水中銅綠假單胞菌顯色培養(yǎng)基的初步應用

蔣曙光，曹琥靚

1. 上海市營養(yǎng)食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗站（上海 200082）；2. 上海源本食品質(zhì)量檢驗有限公司（上海 200082）

銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）屬于假單胞菌屬，是一類致病性較低但抗藥力強的菌，其普遍分布于自然界中，如泥土中、動植物上、正常人的皮膚上和腸道呼吸道中。

銅綠假單胞菌可以在水環(huán)境中生存很長時間，可引起人的腹瀉等疾病，世界衛(wèi)生組織和我國都將此菌作為瓶裝飲用水的污染危害指示菌，日本和加拿大等國家已經(jīng)對水的銅綠假單胞菌的存在作出限量規(guī)定；國際食品法典委員會（CAC）和歐盟成員國都明確作出了相應的規(guī)定，并指出在水中不得檢出此菌[1-2]。因此，銅綠假單胞菌被認為是水源性致病菌，是危害人類健康的一大威脅[3]。

目前國內(nèi)外檢驗標準中，使用CN假單胞菌選擇性培養(yǎng)基并結(jié)合濾膜法是檢測水中銅綠假單胞菌最常用的手段[3]，水樣經(jīng)過過濾后將濾膜移到CN假單胞菌選擇性培養(yǎng)基上，于36 ℃培養(yǎng)48 h，若在濾膜上有褐色或產(chǎn)有熒光的菌落，需純化培養(yǎng)后進一步生化鑒定，其檢驗過程繁瑣，通常要耗時5～7 d。

針對我國的水質(zhì)污染情況，為進一步加快和提高檢驗水樣的效率，特別是大量水樣現(xiàn)場檢驗，試驗通過使用銅綠假單胞菌顯色培養(yǎng)基結(jié)合濾膜法，24～48 h就可以完成銅綠假單胞菌的檢驗，與國標使用的培養(yǎng)基和檢驗過程比較，具有很大的優(yōu)越性，可推廣應用于瓶（桶）裝水、水源水、城市二次供水等領(lǐng)域的銅綠假單胞菌的檢驗。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標準菌株

銅綠假單胞菌（ATCC 9027，ATCC 27853）、熒光假單胞菌（ATCC13525）、大腸埃希氏菌（ATCC 25922）、糞鏈球菌（ATCC 29212）、金黃色葡萄球菌（ATCC 6538）、沙門氏菌（ATCC 14028）：美國菌種保藏中心。

1.1.2 儀器與試劑

密理博便攜式過濾系統(tǒng)；密理博過濾膜0.45 μm；海爾生物安全柜；三洋SANYO MLS-3050型高壓滅菌鍋；VDRTEX-5型旋渦混合儀；PL230型梅特勒電子天平；超凈工作臺。

CN假單胞菌選擇性培養(yǎng)基、乙酰胺液體培養(yǎng)基、金氏B培養(yǎng)基、API 20NE、銅綠假單胞菌顯色培養(yǎng)基等試劑，北京陸橋技術(shù)有限責任公司。

據(jù)《中國農(nóng)民工調(diào)研報告》顯示，新生代農(nóng)民工的受教育程度逐步提升，其受教育程度在農(nóng)民工中的占比由20世紀80年代的小學教育水平為主，逐步過渡到90年代以初中教育水平為主，2000年后，這個群體中的高中生比重最大，到今天，新生代農(nóng)民工多半接受了中?；虼髮＝逃械倪€接受了正規(guī)的大學教育。相比于老一代農(nóng)民工，這些農(nóng)民工在今天的信息時代，他們完全可以與城市同齡人一樣，借助于現(xiàn)代手段和信息技術(shù)完全可以獲取自己想要的不同知識，他們具有較強的信息獲取能力，其運用的途徑、手段和方式也多種多樣，網(wǎng)絡和自媒體成為其了解外部世界的常用手段，這些新生代農(nóng)民工的知識獲取和知識更新速度和能力都與城市同齡人一樣。

1.2 方法

1.2.1 顯色培養(yǎng)基的特異性測試

將銅綠假單胞菌、熒光假單胞菌、大腸埃希氏菌、糞鏈球菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌在營養(yǎng)肉湯中過夜復蘇，挑取1環(huán)轉(zhuǎn)種于銅綠假單胞菌顯色平板，于36±1 ℃培養(yǎng)24 h，觀察各個菌株在顯色平板上的生長狀況，測試顯色平板的特異性。

