不同施肥處理對(duì)福建莆田地區(qū)枇杷根際微生物多樣性的影響

付龍威 湯曉娟 林授鍇 王春花 張艷珍 劉云國(guó)

摘要：福建莆田地區(qū)是我國(guó)枇杷的主產(chǎn)地之一。為探討復(fù)合肥對(duì)莆田地區(qū)枇杷根際土壤微生物的影響，利用高通量測(cè)序技術(shù)（IlluminaHiseq）研究4個(gè)采樣點(diǎn)的根際土壤細(xì)菌多樣性與土壤理化性質(zhì)的相關(guān)性。結(jié)果顯示，在12份枇杷根際土壤樣品中共得到35371個(gè)細(xì)菌操作分類單元（OTU），屬于31個(gè)門(mén)，617個(gè)屬;共有12個(gè)優(yōu)勢(shì)門(mén)（豐度>1%），其中豐度>6%的是變形菌門(mén)（Proteobacteria）、酸桿菌門(mén)（Acidobacteria），25個(gè)優(yōu)勢(shì)屬（豐度>1%）。在不同處理的根際土壤中各優(yōu)勢(shì)菌門(mén)、屬所占比例存在明顯差異。土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和主要理化性質(zhì)存在顯著相關(guān)性，其中pH值和全氮、有效磷、總磷含量是影響土壤細(xì)菌豐度的主要因素。

關(guān)鍵詞：枇杷;復(fù)合肥;高通量測(cè)序;根際土壤細(xì)菌多樣性;土壤理化性質(zhì)

中圖分類號(hào)：S147.2;S182文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-1302（2020）22-0261-07

作者簡(jiǎn)介：付龍威（1993—），男，河南周口人，碩士，主要從事應(yīng)用微生物研究。E-mail：445322966@qq.com。

通信作者：劉云國(guó)，博士，教授，主要從事食品微生物學(xué)研究。E-mail：yguoliu@163.com。

枇杷[Eriobotryajaponica（Thunb.）Lindl]是一種原產(chǎn)于我國(guó)的常綠薔薇科果樹(shù)，廣泛分布于亞熱帶地區(qū)。福建省莆田市是我國(guó)枇杷的主產(chǎn)區(qū)之一，該地區(qū)枇杷產(chǎn)量占全國(guó)枇杷總產(chǎn)量的1/3，枇杷栽培歷史悠久，其果肉柔軟多汁，營(yíng)養(yǎng)豐富，酸度適中，風(fēng)味極佳。由于連年大面積單一種植枇杷，土壤連作障礙問(wèn)題日益突出;長(zhǎng)期施用化肥導(dǎo)致了土壤板結(jié)、有效磷含量低[1]、微生物群落改變等一系列問(wèn)題。土壤微生物是影響土壤生態(tài)過(guò)程的一個(gè)重要因素，與土壤養(yǎng)分循環(huán)[2]、有機(jī)質(zhì)分解以及碳、氮等元素的轉(zhuǎn)化緊密關(guān)聯(lián)[3-4]，在維持土壤的質(zhì)量和生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性方面發(fā)揮著重要作用。因而，研究莆田地區(qū)枇杷根際微生物的多樣性十分重要。

