保健食品中13種那非類物質(zhì)快速檢測(cè)及確證

范小龍，吳婉琴，曾妮，黎星，黃坤，王會(huì)霞

湖北省食品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，湖北省食品質(zhì)量安全檢測(cè)工程技術(shù)研究中心（武漢 430000）

隨著對(duì)養(yǎng)生保健日趨重視，保健食品種類越來越多，然而市場(chǎng)競(jìng)爭加劇，保健品的促銷方向出現(xiàn)向保健品中非法添加化合物的情況[1]，以暫時(shí)的速效、高效或特效，謀取高額非法利潤，致使患者出現(xiàn)嚴(yán)重不良反應(yīng)，甚至導(dǎo)致死亡，其中補(bǔ)腎壯陽類保健品是那非類藥物違規(guī)添加的重點(diǎn)[2-4]。那非類藥物是一種壯陽的精神類藥物，西地那非等均屬于磷酸二酯酶5（PDE5）抑制劑的處方藥，1998年經(jīng)美國食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)，是治療男子陰莖勃起功能障礙（ED）有效藥物，但長期或超劑量服用易對(duì)心血管系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、消化系統(tǒng)等造成嚴(yán)重?fù)p傷[5]，國家嚴(yán)禁在保健食品中違規(guī)添加。

那非類物質(zhì)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)主要是液相串聯(lián)質(zhì)譜方法，液相色譜方法較少[6]?！端幤窓z驗(yàn)補(bǔ)充檢驗(yàn)方法和檢驗(yàn)項(xiàng)目批準(zhǔn)編2009030》中講述的是液相方法，但其方法過于陳舊，且部分那非物質(zhì)并沒有良好的分離度，那非類藥物檢測(cè)最新的方法為《市場(chǎng)監(jiān)管總局關(guān)于發(fā)布〈食品中那非類物質(zhì)的測(cè)定〉食品補(bǔ)充檢驗(yàn)方法的公告》[7]，其中方法一規(guī)定的為液相串聯(lián)質(zhì)譜法，方法二為液相串聯(lián)質(zhì)譜-高分辨質(zhì)譜方法，均為質(zhì)譜方法，質(zhì)譜方法檢出限低、檢測(cè)更靈敏。試驗(yàn)前期對(duì)收集的陽性樣品檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)那非類物質(zhì)的添加量很高，因此用質(zhì)譜測(cè)定時(shí)需要稀釋數(shù)萬倍甚至百萬倍，若稀釋倍數(shù)不當(dāng)直接進(jìn)行質(zhì)譜測(cè)試，則會(huì)污染質(zhì)譜，試驗(yàn)表明西地那非容易殘留于質(zhì)譜中；同時(shí)，反復(fù)稀釋容易造成定量誤差。因此，建立同時(shí)測(cè)定13種那非類物質(zhì)的液相色譜定量及液相串聯(lián)質(zhì)譜定性的分析方法將有助于解決這一問題。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Waters e2695高效液相色譜；Waters PDA 2998紫外檢測(cè)器；Waters TQ-S型超高液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀；Talboys渦旋儀；Elma超聲儀。

超純水；乙腈、甲醇、乙酸、乙酸銨（色譜級(jí)，F(xiàn)isher公司）；標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（詳細(xì)信息見表1）：那紅地那非、紅地那非、伐地那非、羥基豪莫西地那非、西地那非、豪莫西地那非、氨基他達(dá)那非、他達(dá)那非、硫代艾地那非、偽伐地那非、那莫西達(dá)那非（含量≥98%，中國食品藥品檢定研究院）；去甲基他達(dá)那非、硫代西地那非（含量≥99.5%，TRC公司）。

表1 那紅地那非等13種物質(zhì)相關(guān)信息

1.2 樣品

10種聲稱具有抗疲勞、提高免疫力保健食品，10種保健酒。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品的制備

1.3.1.1 固體樣品

片劑：樣品研細(xì)、混勻；膠囊：直接混勻，稱取約0.5 g一次口服劑量，置于50 mL容量瓶中，加入乙腈，超聲20 min溶解，放至室溫，用乙腈定容至刻度，混勻后過0.22 μ m濾膜，待上機(jī)。

1.3.1.2 液體樣品

直接稱取約10 g一次口服劑量，置于100 mL容量瓶中，加入乙腈，超聲20 min溶解，放至室溫，用乙腈定容至刻度，混勻后過0.22 μm濾膜，待上機(jī)。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液制備

1.3.2.1 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液

分別精密稱取適量13種標(biāo)準(zhǔn)品置于10 mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度，搖勻，制成質(zhì)量濃度約2 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于-20 ℃保存，有效期3個(gè)月。

1.3.2.2 混合標(biāo)準(zhǔn)中間工作液

分別精密吸取適量標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用乙腈稀釋至刻度，搖勻，制成質(zhì)量濃度41.65 μg/mL西地那非、18.8 μg/mL紅地那非、43.05 μg/mL那莫西達(dá)那非、38.32 μg/mL去甲基他達(dá)那非、39.375 μg/mL硫代西地那非、其他8種質(zhì)量濃度40.75 μ g/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)中間液。

