RP-HPLC法測(cè)定面包中丙酸

鄒沫君

樂山市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心（樂山 614000）

丙酸又稱初油酸，是無色、有腐蝕性易燃的液體，毒性比甲酸小，對(duì)眼睛、皮膚、黏膜有刺激作用，與乙酸一樣有殺菌性，能抑制細(xì)菌的生長，主要用作食品防腐劑和防霉劑[1]。至今廣泛用于食品防腐劑的三大品種為苯甲酸及其鈉鹽，山梨酸及其鉀鹽，丙酸及其鹽鈉鹽、鈣鹽。苯甲酸及其鈉鹽是使用時(shí)間最長且應(yīng)用最廣泛的食品防腐劑，現(xiàn)今隨著人們對(duì)其毒性有了一定的認(rèn)識(shí)，不少國家已明令限值或減少使用，而逐漸以山梨酸及其鉀鹽、丙酸及其鈉鹽、鈣鹽代替[2]。丙酸的防真菌和霉菌效果在pH 6.0以下時(shí)優(yōu)于苯甲酸，價(jià)格低于山梨酸，是理想的食品防腐劑之一，因而作為食品防腐劑在我國具有巨大的潛在市場(chǎng)[3]。

1 儀器與材料

1.1 儀器與設(shè)備

DGU-20A 5R高效液相色譜儀（日本島津公司）；FA124電子天平（上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司）；TG-16醫(yī)用離心機(jī)（四川蜀科儀器有限公司）；PHSJ-4A pH計(jì)（上海盛磁儀器有限公司）；JJ-2組織搗碎勻漿儀（江蘇金壇市環(huán)宇科學(xué)儀器廠）；KQ-700型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；DB206電熱鼓風(fēng)恒溫干燥箱（成都電烘廠）。

1.2 材料與試劑

20批試樣（市售，預(yù)包裝食品，每批試樣均來自不同的生產(chǎn)廠家）；丙酸標(biāo)準(zhǔn)品（Lot：123854，99.9%，Dr. Ehrenstrofer GmbH）；磷酸、磷酸氫二銨（分析純，北京百靈威科技有限公司）；水為超純水（電阻率=18.2 MΩ·cm）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜分離系統(tǒng)的確定

2.1.1 標(biāo)樣的制備

精確稱取25.0 mg丙酸標(biāo)準(zhǔn)品于25 mL容量瓶中，加水至刻度，于4 ℃冰箱中保存，有效期為3個(gè)月。

2.1.2 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取5 g（精確到0.01 g）經(jīng)組織搗碎機(jī)搗碎、35 ℃風(fēng)干2 h的面包試樣至100 mL燒杯中，加20 mL水，加入0.5 mL 1 mol/L磷酸溶液，混勻，超聲波浸提10 min后，用1 mol/L磷酸溶液調(diào)pH至3，轉(zhuǎn)移試樣至50 mL容量瓶中，用水定容至刻度，搖勻，將試樣全部轉(zhuǎn)移至50 mL具塞塑料離心管中，以4 000 r·min-1離心10 min，取上清液，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾后，待液相色譜測(cè)定。同時(shí)做試樣空白試驗(yàn)。

2.1.3 色譜條件和系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)

采用Sepax GP-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5.0 μm），流動(dòng)相為1.5 g/L磷酸氫二銨溶液，波長為215 nm，流速為1.0 mL·min-1，柱溫為25 ℃，進(jìn)樣量為20 μL。

取2.1.1項(xiàng)下對(duì)照品溶液，在2.1.3項(xiàng)色譜條件下進(jìn)行分析。丙酸拖尾因子為0.97，理論塔板數(shù)（USP）為23 060。

2.1.4 方法專屬性試驗(yàn)

丙酸標(biāo)準(zhǔn)溶液、陰性試樣溶液以及陰性加標(biāo)試樣溶液色譜圖見圖1～圖3。結(jié)果表明，該方法專屬性好，選擇性高。

圖1 丙酸標(biāo)準(zhǔn)色譜圖

圖2 陰性試樣色譜圖

圖3 陰性加標(biāo)試樣色譜圖

2.2 分析方法驗(yàn)證

2.2.1 線性關(guān)系、檢出限和定量限考察

分別精密吸取0.0，0.50，1.0，2.0，4.0，6.0，8.0和10.0 μL 2.1.1項(xiàng)下對(duì)照品溶液，注入液相色譜儀，在2.1.3項(xiàng)條件下測(cè)定，得到峰面積與質(zhì)量濃度的線性關(guān)系，擬合回歸方程式，確定相關(guān)系數(shù)、最低檢出限（S/N=3）和定量限（S/N=10），結(jié)果見表1。結(jié)果表明，丙酸在0～0.535 3 mg·mL-1質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，完全能夠滿足面包中其含量的測(cè)定。