近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外在鹽爪爪[5-6]、翅堿蓬[7]、香蕉[8]、森林[9-10]等的根際微生物多樣性方面取得了一定研究進(jìn)展。然而，莆田地區(qū)作為我國(guó)重要的枇杷產(chǎn)區(qū)之一，針對(duì)其枇杷根際微生物的研究鮮有報(bào)道。為研究施用復(fù)合肥對(duì)微生物群落造成的影響，本研究以福建省莆田地區(qū)的枇杷根際土壤為試驗(yàn)對(duì)象，利用高通量測(cè)序技術(shù)（llluminaHiseq）對(duì)根際土壤微生物的菌群結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較分析，以期為進(jìn)一步了解莆田地區(qū)枇杷根際土壤微生物多樣性，探究微生物與土壤性質(zhì)間的關(guān)系，以及解決莆田地區(qū)過(guò)度使用復(fù)合肥的問(wèn)題，開(kāi)發(fā)枇杷專用生物菌肥奠定基礎(chǔ)。研究結(jié)果將服務(wù)于“三農(nóng)”，推進(jìn)精準(zhǔn)農(nóng)業(yè)在枇杷種植方面的實(shí)施。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)長(zhǎng)期種植枇杷的果農(nóng)的經(jīng)驗(yàn)，枇杷樹(shù)不能施用過(guò)多復(fù)合肥，否則會(huì)造成根部腐爛。本研究設(shè)制A、B、C、D4個(gè)采樣點(diǎn)，每年A采樣點(diǎn)每棵樹(shù)共施500g復(fù)合肥和20kg有機(jī)肥，B采樣點(diǎn)每棵樹(shù)共施400g復(fù)合肥和20kg有機(jī)肥，C采樣點(diǎn)每棵樹(shù)共施300g復(fù)合肥和20kg有機(jī)肥，D采樣點(diǎn)每棵樹(shù)共施200g復(fù)合肥和20kg有機(jī)肥，每年每個(gè)采樣點(diǎn)分4次施肥，連續(xù)施肥3年，第4年采樣1次。

1.2土樣采集

于2019年4月在莆田地區(qū)枇杷集中區(qū)根據(jù)不同的化肥施用量選取A、B、C、D4個(gè)采樣點(diǎn)。分別從4個(gè)取樣點(diǎn)選取間隔約10m的3棵編號(hào)依次為1、2、3，樹(shù)齡5年以上的枇杷（共12棵）的根部土壤進(jìn)行5點(diǎn)取樣，每次取樣的土層厚度為0～30cm。每份土樣分為2個(gè)部分，一部分用于測(cè)定土壤理化性狀，另一部分提取DNA用于測(cè)序。

1.3土壤理化性質(zhì)檢測(cè)

土壤pH值用pH計(jì)（土壤∶水=1g∶5mL）測(cè)定;有效鉀（AK）含量用乙酸銨提取，原子吸收分光光度法測(cè)定;有效磷（AP）含量、總磷（TOP）含量用碳酸氫鈉提取，鉬藍(lán)法測(cè)定;總鉀（TOK）含量用氫氟酸提取，原子吸收分光光度法測(cè)定;總氮（TON）含量用凱氏定氮法測(cè)定。

1.4土壤微生物的16SrRNA基因測(cè)序

1.4.1土樣DNA提取

稱取200mg土壤樣品，利用OMEGA土壤總DNA抽提試劑盒（E.Z.N.ATMMag-BindSoilDNAKit）提取土壤總DNA。

1.4.216SrRNA文庫(kù)構(gòu)建

利用Qubit3.0DNA檢測(cè)試劑盒對(duì)提取的基因組DNA進(jìn)行精確定量，以確定聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）加入的DNA量。PCR引物為515F：CCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNGTGCCAGCMGCCGCGGTAA;806R：GACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCAGGACTACHVGGGTWTCTAAT，利用該引物對(duì)16SrRNA基因的V4區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增。PCR結(jié)束后，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物。

利用Qubit3.0DNA檢測(cè)試劑盒對(duì)回收的DNA進(jìn)行精確定量，以便按照1∶1等量混合后測(cè)序。等量混合時(shí)，每個(gè)樣品DNA量取10ng，最后使用IlluminaHiseqTM進(jìn)行測(cè)序。

1.5生物信息學(xué)分析

對(duì)高通量測(cè)序得到原始數(shù)據(jù)進(jìn)行拼接、過(guò)濾得到有效數(shù)據(jù)，然后基于有效數(shù)據(jù)進(jìn)行操作分類單元（OTU）聚類和物種分類分析。采用QIIME（v.2.0-10）軟件進(jìn)行α-多樣性分析，分析指標(biāo)包括Chao1指數(shù)、Shannon指數(shù)、ACE指數(shù)。

