(counter electrode，CE)和參比電極(reference electrode，RE)。其中，工作電極和輔助電極均采用針尖通孔處的內(nèi)外表面淀積了Ti/Pt 薄膜的空心不銹鋼微針，參比電極采用直徑為200μm的Ag/AgCl 實心微針來測量其它電極的電位。將酶固定在空心微針楔形針尖上的通孔里，這樣在刺入人體過程中既能夠確保其不會脫落，又可使微針內(nèi)的空心管道與大氣相通以提供充足的氧。輔助電極與工作電極的結(jié)構(gòu)相同，區(qū)別僅在于輔助電極上固定的酶失去了活性。使用時對它們加以相同的電位，理論上干擾物質(zhì)將會產(chǎn)生同樣的響應(yīng)，通過差分的形式就可以非常方便地去除這些電活性物質(zhì)的干擾，得到很高的抗干擾性能，同時降低傳感器背景電流和參比電極電位變化對測試的影響，而且不會對響應(yīng)時間帶來明顯影響。

2 制 作

2.1 濺射與電極的預(yù)處理

將去油、潔凈后的空心不銹鋼微針(外、內(nèi)徑分別為300，100 μm)的底端固定、針尖一端垂直向上，在其表面采用直流濺射淀積了一層厚度約為20 nm/120 nm 的Ti/Pt 薄膜用作電極。將電極超聲清洗后，在電極前端(＞2 mm)的外表面(包括針尖楔形表面，注意保持通孔暢通)均勻涂覆一層盡可能薄的單組分醫(yī)用環(huán)氧樹脂溶液并加熱至120 ℃固化，隨后將電極浸入磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)中加一定電壓進行循環(huán)掃描，使電極中電活性雜質(zhì)溶出，直至響應(yīng)電流穩(wěn)定時為止。

2.2 葡萄糖氧化酶的固定

采用比較成熟的戊二醛—牛血清白蛋白交聯(lián)法進行葡萄糖氧化酶的固定。配比如下:取GOD(Heowns，250U/mg)2 mg，加PBS(0.01 mol/L，pH=7.4，北京鼎國)90 μL，酶含量為5.56 U/μL;取牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)(Sigma)7 mg，加PBS 70 μL;取2%的戊二醛(25%，汕頭西隴)，將GOD，BSA，戊二醛溶液按體積比5︰5︰1 的比例混合、搖勻。將預(yù)處理后的微針電極針尖楔形處浸入混合液3 ～5 s，重復3 次后，置于潔凈的培養(yǎng)皿中，室溫靜置2h晾干后用去離子水清洗殘余未固定的酶再晾干，一批置于4 ℃冷藏備用，一批置于室溫下潔凈的培養(yǎng)皿中。

2.3 Ag/AgCl 參比電極的制備

取直徑為200 μm 的實心Ag 線，打磨后清潔表面。將Ag 線分為2 段，一段作陽極，一段作陰極，浸入濃度0.1 mol/L的鹽酸溶液中。在兩極間加5 V 電壓，避光電解10 min 后將陽極的Ag 線取出清洗，即可制備出致密均勻的白色Ag/AgCl 微針電極，并置于飽和KCl 溶液中避光保存。

2.4 傳感器的組裝

取室溫下(約25 ℃)已存放15 天的固定酶后的微針電極進行葡萄糖滴加測試，電極對葡萄糖無特異反應(yīng)，說明固定的酶已失活。取冷藏的微針電極用作工作電極，常溫存放酶已失活的微針電極用作輔助電極，與Ag/AgCl 參比電極按照正三角形排布(邊長2 mm)并用快固型雙組分環(huán)氧樹脂固定，露出電極高度2 mm。靜置2 h 待環(huán)氧樹脂完全固化后，用導電膠在微針后端將引線引出以備測試，并確保微針后端的通孔與大氣暢通。

3 測試與分析

3.1 循環(huán)伏安掃描

為了確定電極工作的最佳電位，先將電極陣列浸入1 mmol·L－1的葡萄糖溶液，在工作電極和參比電極間加掃描范圍為0.4 ～0.9 V、變化速度為100 mV/s 的三角波進行循環(huán)伏安掃描，所得氧化還原曲線如圖2 所示。從圖中可知，氧化還原峰出現(xiàn)在0.7 V，所以，傳感器工作電位取值為0.7 V。

3.2 臺階測試

圖2 循環(huán)伏安曲線Fig 2 Cyclic voltammetric curve

測試采用電流時間曲線法在37 ℃下進行，對工作電極和輔助電極均施加0.7 V 工作電壓(WE vs RE;CE vs RE)。將電極浸入6mL PBS 溶液中，待響應(yīng)穩(wěn)定后開始計時，每隔一定時間滴加一定量的濃度為30 mmol·L－1的葡萄糖溶液，被測試溶液每次濃度變化1 mmol·L－1，并記錄輸出的變化情況。電流時間曲線如圖3 所示，傳感器至第21 次滴加時均響應(yīng)良好，階差明顯，此后繼續(xù)滴加溶液，傳感器響應(yīng)趨于飽和，整體符合Michaelis－Menten 的酶傳感器特征，傳感器線性范圍應(yīng)在20 mmol·L－1左右。

圖3 滴加響應(yīng)曲線Fig 3 Dropwise response curve

3.3 線性范圍與靈敏度測試

先將電極浸入PBS 中，等系統(tǒng)響應(yīng)穩(wěn)定后，對不同濃度的葡萄糖溶液進行測試，結(jié)果如圖4 所示。采用線性擬合的方法對響應(yīng)值進行處理，所得擬合曲線方程為Y=0.118+0.575 X，(R2=0.998)。從而得到葡萄糖傳感器的零位為0.118 μA，靈敏度(S)達到0.575 μA/(mmol·L－1)，線性范圍在21 mmol·L－1以上，傳感器檢出限(LOD)為6.58 μmol·L－1(LOD=3 σ/S，σ 取11 次測量PBS 基液響應(yīng)的標準偏差)，米氏常數(shù)KM=11.856 mmol·L－1。

