Box-Behnken法優(yōu)化人參皂苷Rg1、Re、Rb1提取工藝

趙立春，劉繼永

1. 中國農(nóng)業(yè)科學院特產(chǎn)研究所（長春 130112）；2. 農(nóng)業(yè)部特種動植物產(chǎn)品質(zhì)量安全風險評估實驗室（長春 130112）

人參（Panax ginseng C. A. Meyer）為五加科人參屬植物，其干燥根或根莖是享譽海內(nèi)外的滋補珍品，素有“百草之王”美譽。據(jù)現(xiàn)存最早的中醫(yī)學專著《神農(nóng)本草經(jīng)》中記載：“人參，味甘微寒，主補五臟，安精神，定魂魄，止驚悸，除邪氣，明目，開心益智。久服，輕身延年”[1-3]。經(jīng)大量研究發(fā)現(xiàn)，人參化學成分較為復雜，藥用價值巨大。人參皂苷作為主要活性成分，具有增強人體免疫、抗衰老、抗疲勞、治療心血管疾病等功效[4]。隨著先進儀器設備的使用，在其分離提純與結(jié)構(gòu)鑒定等方面取得了巨大的收獲。由早前的煎煮、浸漬法等單純物理提取，到超聲、超臨界提取法，再到多種儀器設備綜合使用，先后建立30多種人參皂苷的提取方法，且在不斷精進優(yōu)化[5-12]。

超聲提取人參皂苷方法簡便安全、成本低、污染較小，提取效率較高，深受廣大科研工作者的親睞[13]。試驗通過考察單因素對提取率的影響，設計Box-Behenken四因素三水平試驗，優(yōu)化人參皂苷提取工藝。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

人參（2017年9月采自吉林省萬良市，經(jīng)中國農(nóng)業(yè)科學院特產(chǎn)研究所劉繼永研究員鑒定，為5年生人參），于45 ℃恒溫干燥箱烘干至恒重，粉碎，過60目篩。

三氯甲烷、乙醇（均為分析純，國藥）；甲醇、乙腈（均為色譜純，美國Fisher）；人參皂苷標品Rg1（批號Z13O8L45576）、Re（批號B10M8S35243）、Rb1（批號Z16J9X52719）：上海源葉生物科技有限公司；超純水，電導率為0.1～0.055 μ s/cm；等。

1.2 儀器與設備

液-質(zhì)-質(zhì)聯(lián)用儀（美國Waters Xevo TQ）；十萬分之一電子天平（梅特勒-托利多 XSA205DU）；數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；DK-98-ⅡA電熱恒溫水浴鍋（天津泰斯特儀器有限公司）；多樣品平行蒸發(fā)儀（瑞士步琦 Syncore）；電熱鼓風干燥箱（上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠）；其他玻璃儀器（天津玻璃儀器廠）。

1.3 試驗方法

1.3.1 人參皂苷供試品制備

精密稱取5.000 g人參樣品，用濾紙包好，放于索氏回流提取器中，加入三氯甲烷回流提取3 h。殘渣揮干三氯甲烷。按照試驗要求加入一定比例的提取溶劑，浸泡過夜，超聲提取，過濾，棄去初濾液，精確量取25 mL濾液，減壓濃縮近干，用甲醇溶解定容至100 mL，過0.22 μ m有機濾膜，備用。

1.3.2 人參皂苷含量測定

1.3.2.1 混合對照品溶液的制備

精密稱取適量28種人參皂苷標準品，加入甲醇溶解配制成含人參皂苷Rg1 19.975 μg/mL、Re 19.396 μ g/mL和Rb1 19.4 μg/mL的混合對照品溶液。

1.3.2.2 色譜條件

色譜柱，ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；流動相，乙腈（A），0.01%甲酸水（B）；流速，0.5 mL/min；柱溫，35 ℃；樣品溫度，19 ℃；進樣量，2 μL。梯度洗脫程序：0～4.4 min，19%～19% A；4.4～6.4 min，19%～21% A；6.4～8.8 min，21%～28% A；8.8～13.6 min，28%～31% A；13.6～21.6 min，31%～46% A；21.6～23.2 min，46%～54% A；23.2～25.44 min，54%～54% A；25.44～25.84 min，54%～95% A；25.84～27 min，95%～95% A；27～27.5 min，95%～19% A；27.5～30 min，19%～19% A。