1.2.2 顯色培養(yǎng)基的抑菌性測試

將大腸埃希氏菌、糞鏈球菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌在營養(yǎng)肉湯中過夜復蘇，分別制成104～105CFU菌懸液，涂布于顯色平板，于36±1 ℃培養(yǎng)24 h，觀察顯色平板上的雜菌生長狀況。

1.2.3 培養(yǎng)基靈敏度測試

將銅綠假單胞菌在營養(yǎng)肉湯中過夜復蘇，挑取1環(huán)至10 mL滅菌鹽水中，制成10-1CFU的菌懸液，然后對其進行十倍稀釋，制成10-2～10-7CFU的菌液。用微量移液器移取100 μL分別涂布于銅綠假單胞菌顯色培養(yǎng)基、CN假單胞菌選擇性培養(yǎng)基和營養(yǎng)瓊脂，置36℃生化培養(yǎng)箱中，24 h后對各個培養(yǎng)基上銅綠假單胞菌的數(shù)量計數(shù)。比較各個培養(yǎng)基的靈敏度。

1.2.4 過濾系統(tǒng)的使用

按要求將0.45 μ m密理博濾膜、250 mL無菌濾杯、濾器、真空泵等抽濾設(shè)備組合，對水樣進行過濾。

1.2.5 加標水樣測試

將銅綠假單胞菌在營養(yǎng)肉湯中過夜復蘇，挑取1環(huán)至10 mL滅菌鹽水中，制成10-1CFU的菌懸液，然后對其進行十倍稀釋，制成10-5～10-7的菌液。各取0.2 mL菌液加入250 mL水樣中，過濾檢測，將濾膜移置銅綠假單胞菌顯色培養(yǎng)基和CN假單胞菌選擇性培養(yǎng)基上，在36±1 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～48 h，觀察計數(shù)，比較兩種培養(yǎng)基的檢驗效果。

1.2.6 實際水樣的的檢驗

采集瓶（桶）裝水、水源水、環(huán)境水和城市二次供水，共計100份，對其進行銅綠假單胞菌檢驗。將250 mL水用0.45 μm密理博濾膜過濾，可根據(jù)污染情況適當稀釋，過濾檢驗，將濾膜移置銅綠假單胞菌顯色培養(yǎng)基和CN假單胞菌選擇性培養(yǎng)基上，在36±1 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～48 h，比較銅綠假單胞菌在這兩種培養(yǎng)基的檢出效果。

1.3 銅綠假單胞菌的鑒定

從濾膜上挑取1～5個可疑菌落，銅綠假單胞菌在顯色培養(yǎng)基上呈藍綠色、1～2 mm菌落，CN假單胞菌選擇性培養(yǎng)基上呈褐色或有熒光的菌落。轉(zhuǎn)種到營養(yǎng)瓊脂（NA）平板上純化培養(yǎng)，置36±1 ℃生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)18～24 h。進行確證試驗 。

氧化酶試驗：取新配制的氧化酶試劑滴在干凈濾紙上，用玻璃棒將純化培養(yǎng)物涂布在濾紙上，顯深藍紫色的判為陽性反應。銅綠假單胞菌應為陽性反應。

金氏B試驗：將純化培養(yǎng)物轉(zhuǎn)種于金氏B培養(yǎng)基上，于36±1 ℃生化箱培養(yǎng)24～120 h。每天從培養(yǎng)箱中取出觀察是否產(chǎn)生熒光，將120 h內(nèi)有熒光產(chǎn)生的記為陽性。

乙酰胺試驗：將純化培養(yǎng)物轉(zhuǎn)種于乙酰胺培養(yǎng)基中，在36±1 ℃下培養(yǎng)過夜，后向培養(yǎng)物滴加1～2滴鈉氏試劑，如出現(xiàn)磚紅色現(xiàn)象則為陽性，反之為陰性。

最終的鑒定采用API 20NE生化鑒定條。

2 結(jié)果與討論

2.1 銅綠假單胞菌顯色培養(yǎng)基的特異性測試結(jié)果

2.1.1 顯色培養(yǎng)基生長情況

如表1所示，銅綠假單胞菌在顯色平板上生長較好，有藍綠色菌落。熒光假單胞菌顯色平板上為白色菌落。其他菌不能良好生長或被抑制，表明顯色平板對銅綠假單胞菌有良好的特異性。

2.1.2 抑菌性測試

將大腸埃希氏菌、糞鏈球菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌在營養(yǎng)肉湯中過夜復蘇，分別制成104～105CFU菌懸液，涂布于顯色平板上都不能生長，證明顯色平板可以有效抑制104～105CFU數(shù)量的雜菌。

