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    驟然低溫下轉(zhuǎn)錄組測序揭示川百合抗寒通路與相關(guān)基因

    2020-03-03 14:37:13田雪慧
    江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2020年22期
    關(guān)鍵詞:分子機(jī)制轉(zhuǎn)錄組

    摘要:在沒有參考基因組的情況下,為了揭示川百合(Liliumdavidii)在4℃處理下基因表達(dá)譜的變化,為百合抗寒育種、引種及栽培提供理論支撐及技術(shù)支持。采用高通量IlluminaHiseq測序平臺(tái)對川百合20℃(對照組)與4℃(處理組)溫度條件下進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序,并對測序數(shù)據(jù)進(jìn)行了分析研究,進(jìn)一步探究川百合寒冷應(yīng)答的分子機(jī)制。結(jié)果表明,經(jīng)富集分析后得,與光合作用、光合作用-天線蛋白、光合生物體中的碳固定、葉綠素代謝等相關(guān)的基因可以作為研究川百合寒冷響應(yīng)機(jī)制的主要研究對象。實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)分析結(jié)果表明,隨機(jī)選出的10個(gè)差異性表達(dá)基因的表達(dá)趨勢與高通量測序結(jié)果一致。這為川百合響應(yīng)低溫相關(guān)基因的發(fā)掘與利用、川百合耐寒分子機(jī)制的揭示及百合種植資源遺傳改良奠定了基礎(chǔ)。

    關(guān)鍵詞:川百合;驟然低溫;轉(zhuǎn)錄組;分子機(jī)制;抗寒通路

    中圖分類號(hào):S644.101文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

    文章編號(hào):1002-1302(2020)22-0028-09

    作者簡介:田雪慧(1978—),女,陜西周至人,博士,副教授,主要從事花卉生產(chǎn)與應(yīng)用方面的教學(xué)與科研工作。E-mail:txh_1214@163.com。

    自然界中植物經(jīng)常遭受干旱[1-4]、髙鹽[5]、高溫[6]和寒害[7-8]等生物或非生物脅迫,溫度是影響植物生長發(fā)育與分布的主要決定性因素[9-11],環(huán)境溫度低于植物正常生長的溫度會(huì)嚴(yán)重影響植物的產(chǎn)量和品質(zhì)[12-14],尤其是在早春和深秋時(shí),溫度突然降低會(huì)引起植物體內(nèi)一系列變化。有學(xué)者報(bào)道稱在許多植物中已經(jīng)觀察到其對低溫脅迫的分子響應(yīng),包括基因表達(dá)[15]、氧化還原態(tài)[16]和復(fù)雜的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[17-18]。但有關(guān)低溫對百合影響的研究大多集中在百合鱗莖采收后休眠生理(春化)期的低溫需求,而對其營養(yǎng)生長期的研究較少[8,19-20]。營養(yǎng)生長是百合鱗莖生長糖分積累的關(guān)鍵,因此研究冷脅迫對營養(yǎng)生長的影響具有重要意義。

    轉(zhuǎn)錄組測序作為現(xiàn)代遺傳學(xué)研究工具,功能強(qiáng)大、廣受歡迎,在動(dòng)植物中被廣泛地應(yīng)用于分析生物體在特定生物學(xué)過程中mRNA表達(dá),揭示其內(nèi)在的分子機(jī)制[21-22]。到目前為止,人們對許多植物的低溫脅迫轉(zhuǎn)錄反應(yīng)進(jìn)行了大量的研究,包括卷單百合[4]、鐵炮百合[23]等。這些研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了大量參與適應(yīng)低溫變化的冷應(yīng)激相關(guān)基因[24]。然而,對食用百合研究較少,特別是川百合(LiliumdavidiiDuchartreexElwes)的研究至今還是空白。

    [JP2]百合是一種藥食同源植物,也是著名的觀賞植物,具有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。川百合是一個(gè)優(yōu)良的食用百合品種,生長在甘肅省蘭州市七里河區(qū),海拔超過2000m,白天的平均最高溫度低于4℃,川百合耐寒性明顯高于其他食用百合品種[23]。因此,揭示川百合抗寒的分子機(jī)制具有重要意義,可為食用百合的高質(zhì)量生產(chǎn)栽培及遺傳育種提供依據(jù)。本研究以川百合為材料,以常溫(20℃)為對照,低溫(4℃)條件下進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序,目的是(1)根據(jù)基因本體論和京都基因與基因組百科全書(KEGG)分析,探討低溫反應(yīng)最豐富的通路;(2)鑒定光合作用及抗氧化相關(guān)基因。研究川百合抗寒的分子機(jī)制,有助于進(jìn)一步了解食用百合是如何適應(yīng)或不能適應(yīng)環(huán)境變化的。