圖4 不同濃度葡萄糖溶液響應(yīng)Fig 4 Response of glucose solution with different concentration

3.4 響應(yīng)時間測試

待傳感器的響應(yīng)在低濃度溶液里穩(wěn)定一段時間后，迅速將傳感器移至較高濃度的溶液中，此過程中一直保持電流表對響應(yīng)電流的持續(xù)測量。所得響應(yīng)曲線如圖5 所示，從移動傳感器浸入高濃度溶液即圖中出現(xiàn)上升階躍開始，到在高濃度溶液中響應(yīng)值基本穩(wěn)定為止，所經(jīng)歷時間約為16 s，即響應(yīng)時間約為16 s。

圖5 響應(yīng)時間曲線Fig 5 Response time curve

3.5 抗干擾性測試

基于H2O2電極的葡萄糖傳感器最大的挑戰(zhàn)在于消除生理條件下人體電活性物質(zhì)帶來的干擾［4］。在0.7 V 的工作電位下，人體內(nèi)的電活性物質(zhì)如抗壞血酸、尿酸等均會在Pt 電極催化作用下發(fā)生氧化分解，人常用的退燒藥必理通(主要成分對乙酰氨基酚)也同樣會發(fā)生氧化分解，產(chǎn)生響應(yīng)電流。測試選用抗壞血酸和必理通兩種藥品，所用濃度抗壞血酸取為0.15 mmol·L－1，對乙酰氨基酚0.2 mmol·L－1(均略高于生理水平)，測試底液葡萄糖濃度5.6 mmol·L－1，所得響應(yīng)曲線如圖6 所示。從測試結(jié)果可以看出，除滴加溶液時造成的機械干擾，整體響應(yīng)無明顯變化。

圖6 干擾物對三電極工作體系的影響Fig 6 Effect of chaff interferent on working system of three-electrode

對雙電極系統(tǒng)進行同樣測試，所得響應(yīng)曲線如圖7 所示。滴加對乙酰氨基酚溶液和抗壞血酸溶液對雙電極系統(tǒng)的傳感器性能均有明顯影響，產(chǎn)生的穩(wěn)態(tài)干擾電流分別為0.439 μA 和0.362 μA。

圖7 干擾物對雙電極工作體系的影響Fig 7 Effect of chaff interferent on working system of double electrode

對比三電極工作體系和雙電極工作體系測試結(jié)果可發(fā)現(xiàn)，二者對5.6 mmol·L－1的葡萄糖溶液產(chǎn)生的穩(wěn)態(tài)電流變化均在3.25 μA 左右，所加干擾物質(zhì)對三電極體系無明顯影響?？梢娙姌O工作體系具有很強的抗干擾能力，而且不會降低傳感器對檢測物的有效響應(yīng)。

3.6 回收率測試

回收率主要考察傳感器的準確度，通過傳感器對所加標準濃度底物的檢出能力來表征。傳感器回收率測試對同一工藝步驟和條件參數(shù)的7 只傳感器進行，標準曲線取為線性范圍和靈敏度測試中的線性區(qū)擬合曲線(按擬合方程Y=0.118+0.575 X)，所得響應(yīng)曲線如圖8 所示，傳感器在線性范圍內(nèi)(＜21 mmol·L－1)具有較好的一致性，隨著濃度增加響應(yīng)電流差異性變大。在整個線性工作范圍內(nèi)，傳感器回收率為0.93 ～1.07。

圖8 不同傳感器響應(yīng)曲線Fig 8 Response curve of different sensors

3.7 傳感器存儲和工作穩(wěn)定性

傳感器的存儲和工作穩(wěn)定性通過測試期間傳感器的線性范圍和靈敏度變化來體現(xiàn)。對于存儲穩(wěn)定性測試，為避免干濕交替對傳感器性能的影響，將傳感器存儲于4 ℃的PBS 中。存儲8 天后進行測試，傳感器仍能保持原有線性范圍(＞21 mmol·L－1)，靈敏度無明顯變化(＜1%);存儲15 天時間的傳感器在24 mmol·L－1內(nèi)的響應(yīng)電流仍可達到初始響應(yīng)電流的80%。傳感器工作性能隨時間變化曲線如圖9 所示，非測試時段傳感器存放于37℃下濃度為5.5 mmol·L－1的葡萄糖溶液中(不加電壓)?？梢钥闯?傳感器性能變化明顯，線性范圍和靈敏度分別從初始的21 mmol·L－1，0.575μA/(mmol·L－1)下降到第4 天時的8 mmol·L－1，0.244μA/(mmol·L－1)，這和傳感器未經(jīng)過任何修飾，固定的氧化酶可能部分回溶至溶液和在葡萄糖溶液中存放時生成的H2O2使固定酶變性有關(guān)［10］。

圖9 傳感器性能隨時間變化Fig 9 Sensor performance change with time

4 結(jié) 論

本文采用空心微針制造的葡萄糖傳感器，在不加修飾膜的情況下，線性范圍為0 ～21 mmol·L－1，靈敏度為0.575 μA/(mmol·L－1)，檢出限為6.58 μmol·L－1，響應(yīng)時間為16 s，傳感器回收率在0.93 ～1.07 之間。采用三電極結(jié)構(gòu)，可很好地排除抗壞血酸對傳感器性能的影響。由于微針纖細短小，可望實現(xiàn)植入式微痛快速實時測量血糖值。

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