2.1.3 培養(yǎng)基靈敏度測試

統(tǒng)計30～300 CFU之間的菌落數(shù)，使用SPSS統(tǒng)計分析軟件進行方差分析，比較三種平板上菌落數(shù)。如表2所示，銅綠假單胞菌在三種培養(yǎng)基上的生長數(shù)量無顯著差異（p=0.901＞0.05），顯色平板能達到國標中使用的傳統(tǒng)培養(yǎng)基（CN假單胞菌選擇性培養(yǎng)基）的相同效果和靈敏度。

表1 各菌株在顯色平板上的生長狀況

表2 銅綠假單胞菌在三種平板的菌落數(shù)

2.2 加標水樣測試

統(tǒng)計濾膜上30～300 CFU之間的菌落數(shù)，使用SPSS統(tǒng)計分析軟件進行方差分析，比較兩種培養(yǎng)基在濾膜上菌落數(shù)。如表3所示，銅綠假單胞菌在這兩種平板濾膜上的生長數(shù)量無顯著差異（p=0.716 0＞0.05），銅綠假單胞菌顯色平板能達到國標中使用的傳統(tǒng)培養(yǎng)基（CN假單胞菌選擇性培養(yǎng)基）的相同效果和靈敏度。

表3 加標水樣在濾膜上菌落結(jié)果

2.3 實際水樣的的檢驗

如表4所示，試驗采集瓶（桶）裝水、水源水、環(huán)境水和城市二次供水，共計100份，其中桶裝水樣檢出3株銅綠假單胞菌，水源水檢出2株銅綠假單胞菌，環(huán)境水桶裝水檢出1株銅綠假單胞菌，其他水樣的結(jié)果均是未檢出?？梢伤畼油ㄟ^過濾檢驗，濾膜上出現(xiàn)銅綠假單胞菌可疑菌落，經(jīng)純培養(yǎng)、初步鑒定、API 20NE鑒定試劑盒最終確認都是銅綠假單胞菌，兩種培養(yǎng)基的檢驗結(jié)果相同，表明銅綠假單胞菌顯色平板能達到國標中使用的傳統(tǒng)培養(yǎng)基（CN假單胞菌選擇性培養(yǎng)基）的相同效果。在實際檢驗中，銅綠假單胞菌顯色培養(yǎng)基可在24 h就能觀察結(jié)果，而CN假單胞菌選擇性培養(yǎng)基則需要培養(yǎng)到48 h方可觀察結(jié)果，在CN選擇性培養(yǎng)基上還出現(xiàn)4株假陽性的菌株，這些菌經(jīng)鑒定均是熒光假單胞菌，在顯色培養(yǎng)基上為白色菌落，能夠和銅綠假單胞菌在顯色培養(yǎng)基上的藍綠色菌落特征區(qū)分開，從而降低假陽性率。但在實際水樣檢驗中未發(fā)現(xiàn)顯色培養(yǎng)基有假陽性現(xiàn)象。

表4 實際水樣檢出銅綠假單胞菌的結(jié)果

3 結(jié)論

銅綠假單胞菌是水質(zhì)監(jiān)測重要指標之一，此菌能使人患病，被國內(nèi)外水質(zhì)標準[5]列為重要的致病菌項目，并規(guī)定了銅綠假單胞菌的限量。傳統(tǒng)方法一般使用CN假單胞菌選擇性培養(yǎng)基經(jīng)48 h培養(yǎng)后初步鑒定、純化、生化鑒定，檢驗周期太長，假陽性率很高。

因此，試驗采用銅綠假單胞菌顯色培養(yǎng)基經(jīng)培養(yǎng)24 h可通過菌落的形態(tài)大小、顏色即可做出判斷，大大節(jié)省了勞動力和時間，且其靈敏度、特異性測試均與傳統(tǒng)培養(yǎng)基效果一致，樣品檢驗假陽性率較低，檢驗效果很好。

由于試驗采集的樣本數(shù)量、種類有一定的局限性，只是對銅綠假單胞菌顯色培養(yǎng)基的在水中檢驗初步應用做了一個介紹，還需要大量的實際樣本數(shù)據(jù)對實驗應用的支持和補充，但這一檢驗系統(tǒng)的建立對于銅綠假單胞菌的快速檢驗有重大意義，對國內(nèi)水質(zhì)檢驗標準的起草制定有一定的指導作用，可顯著提高水質(zhì)檢驗水平，提高保障飲水和供水的安全