    1材料與方法

    1.1試驗(yàn)材料

    收集甘肅省蘭州市七里河區(qū)室外生長的成熟百合鱗莖,在2℃冰箱中保存110d。春化后,將鱗莖移栽于體積為2L直徑為15cm的花盆中,置于(20℃)人工智能氣候箱中。生長環(huán)境溫度設(shè)置為白天20℃、夜晚15℃,相對空氣濕度為50%~65%,光—暗周期為16h—8h,平均光照度為(350±20)μmol/(m2·s),每3~5d澆灌300mL水,用霍格蘭(Hoagland)營養(yǎng)液為其提供充足養(yǎng)分。

    1.2低溫脅迫處理

    將長勢良好高度約15cm的川百合幼苗,在2個(gè)人工智能氣候箱作不同溫度處理(每室12株)。一室為對照,溫度設(shè)為20℃,另一室為低溫處理,溫度設(shè)為4℃,其他環(huán)境參數(shù)與前處理相同。處理24h后取相同部位的葉片,液氮速凍,-80℃保存。

    1.3指標(biāo)測定

    1.3.1轉(zhuǎn)錄測序

    每室各取3份川百合葉片樣品,采用TRIzol法提取總RNA[25],并對其純度、完整性、濃度等進(jìn)行檢測,檢測合格的樣品用磁珠富集mRNA[25],再將mRNA打成短片段后合成第二鏈cDNA,修復(fù)、純化、選擇片段大小,然后進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增,純化PCR產(chǎn)物,得到最終文庫。高通量測序平臺(tái)選用Illumina4000[25],測序所得的數(shù)據(jù)稱為rawreads或rawdata。對結(jié)果進(jìn)行組裝、拼接,并進(jìn)行功能注釋和表達(dá)水平分析。

    1.3.2PCR驗(yàn)證

    以川百合葉片RNA為材料,采用HiScriptⅡQRTSuperMixforqPCR試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,設(shè)計(jì)引物(表1)進(jìn)行實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qRT-PCR)分析,以Actin基因作為內(nèi)參[26],隨機(jī)選取10個(gè)差異基因進(jìn)行驗(yàn)證。

    1.4數(shù)據(jù)分析

    轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)由北京奧維森基因科技有限公司進(jìn)行分析。

    2結(jié)果與分析

    2.1測序結(jié)果與Trinity拼接

    由表2可知,對照組產(chǎn)生了868404526個(gè)原始序列,84782272個(gè)純凈序列,堿基含量為44.84%;處理組產(chǎn)生了74630164個(gè)原始序列,72715608個(gè)純凈序列,堿基含量為50.03%。這些結(jié)果表明川百合的轉(zhuǎn)錄組測序質(zhì)量較高,可進(jìn)行后續(xù)研究。

    由表3可知,轉(zhuǎn)錄本共產(chǎn)生168637667個(gè)堿基,共產(chǎn)生133179110個(gè)單基因序列(約為轉(zhuǎn)錄本的79%)。單基因序列值高達(dá)轉(zhuǎn)錄序列的90%以上(核苷酸總數(shù)除外)。說明拼接良好,RNA質(zhì)量較好,可進(jìn)行后續(xù)分析。

    2.2基因功能注釋結(jié)果

    如表4所示,所有基因中,有238301個(gè)基因被注釋到相應(yīng)的7個(gè)數(shù)據(jù)庫中。其中,約27.41%的基因(65314個(gè)基因)被注釋到NR庫(NCBI蛋白質(zhì)非冗余數(shù)據(jù)庫),17.68%的基因(42138個(gè)基因)被注釋到COG/KOG庫(真核生物的同源基因數(shù)據(jù)庫),14.79%的基因(35244個(gè)基因)被注釋到GO庫,15.91%的基因(37916個(gè)基因)被注釋到Nt庫([CM(21*3]核酸序列數(shù)據(jù)庫),19.44%的基因(46337個(gè)基因)被注釋到Swiss-Prot,24.59%的基因(58605個(gè)基因)被注釋到包含了(數(shù)據(jù)庫)的蛋白質(zhì)家族。其他無法注釋到數(shù)據(jù)庫中的基因可能是由于基因片段過短或數(shù)據(jù)庫中信息缺乏等原因。