1.3.2.3 混合標(biāo)準(zhǔn)工作液

取適量混合標(biāo)準(zhǔn)中間液，用乙腈稀釋至樣品檢測(cè)的濃度。

1.3.3 色譜條件

色譜柱，Waters Symmetry Shield C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相A，乙腈；流動(dòng)相B，20 mmol/L乙酸銨水溶液（含0.1%乙酸），梯度見表2，柱溫35℃，進(jìn)樣量10 μL。

表2 流動(dòng)相梯度程序

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化

2.1.1 色譜柱的選擇

比較Waters Symmetry Shield C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）和Waters XBridge C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱對(duì)13種那非類的分離效果，在同一流動(dòng)相條件下，其中羥基豪莫西地那非和氨基他達(dá)那非最大吸收波長均在290 nm左右，在XBridge色譜柱上色譜峰疊加在一起，始終無法分離，而在Symmetry Shield C18色譜柱上均能實(shí)現(xiàn)良好分離，而且靈敏度更高，峰形更尖銳，高液相色譜圖及各物質(zhì)最大吸收波長見圖1。因此試驗(yàn)選用Waters Symmetry Shield C18色譜柱作為分離色譜柱。

2.1.2 流動(dòng)相的選擇

試驗(yàn)比較乙腈-純水、乙腈-20 mmol/L乙酸銨溶液（0.1%乙酸）和乙腈-20 mmol/L乙酸銨溶液（0.1%甲酸）3種流動(dòng)相體系分離效果。采用乙腈-水時(shí)，13種那非類化合物，峰形拖尾，導(dǎo)致分離度不理想；采用乙腈乙腈-20 mmol/L乙酸銨溶液（0.1%甲酸）時(shí)，其中硫代艾地那非和偽伐地那非無法分離；采用乙腈-20 mmol/L乙酸銨溶液（0.1%乙酸）時(shí)，13種那非類均有良好的分離度和峰形。因此試驗(yàn)選擇乙腈-20 mmol/L乙酸銨溶液（0.1%乙酸）作為流動(dòng)相。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性范圍、方法檢出限及方法定量限

配制系列的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，以各分析物的峰面積（Y）和相應(yīng)的質(zhì)量濃度（X，μg/mL）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程。結(jié)果表明，各目標(biāo)化合物在線性范圍內(nèi)13種那非類的線性關(guān)系良好；配制標(biāo)準(zhǔn)溶液混標(biāo)，用空白基質(zhì)溶液稀釋到適量濃度，以儀器3倍和10倍信噪比確定方法檢出限和方法定量限，結(jié)果見表3。

2.3 回收率和精密度

以空白基質(zhì)樣品進(jìn)行低（1倍定量限）、中（5倍定量限）、高（10倍定量限）3個(gè)水平加標(biāo)回收試驗(yàn)，每個(gè)水平測(cè)定6次，結(jié)果見表4。結(jié)果表明，13種那非類的平均回收率為92.64%～109.17%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0.75%～5%。說明該方法具有良好的準(zhǔn)確度和精密度。

2.4 實(shí)際樣品分析

應(yīng)用該方法對(duì)市售的保健食品（標(biāo)稱具有抗疲勞功效）共計(jì)20份進(jìn)行測(cè)定，其中6份均檢測(cè)出西地那非，含量為10～20 mg/g；1份樣品檢測(cè)出他達(dá)那非，含量為3.71 mg/g；1份樣品檢測(cè)出伐地那非，含量為2.83 mg/g；剩余12份未檢出那非類，見圖2。在測(cè)定時(shí)有2份樣品在液相色譜圖上出現(xiàn)保留時(shí)間和紫外光譜圖和西地那非標(biāo)準(zhǔn)色譜圖一樣的峰，由于含量在檢出限附近，最后通過超高液相串聯(lián)質(zhì)譜的確證，確定該樣品中含有西地那非。

圖1 13種化合物液相色譜圖及其紫外吸收光譜圖

表3 13種那非類物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性范圍、方法檢出限、方法定量限

表4 13種那非類物質(zhì)的回收率及精密度

圖2 陰性樣品液相色譜圖及不同陽性樣品色譜圖

3 結(jié)論

在測(cè)定保健食品樣品時(shí)，13種那非類中西地那非檢出率最高，約30%，主要原因可能是西地那非是當(dāng)前市場(chǎng)上流行的治療勃起功能障礙的口服速效處方藥，且價(jià)格低廉，質(zhì)量有保證，故被不良廠商非法添加到保健食品，以達(dá)到速效、高效的保健、滋補(bǔ)、壯陽、強(qiáng)身等目的，從而拓展銷路且非法牟利[8]。為打擊不良廠商在保健食品中非法添加那非類物質(zhì)，試驗(yàn)建立高效液相色譜同時(shí)分離測(cè)定13種那非類物質(zhì)及采用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜對(duì)不確定的陽性樣品進(jìn)行快速確證的分析方法，該方法操作簡單、靈敏度高，可滿足保健食品中那非類物質(zhì)非法添加的檢測(cè)要求，為保健食品中那非類藥物非法添加監(jiān)管理提供檢測(cè)技術(shù)。