1.3.2.3 質(zhì)譜條件

離子源采用 HESI-源（Heated ESI-），載氣N2，毛細管電壓為-280 kV，錐孔反吹氣體流量為50 L/h，脫溶劑氣溫度為450 ℃，脫溶氣體流量為1 000 L/h，采用正負離子MRM掃描模式掃描分析，見表1。

表1 UPLC-MS操作質(zhì)譜條件

1.3.2.4 線性關(guān)系的考察

精密吸取1.3.2.1小節(jié)中混合對照品溶液，用甲醇依次稀釋成不同濃度梯度，以2 μL進樣量檢測，按一定采集條件，以濃度作橫坐標（X），峰面積作縱坐標（Y），繪制標準曲線，得到28種人參皂苷的回歸方程。

1.3.2.5 單因素試驗

以人參皂苷Rg1、Re、Rb1提取率作響應值，控制單因素變量，依次考察提取溶劑及濃度（水飽和正丁醇，40%，50%，60%，70%和80%乙醇）、料液比（1∶30，1∶40，1∶50，1∶60和1∶70（g/mL））、超聲功率（320，400，480，560和640 W）、超聲溫度（30，40，50，60和70 ℃）、超聲時間（20，30，40，50和60 min）、超聲次數(shù)（1，2，3和4次）對人參皂苷提取率的影響。

1.3.2.6 Box-Behenken法試驗設計

綜合單因素試驗，根據(jù)Box-Behenken設計原理，設計四因素三水平試驗表，即設計29個試驗點，包括24個分析點和5個零點。精確稱取5.000 g樣品，選擇試驗因素及其水平值，分析結(jié)果，優(yōu)化建立人參皂苷提取工藝。

2 結(jié)果與分析

2.1 標準品線性關(guān)系的考察（參見表2）

表2 人參皂苷的線性回歸方程

2.2 單因素試驗

2.2.1 提取溶劑對人參皂苷提取率的影響

按1.3.1小節(jié)操作步驟，以超聲功率320 W、料液比1∶50（g/mL）、超聲時間30min、超聲溫度30℃、超聲2次為試驗定量，考察水飽和正丁醇、乙醇（40%，50%，60%，70%和80%）對人參皂苷提取率的影響，結(jié)果見表3。當提取溶劑為70%乙醇時，3種皂苷的提取量最高，且色譜圖峰形較好，響應值較高，無雜質(zhì)峰干擾。故選定提取溶劑為70%乙醇。

表3 提取劑對人參皂苷提取率的影響

2.2.2 超聲次數(shù)對于人參總皂苷提取率的影響

按1.3.1小節(jié)操作步驟，以70%乙醇作提取劑、超聲功率320 W、料液比1∶50（g/mL）、超聲時間30 min、超聲溫度30 ℃為試驗定量，考察超聲次數(shù)對人參皂苷提取率的影響，結(jié)果見表4。當超聲次數(shù)為3和4次時，3種人參皂苷的提取率最高。但是由于超聲4次時，與超聲3次的差別太小，即浪費時間，成本又高。故選擇超聲3次作為試驗條件。

表4 超聲次數(shù)對人參皂苷提取率的影響

2.2.3 超聲功率對人參皂苷提取率的影響

按1.3.1小節(jié)操作步驟，以70%乙醇作提取劑，超聲3次，以料液比1∶50（g/mL）、超聲時間30 min、超聲溫度30 ℃為試驗定量，考察超聲功率對人參皂苷提取率的影響，結(jié)果見表5。3種人參皂苷的提取率走勢大致相同，當超聲功率為480 W時，提取率達到最大值。故選擇320，480和640 W作因素水平，對應編碼值為-1，0和+1。