1.6數(shù)據(jù)分析

利用Excel2010完成數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化處理及作圖，SPSS22.0軟件完成數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。

2結(jié)果與分析

2.1土壤理化性質(zhì)分析

如表1所示，4個(gè)采樣點(diǎn)的根際土壤都呈弱酸性。A、B采樣地的土壤TON、AP、AK、TOP含量顯著高于C、D采樣地，D采樣地的TOK顯著低于A、B、C采樣地。

2.2樣本的有效序列數(shù)據(jù)量

使用Mothur軟件刪除了短小和質(zhì)量低的序列后，在12個(gè)樣品中獲得614697條高質(zhì)量序列，分配到35371個(gè)OTU（序列同一性為97%），利用R軟件處理得到OTU數(shù)目花瓣圖，從圖1可以看出，樣本間共有的有代表性的OTU有192個(gè)，不同樣本的代表OTU數(shù)量不一，其中，A3樣品的OTU數(shù)目最多，為592個(gè);B1樣品的OTU數(shù)目最少，為85個(gè)。

2.3土壤細(xì)菌群落豐富度和多樣性分析

通過(guò)對(duì)16SrRNA基因的V4區(qū)進(jìn)行測(cè)序，得到各采樣點(diǎn)土壤樣品的細(xì)菌群落多樣性數(shù)據(jù)。如表2所示，4個(gè)采樣點(diǎn)的OTU數(shù)目、ACE指數(shù)、Chao1指數(shù)均無(wú)顯著性差異，A采樣點(diǎn)的Shannon指數(shù)顯著低于B、C、D采樣點(diǎn)。

2.4多樣性指數(shù)與土壤理化因子相關(guān)性

如表3所示，Shannon指數(shù)與土壤pH值呈極顯著正相關(guān)，與TON、AP、TOP含量呈極顯著負(fù)相關(guān);ACE指數(shù)與TOK含量呈顯著負(fù)相關(guān);Chao1指數(shù)與pH值以及TON、AP、AK、TOP、TOK含量的相關(guān)性均不顯著。

2.5土壤微生物物種分類及樣本間差異

4個(gè)采樣點(diǎn)的土壤微生物共屬31個(gè)門(mén)，其中優(yōu)勢(shì)門(mén)（除去未分類和其他，豐度均>1%）共有12個(gè)，如表4所示，A采樣點(diǎn)優(yōu)勢(shì)菌門(mén)為變形菌門(mén)（Proteobacteria）、酸桿菌門(mén)（Acidobacteria）、厚壁菌門(mén)（Firmicutes）、放線菌門(mén)（Actinobacteria）、浮霉菌門(mén)（Planctomycetes）、疣微菌門(mén)（Verrucomicrobia）、擬桿菌門(mén)（Bacteroidetes）、綠彎菌門(mén)（Chloroflexi），占比86.46%。B采樣點(diǎn)優(yōu)勢(shì)菌門(mén)比A采樣點(diǎn)多了芽單胞菌門(mén)（Gemmatimonadetes）、奇古菌門(mén)（Thaumarchaeota），占比之和為86.90%;C采樣點(diǎn)優(yōu)勢(shì)菌門(mén)比A采樣點(diǎn)多了芽單胞菌門(mén)、奇古菌門(mén)、Latescibacteria，占比87.16%，D采樣點(diǎn)優(yōu)勢(shì)菌門(mén)比A點(diǎn)多了芽單胞菌門(mén)、奇古菌門(mén)、Latescibacteria、candidatedivisionWPS-1，占比88.39%。4個(gè)采樣點(diǎn)優(yōu)勢(shì)菌門(mén)平均豐度以變形菌門(mén)（36.45%）和酸桿菌門(mén)（23.46%）較高。A采樣點(diǎn)變形菌門(mén)的豐度顯著高于C、D采樣地，A采樣點(diǎn)的酸桿菌門(mén)、疣微菌門(mén)、擬桿菌、芽單胞菌門(mén)、candidatedivisionWPS-1、Latescibacteria豐度低于B、C、D采樣點(diǎn)。