    將GO、KEGG、KOG中注釋的基因進(jìn)行分類,評價(jià)組裝后基因的功能(圖1)。GO分類中,將基因分為生物過程、細(xì)胞組分和分子功能3組,在分子功能中,“結(jié)合活性(binding)”和“催化活性(catalyticactivity)”的基團(tuán)最多(圖1-a);為了進(jìn)行KOG函數(shù)的分類,將所有基因分類為26個(gè)亞類,“一般功能預(yù)測(generalfunctionpredictiononly)”的聚類最多(圖1-b);KEGG分類中,5組基因均有表達(dá),代謝組中,“全球概覽圖(globalandoverviewmaps)”“轉(zhuǎn)錄(Translation)”和“碳水化合物代謝(Carbohydratemetabolism)”的聚類顯著豐富,分別有1730、1592、1127個(gè)基因(圖1-c)。結(jié)果表明,低溫誘導(dǎo)了一系列涉及生物過程、細(xì)胞組分、分子功能、代謝等不同亞類的單基因顯著富集。

    2.3基因表達(dá)差異分析

    2.3.1GO富集分析

    將所有差異基因進(jìn)行GO富集分析后,上調(diào)基因富集結(jié)果如圖2所示,在細(xì)胞組分中,富集效果較明顯的功能有細(xì)胞膜、細(xì)胞器、細(xì)胞核;分子功能中富集效果較明顯的功能有蛋白激酶活性、磷酸轉(zhuǎn)移酶活性、激酶活性;生物過程中富集效果較明顯的功能有磷代謝過程、復(fù)合磷酸鹽代謝過程、磷酸化作用、蛋白磷酸化。結(jié)果表明上調(diào)差異基因在細(xì)胞成分、分子功能、生物過程等3個(gè)方面主要調(diào)節(jié)物質(zhì)的合成代謝。

    下調(diào)基因富集分析結(jié)果如圖3所示,細(xì)胞成分功能中富集較為明顯的是光系統(tǒng)Ⅰ和光系統(tǒng)Ⅰ反應(yīng)中心;分子功能中富集較為明顯的是水解酶活性、電子運(yùn)輸活動(dòng)等。生物過程功能中富集較為明顯的是光合作用、光反應(yīng)等。因此,下調(diào)基因在細(xì)胞組分、分子功能、生物過程3個(gè)方面主要調(diào)節(jié)光合作用。

    2.3.2KEGG富集分析分析結(jié)果如圖4所示,上調(diào)差異基因顯著富集的通路有植物生理節(jié)律(circadianrhythm-plant),苯丙氨酸代謝(phenylalaninemetabolism),真核生物核糖體生物合成(ribosomebiogenesisineukaryotes),甘氨酸、蘇氨酸、絲氨酸和β-氨基酸代謝(glycine,serineandthreoninemetabolism),黃酮類化合物(flavonoidbiosynthesis)、氨基酸類的生物合成(biosynthesisofaminoacids),植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(planthormonesignaltransduction)等。上調(diào)差異基因c168304_g1、c148234_g1、c168304_g3、c168304_g2、c166080_g1(EC:4.3.1.24)、c165806_g1(EC:1.14.13.11)等主要調(diào)節(jié)氨基酸代謝;c169999_g5(pseudo-responseregulator5)、c174283_g3等主要調(diào)節(jié)植物生理節(jié)律;c152959_g1和c146280_g1(EC:5.4.9.9)主要調(diào)節(jié)真核生物核糖體合成;c151401_g1、c146896_g1、c146896_g3、c174513_g3、c174513_g1、c155146_g1和c169857_g1(EC:2.3.1.74)主要調(diào)節(jié)黃酮類化合物的合成;c163360_g1主要調(diào)節(jié)植物信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。

    下調(diào)基因顯著富集的通路有光合作用、光合作用[CM(21]-天線蛋白、卟啉和葉綠素代謝、光合生物碳固定等(如圖5所示)。下調(diào)基因c198283_g1和c153649_g1主要調(diào)節(jié)光反應(yīng)系統(tǒng),c149445_g1、c115377_g1、c167947_g1和c170780_g1(EC:1.2.1.70)主要調(diào)節(jié)葉綠素代謝,c169641_g1(EC:1.1.1.37)主要調(diào)節(jié)碳固定。因此,下調(diào)基因通過調(diào)節(jié)光反應(yīng)系統(tǒng)和葉綠素的合成,從而調(diào)節(jié)光合作用。