表5 超聲功率對人參皂苷提取率的影響

2.2.4 超聲溫度對于人參皂苷提取率的影響

按1.3.1小節(jié)操作步驟，以70%乙醇作提取劑，超聲3次，以超聲功率480 W、料液比1∶50（g/mL）、超聲時間30 min為試驗定量，考察超聲溫度對人參皂苷提取率的影響，結(jié)果見表6。當超聲溫度為60 ℃時，3種人參皂苷的提取率最高。將溫度的50，60和70 ℃作因素水平值，對應編碼值為-1，0和+1。

表6 溫度對人參皂苷提取率的影響

2.2.5 料液比對于人參皂苷提取率的影響

按1.3.1小節(jié)操作步驟，以70%乙醇作提取劑，超聲3次，以超聲功率480 W、超聲溫度60 ℃、超聲時間30 min為試驗定量，考察料液比對人參皂苷提取率的影響，結(jié)果見表7。當料液比為1∶50（g/mL）時，3種人參皂苷的提取率最高。將料液比1∶30，1∶50和1∶70（g/mL）作因素水平值，對應編碼值為-1，0和+1。

2.2.6 超聲時間對于人參皂苷提取率的影響

按1.3.1小節(jié)操作步驟，以70%乙醇作提取劑，超聲3次，超聲功率480 W、超聲溫度60 ℃、料液比1：50（g/mL）為試驗定量，考察超聲時間對人參皂苷提取率的影響，結(jié)果見表8。當超聲時間為30 min時，3種人參皂苷的提取率最高。將超聲時間20，30和40 min作因素水平值，對應編碼值為-1，0和+1。

表7 料液比對人參皂苷提取率的影響

表8 超聲時間對人參皂苷提取率的影響

2.3 工藝條件優(yōu)化的響應面分析結(jié)果

根據(jù)表9安排試驗，最終試驗結(jié)果如表10所示。

表9 Box-Behenken法試驗各因素水平

表10 Box-Behnken試驗結(jié)果

利用SAS 9.2分析Box-Behnken試驗所得出的3種人參皂苷提取率，進行多元回歸擬合，得到人參皂苷提取率（Y）對于超聲功率（X1）、超聲溫度（X2）、料液比（X3）和超聲時間（X4）的多元二次回歸方程。

2.3.1 人參皂苷Rg1的響應面優(yōu)化

考察超聲提取人參皂苷Rg1的影響因素及其交互作用對提取率的影響。

由表11可知，其預測模型的p＜0.001，表明影響極顯著；其失擬項p=0.153 8＞0.05，不顯著，說明其擬合較好，能夠說明模型對真實值情況的模擬較為準確。綜上，該預測模型可以用于人參皂苷Rg1的提取工藝的優(yōu)化。所得到的多元二次回歸方程為：Y=-23.66+0.207 5X1+0.499 6X2+8.881×10-2X3+0.206 2X4-3.75×10-5X1X2-6.25×10-6X1X3-3.75×10-5X2X3-5.0×10-5X1X4+5.0×10-5X2X4+3.75×10-5X3X4-1.681×10-3X12-4.148×10-3X22-9.03×10-4X32-3.411×10-3X42。R2=0.996 8，接近于1，模擬程度較好。

表11 人參皂苷Rg1響應面回歸模型的方差分析

圖1 各因素間交互作用對于人參皂苷Rg1提取率的響應曲面圖

通過SAS 9.2軟件響應面設計分析所得到曲面圖，如圖1所示。圖1中①，②和③的交互作用對于人參皂苷Rg1的影響較大，其余影響較小。采用SAS 9.2軟件計算所得，當超聲功率為484 W，超聲溫度為60.3℃，料液比為1∶50.8（g/mL），超聲時間為30.5 min時，人參皂苷Rg1含量為3.1 mg/g。