4個(gè)采樣點(diǎn)共有617個(gè)屬的土壤微生物，其中根際土壤微生物群落優(yōu)勢(shì)菌屬共有25個(gè)（單個(gè)優(yōu)勢(shì)菌屬的豐度均>1%），4個(gè)采樣點(diǎn)共同含有的優(yōu)勢(shì)菌屬有5個(gè)。如表5、表6、表7、表8所示，A采樣點(diǎn)的優(yōu)勢(shì)菌屬有Gp6、Gp2、Gp1、Gp3、Subdivision3generaincertaesedis、Gp4、伯克霍爾德氏菌屬（Burkholderia）、羅思河小桿菌屬（Rhodanobacter）、Massilia、鳥(niǎo)氨酸芽孢桿菌屬（Ornithinibacillus）、芽孢八疊球菌屬（Sporosarcina）、副球菌屬（Rhizomicrobium）、節(jié)桿菌屬（Arthrobacter）和假單胞菌屬（Pseudomonas），占細(xì)菌總類群的28.31%。B采樣點(diǎn)的優(yōu)勢(shì)菌屬有芽孢桿菌屬（Gemmatimonas）、Gp6、Gp2、Spartobacteriageneraincertaesedis、Gp1、Subdivision3generaincertaesedis、Gp4、伯克霍爾德氏菌（Burkholderia）、鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）、假單胞菌屬（Pseudolabrys）和亞硝化球菌屬（Nitrososphaera），占細(xì)菌總類群的31.01%。C采樣點(diǎn)的優(yōu)勢(shì)菌屬有芽孢桿菌屬（Gemmatimonas）、Gp6、Gaiella、Gp2、Spartobacteriageneraincertaesedis、[JP3]Gp1、Subdivision3generaincertaesedis、Gp4、硝化螺菌屬（Nitrospira）、鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）、出芽菌屬（Gemmata）和Latescibacteriageneraincertaesedis，占細(xì)菌總類群的35.32%。D采樣點(diǎn)的優(yōu)勢(shì)菌屬有芽孢桿菌屬（Gemmatimonas）、Gp6、Gaiella、Gp2、[JP3]Spartobacteriageneraincertaesedis、Gp1、Subdivision3generaincertaesedis、Gp4、WPS-1generaincertaesedis、鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）、亞硝化球菌屬（Nitrososphaera）、Gp7和Latescibacteriageneraincertaesedis，占細(xì)菌總類群的38.16%。優(yōu)勢(shì)菌屬的豐度與復(fù)合肥的用量呈負(fù)相關(guān)，說(shuō)明復(fù)合肥的過(guò)度使用會(huì)降低微生物多樣性。

2.6細(xì)菌門(mén)豐度與土壤理化性質(zhì)的相關(guān)性分析

4個(gè)采樣點(diǎn)共同含有的8種優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門(mén)（豐度>1%）豐度和根際土壤的理化性質(zhì)相關(guān)性如表9所示，變形菌門(mén)豐度與pH值呈極顯著顯著負(fù)相關(guān)，與氮、磷、鉀含量呈正相關(guān)，其中與TON、AP、AK、TOP含量呈顯著正相關(guān)。酸桿菌門(mén)是所有土壤樣品中豐度位居第2的菌門(mén)，與pH值呈極顯著正相關(guān)，與TON、AP、TOP含量呈極顯著或顯著負(fù)相關(guān)。厚壁菌門(mén)豐度與總氮含量呈顯著正相關(guān)。浮霉菌門(mén)豐度與TON含量呈顯著負(fù)相關(guān)。疣微菌門(mén)與pH值呈顯著正相關(guān)，與TON、AP、TOP含量呈極顯著負(fù)相關(guān)，與AK、TOK含量呈顯著負(fù)相關(guān)。擬桿菌門(mén)豐度與pH值呈顯著正相關(guān)，與TOP含量呈顯著負(fù)相關(guān)。