    2.4qRT-PCR驗(yàn)證

    為驗(yàn)證測序結(jié)果的可信度,隨機(jī)選取10個(gè)差異基因,其中5個(gè)上調(diào)基因(c111268_g1、c145664_g1、c145507_g1、c128115_g1),5個(gè)下調(diào)基因(c117236_g1、c119413_g2、c135104_g1、c93924_g1),以Actin為內(nèi)參進(jìn)行PCR驗(yàn)證。由圖6可知,10個(gè)基因在不同溫度下的表達(dá)程度不同,但表達(dá)趨勢與高通量測序結(jié)果一致,則表明測序結(jié)果真實(shí)可靠。

    3討論與結(jié)論

    冷脅迫指植物暴露在較低但不結(jié)冰的溫度下而導(dǎo)致的損傷[26],生長期間突然出現(xiàn)的低溫嚴(yán)重影響百合的生長。本研究對川百合抗寒性相關(guān)的關(guān)鍵基因進(jìn)行篩選和驗(yàn)證,可以為川百合簡單重復(fù)序列標(biāo)記(SSR)的開發(fā)和分子育種提供參考。

    之前的研究表明,低溫脅迫引起百合幼苗體內(nèi)生理生化水平發(fā)生了巨大的變化[18],表明川百合在其營養(yǎng)生長早期對4℃低溫較為敏感。本研究比較了川百合在常溫和低溫下的代謝情況,闡明了川百合具有獨(dú)特的抗寒機(jī)制。冷應(yīng)激誘導(dǎo)豐富度的結(jié)果(圖3)表明,它可能導(dǎo)致分子水平上的許多代謝過程,從而提供低溫脅迫條件下可能的分子機(jī)制。

    將基因分為GO、KEGG、KOG等不同類別(圖2),在分子功能方面,發(fā)現(xiàn)“結(jié)合活性(binding)”和“催化活性(catalyticcativity)”是最常見的2個(gè)基團(tuán)(圖2-a),這些基因包括結(jié)構(gòu)分子活性和轉(zhuǎn)運(yùn)體活性的形成[27],影響植物的代謝過程。同時(shí)還發(fā)現(xiàn),在代謝組KEGG數(shù)據(jù)庫,碳水化合物代謝、維生素代謝、能量代謝等代謝通路的差異表達(dá)基因最豐富[CM(21],人們普遍認(rèn)為,這些通路是抑制其生長和發(fā)育的內(nèi)在代謝通路。從整體上看,KEGG數(shù)據(jù)庫中響應(yīng)低溫脅迫的基因非常豐富,[JP3]須要深入挖掘其分子機(jī)制。

    基于GO和KEGG分析的低溫與常溫下富集最豐富的通路分別如圖4和圖5所示,包括上調(diào)通路和下調(diào)通路。研究表明,細(xì)胞成分(胞內(nèi)膜內(nèi)和膜內(nèi)細(xì)胞器)中與膜相關(guān)的通路顯著上調(diào)(圖4),膜對冷應(yīng)激反應(yīng)顯著。此外,在GOterm的生物學(xué)過程中,磷酸化和蛋白磷酸化通路在低溫脅迫下顯著上調(diào),這可能是因?yàn)榱资悄さ闹匾煞?,這與Moellering等的研究[28]相同。此外,葉片對水的響應(yīng)和對非生物刺激的響應(yīng)途徑顯著上調(diào),因?yàn)榈蜏叵氯~片的相對含水量會(huì)降低[29];與光合作用相關(guān)的通路(光合作用、光收獲、光合作用、光反應(yīng))顯著下調(diào),與許多以前的報(bào)道和目前關(guān)于低溫下光合作用響應(yīng)的研究數(shù)據(jù)[30]一致。

    為了驗(yàn)證RNA-seq數(shù)據(jù)的可靠性,隨機(jī)選擇了10個(gè)與光合作用、代謝途徑、代謝途徑和氧化磷酸化相關(guān)的基因,采用qRT-PCR方法檢測其相對表達(dá)(圖6)。結(jié)果與RNA-seq數(shù)據(jù)吻合較好,說明RNA-seq數(shù)據(jù)是可靠的,可以用來揭示川百合對低溫反應(yīng)的分子機(jī)制。

    低溫(4℃)脅迫顯著降低了川百合細(xì)胞膜的穩(wěn)定性。通過轉(zhuǎn)錄組分析,篩選出與抗寒性、光合作用、代謝途徑等相關(guān)的關(guān)鍵基因,為川百合SSR的開發(fā)和分子育種提供了參考。川百合抗寒相關(guān)基因、代謝物及途徑還有待進(jìn)一步研究。

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