2.3.2 人參皂苷Re的響應面優(yōu)化

由表12可知，其預測模型的p＜0.001，表明影響極顯著；其失擬項p值為0.141 7，說明其擬合較好，能夠說明模型對真實值情況的模擬較為準確。綜上，該預測模型可以用于人參皂苷Re的提取工藝的優(yōu)化。所得到的多元二次回歸方程為：Y=-13.16+7.538×10-2X1+0.344 9X2+5.558×10-2X3+8.718×10-2X4+2.5×10-5X1X2-2.5×10-5X1X3-6.25×10-5X2X3-3.75×10-5X1X4-1.75×10-4X2X4-1.75×10-4X3X4-6.05×10-42.781×10-3-4.3×10-4-1.031×10-3。R2=0.941 2，接近于1，模擬程度較好。

表12 人參皂苷Re響應面回歸模型的方差分析

圖2 各因素之間交互作用對于人參皂苷Re提取率的響應曲面圖

通過SAS軟件響應面設計分析所得到曲面圖，如圖2所示。除圖2中①對人參皂苷Re的影響較明顯外，其余影響所形成曲面圖形狀大致相同，影響不大。采用SAS 9.2軟件計算所得，當超聲功率為492.32 W，超聲溫度為60.71 ℃，料液比為1∶52.05（g/mL），超聲時間為31.59 min時，人參皂苷Rg1含量為2.45 mg/g。

2.3.3 人參皂苷Rb1的響應面優(yōu)化

由表13可知，其預測模型的p＜0.001，表明影響極顯著；其失擬項p=0.417 6，說明其擬合較好，能夠說明模型對真實值情況的模擬較為準確。綜上，該預測模型可以用于人參皂苷Rb1的提取工藝的優(yōu)化。所得到的多元二次回歸方程為：Y=-14.49+0.169 8X1+0.353 7X2+4.429×10-2X3+5.226×10-2X4-2.5×10-5X1+8.75×10-5X2X3-6.25×10-5X1X4-2.5×10-5X2X4-1.0×10-4XX-1.371×10-3X2+9.222×10-5-4.4×10-4-3416.47×10-4。R2=0.988 8，接近于1，模擬程度較好。

表13 人參皂苷Rb1響應面回歸模型的方差分析

圖3 各因素之間交互作用對于人參皂苷Rb1提取率的響應曲面圖

通過SAS軟件響應面設計分析所得到曲面圖，如圖3所示。圖3中①，②和③圖對人參皂苷Re的影響較明顯，其余影響所形成曲面圖較平緩，影響不大。采用SAS 9.2軟件所得，當超聲功率為484.96 W，超聲溫度為60.91 ℃，料液比為1∶52.73（g/mL），超聲時間為32.19 min時，人參皂苷Rg1含量為3.44 mg/g。

2.4 提取工藝比較

根據(jù)Box-Behnken設計試驗結(jié)果，最終得到3種人參皂苷Rg1、Re、Rb1的最佳提取工藝參數(shù)，其結(jié)果見表14。分析3種人參皂苷的提取條件，依據(jù)實際情況獲得提取3種皂苷的實際參數(shù)。

表14 3種人參皂苷的提取工藝的比較

2.5 工藝驗證試驗

參照2.3小節(jié)，并按照1.3.2小節(jié)進行超高液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測，分別進行3批驗證試驗，結(jié)果見表15，真實的人參皂苷提取率與模型預測值RSD低于2.86%，說明試驗的重復性較好。

3 結(jié)論

超聲提取人參皂苷是現(xiàn)在較為常用的一種提取人參皂苷的方法，操作簡便，耗時較短，成本低廉，能夠滿足現(xiàn)在實驗室的人參皂苷的提取檢測要求。以70%乙醇作提取劑，超聲3次，當超聲功率為480 W，溫度為60 ℃，料液比為1∶50（g/mL），超聲時間為30 min時，人參皂苷Rg1、Re、Rb1的提取率達到最高，分別為3.10，3.44和2.45 mg/g。且28種人參皂苷的回收率在82%～103%之間，回收率較好。該方法能夠滿足試驗需求，同時為多種人參皂苷的提取提供了技術(shù)參考，又為人參工業(yè)化生產(chǎn)提供了理論參考。