3討論

不同的施肥處理主要影響了土壤pH值以及全氮、有效磷、總磷含量等指標(biāo)，4個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)通過(guò)連續(xù)4年的不同施肥處理，不同無(wú)機(jī)肥施用量下土壤pH值有顯著差異，其中無(wú)機(jī)肥施用量最多的處理pH值最低，這是因?yàn)殚L(zhǎng)期大量施用復(fù)合肥能降低土壤pH值[11-12]。有機(jī)肥處理對(duì)土壤的氮、磷、鉀含量的影響不大[13-14]，所以無(wú)機(jī)肥的施用量是造成土壤pH值以及氮、磷、鉀含量不同的主要因素。

大量無(wú)機(jī)肥料特別是氮肥的投入，通常會(huì)導(dǎo)致旱地土壤細(xì)菌多樣性減少[15]。本研究結(jié)果顯示，A采樣點(diǎn)的Shannon指數(shù)最低，且與其他地區(qū)差異顯著，這與Geisseler等的研究結(jié)果[16-17]相符。土壤pH值常被認(rèn)為是長(zhǎng)期施用無(wú)機(jī)肥土壤中影響細(xì)菌生物多樣性的主要因素[11，16]?？傮w來(lái)看，細(xì)菌生物豐度與TON、AP、AK、TOP、TOK含量呈顯著負(fù)相關(guān)，說(shuō)明長(zhǎng)期施用無(wú)機(jī)肥后，氮、磷、鉀對(duì)根基微生物有一定的抑制作用。Delgado-Baquerizo等的研究結(jié)果表明，土壤理化指標(biāo)對(duì)細(xì)菌生物多樣性有一定的驅(qū)動(dòng)作用[18]。土壤氮、磷是決定細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的重要因素，本研究中總氮含量與Shannon指數(shù)呈顯極著負(fù)相關(guān)，表明氮肥的過(guò)度使用降低了土壤微生物多樣性[19-20];在我國(guó)亞熱帶地區(qū)，由于風(fēng)化和土壤流失，酸性水稻土壤中的磷含量很低[15，21]，枇杷生長(zhǎng)過(guò)程中不需要很多水分，因此土壤中磷的流失較少，含量相對(duì)豐富。已有研究報(bào)道，施加高磷肥料直接改變了植物土壤微生物群落結(jié)構(gòu)[21-22]。綜合來(lái)看，本研究中Shannon指數(shù)與pH值呈極顯著正相關(guān)，與TON、AP、TOP含量均呈極顯著負(fù)相關(guān)，與AK、TOK含量呈負(fù)相關(guān)，說(shuō)明長(zhǎng)期施用復(fù)合肥會(huì)降低土壤微生物多樣性。