表1 回歸方程、相關(guān)系數(shù)、最低檢出限、定量限

2.2.2 精密度考察

取2.2.1項(xiàng)下丙酸線性第4點(diǎn)對(duì)照品溶液，按2.1.3項(xiàng)下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖。以峰面積計(jì)算，其RSD為0.58%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.2.3 方法重復(fù)性考察

取編號(hào)為A的面包試樣，按2.1.2項(xiàng)下方法制備6份供試品溶液進(jìn)行色譜分析，計(jì)算殘留量。丙酸殘留量RSD值為0.69%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.4 溶液穩(wěn)定性考察

取制備好的編號(hào)為A的面包供試品溶液，按2.1.3項(xiàng)下儀器條件分別于0，4，8，12，16，20和24 h進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜峰面積，計(jì)算丙酸RSD，為0.74%（n=7），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.5 耐用性考察

取2.2.1項(xiàng)下線性第4點(diǎn)對(duì)照品溶液，分別采用不同柱溫（24，25和26 ℃）、不同流速（0.9，1.0和1.1 mL·min-1）進(jìn)行測(cè)定，研究儀器色譜行為的變化。以峰面積計(jì)，不同柱溫條件下丙酸RSD為0.81%（n=3）；不同流速條件下丙酸RSD為0.72%（n=3）。表明在實(shí)際應(yīng)用過程中色譜條件有微小變化時(shí)，面包中丙酸殘留量測(cè)定條件較寬，測(cè)定結(jié)果不受影響，系統(tǒng)具有較好的耐用性。

2.2.6 回收率考察

表2 回收率試驗(yàn)結(jié)果

精密稱取已測(cè)定含量的試樣（編號(hào)：A），平行9份，置于100 mL燒杯中，加入適量丙酸對(duì)照品儲(chǔ)備液，后按2.1.2，2.1.3項(xiàng)下條件操作，結(jié)果見表2。丙酸的平均回收率為99.96%，RSD為0.59%，表明該法具有良好的回收率，準(zhǔn)確度符合要求。

3 討論

3.1 檢測(cè)波長和流動(dòng)相的選擇

試驗(yàn)為了保證丙酸具有適宜的精密度和靈敏度，且減少干擾，采用二極管陣列檢測(cè)器對(duì)樣品進(jìn)行全波長掃描，根據(jù)對(duì)丙酸的紫外光譜圖進(jìn)行分析，重點(diǎn)考察了195，215和235 nm處的特征吸收?qǐng)D譜。在215 nm處，丙酸有最佳吸收。比較流動(dòng)相1.5 g/L磷酸氫二銨溶液（pH 2.5，3.0和3.5）[4-5]，對(duì)色譜峰的影響。結(jié)果采用1.5 g/L磷酸氫二銨溶液（pH 3.0）等度洗脫，基線平穩(wěn)，丙酸峰形得到很好的提高。

3.2 提取方式的選擇

比較不同pH磷酸溶液（pH 2.5，3.0和3.5）[6-8]對(duì)丙酸提取能力的影響，發(fā)現(xiàn)經(jīng)pH 3.0磷酸溶液超聲浸提10 min，可將樣品提取完全，系統(tǒng)的耐用性好。

3.3 樣品含量測(cè)定

取20批不同廠家的面包試樣，各3份，按2.1.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在2.1.3項(xiàng)色譜條件下測(cè)定，采用外標(biāo)法以峰面積計(jì)算含量，結(jié)果見表3。

表3 試樣含量測(cè)定結(jié)果（n=3）

測(cè)定了20個(gè)不同生產(chǎn)廠家的試樣，丙酸的含量為0.270 2～1.277 9 g·kg-1，測(cè)定結(jié)果均符合GB 2760—2014《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》[9]。通過比較丙酸含量測(cè)定結(jié)果，發(fā)現(xiàn)不同廠家間存在明顯差異，其原因可能與原輔料的選取和生產(chǎn)工藝的控制有關(guān)。因此，食品生產(chǎn)者應(yīng)嚴(yán)把原輔料進(jìn)廠關(guān)，全面規(guī)范并提高生產(chǎn)工藝關(guān)鍵控制點(diǎn)及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，杜絕過量添加現(xiàn)象，確保食品的安全、健康，從而能夠更好地維護(hù)消費(fèi)者舌尖上的安全。

4 結(jié)論

試驗(yàn)采用簡單一元流動(dòng)相等度洗脫提高分離效能，試樣中的丙酸鹽通過酸化轉(zhuǎn)化為丙酸，經(jīng)超聲波水浴收集后調(diào)pH，反相液相色譜分離，外標(biāo)法定量，建立了測(cè)定面包中丙酸的質(zhì)量控制分析方法，并對(duì)市面上20個(gè)不同廠家面包中丙酸含量進(jìn)行了比較，更好地控制面包的內(nèi)在質(zhì)量，保證其安全、優(yōu)質(zhì)。