本研究通過(guò)對(duì)不同施肥處理下土壤微生物門(mén)豐度進(jìn)行聚類分析發(fā)現(xiàn)，施用復(fù)合肥量最多的A采樣點(diǎn)的優(yōu)勢(shì)門(mén)個(gè)數(shù)最少，且優(yōu)勢(shì)菌門(mén)較為集中，變形菌門(mén)豐度為48.51%，明顯高于其他處理。變形桿菌門(mén)細(xì)菌具有固氮功能，變形桿菌門(mén)豐度增加有利于土壤氮素的有效轉(zhuǎn)化[23]，氮循環(huán)過(guò)程對(duì)土壤pH值存在影響[24]。枇杷根際土壤細(xì)菌群落中變形菌門(mén)和酸桿菌門(mén)占主導(dǎo)地位，與該土壤呈酸性有關(guān)。河北省中南部地區(qū)耕地[25]、蘋(píng)果園土壤[26]、酸性土壤[27]的根際微生物優(yōu)勢(shì)菌門(mén)一致。變形菌門(mén)被認(rèn)為是世界上微生物最豐富的菌門(mén)，是多數(shù)土壤中的優(yōu)勢(shì)門(mén)類，與碳循環(huán)有關(guān)[28]。酸桿菌門(mén)多存在于營(yíng)養(yǎng)貧瘠的土壤環(huán)境中[29]，Barns等研究表明，酸桿菌門(mén)是土壤細(xì)菌群落第2優(yōu)勢(shì)門(mén)，僅次于變形菌門(mén)[30]，與本研究結(jié)果與之一致。

采樣地土壤微生物在屬水平上的差異很大，莆田地區(qū)4個(gè)采樣點(diǎn)共同的菌屬有Gp6、Gp2、Gp1、Subdivision3generaincertaesedis、Gp4。隨著復(fù)合肥用量的增加，優(yōu)勢(shì)菌屬豐度在減少，但是由于A采樣點(diǎn)長(zhǎng)期施肥量較多，導(dǎo)致Massilia、鳥(niǎo)氨酸芽孢桿菌屬、芽孢八疊球菌屬、副球菌屬、節(jié)桿菌屬、假單胞菌屬細(xì)菌出現(xiàn)適應(yīng)現(xiàn)象，成為A采樣點(diǎn)的優(yōu)勢(shì)菌屬。芽孢桿菌屬?gòu)V泛存在于土壤、水、植物及動(dòng)物活動(dòng)環(huán)境中，營(yíng)養(yǎng)要求低，代謝能力強(qiáng)，可以耐受不良環(huán)境條件，部分芽孢桿菌對(duì)病原菌有一定的拮抗作用[31]。芽孢桿菌屬對(duì)洋蔥遭受銅脅迫具有緩解作用[32]，該屬除了具有良好的解磷能力，還具有良好的固氮作用和生防作用[33]。后續(xù)可有目的性地篩選優(yōu)勢(shì)菌，制成生物菌肥解決莆田地區(qū)過(guò)度施復(fù)合肥的問(wèn)題。

相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，土壤pH值對(duì)變形菌門(mén)和酸桿菌門(mén)細(xì)菌豐度影響明顯，總氮、速效磷、總磷含量對(duì)變形菌門(mén)豐度有顯著影響。在迄今已知的與土壤中酸性細(xì)菌豐度相關(guān)的環(huán)境因素中，pH值為影響最為突出的因素[34-35]，本研究相關(guān)性分析結(jié)果與之一致。pH值和氮、磷、鉀含量會(huì)影響細(xì)菌的分布，羅旦等對(duì)沙漠環(huán)境植物根際微生物的研究結(jié)果表明，變形菌門(mén)的豐度與有效氮、AP含量顯著正相關(guān)[36]。土壤全氮、全磷含量是影響土壤變形菌的關(guān)鍵因子[37]，本研究結(jié)果與之一致。厚壁菌門(mén)分布與TON含量呈顯著正相關(guān)，與pH值以及磷、鉀含量的相關(guān)性不顯著，與Navarrete等對(duì)大豆根際土壤的研究結(jié)果[38]類似。相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，土壤pH值對(duì)變形菌門(mén)、酸桿菌門(mén)、擬桿菌門(mén)和疣微菌門(mén)影響顯著。

本研究充分了解了短期內(nèi)使用大量復(fù)合肥引起pH值下降對(duì)枇杷根際土壤微生物多樣性、結(jié)構(gòu)以及功能造成的影響，為以后研發(fā)生物菌肥以及解決土壤板結(jié)、酸化問(wèn)題提供理論依據(jù)。

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