大孔樹脂分離純化茶枯餅中的茶皂素

何榮榮，陳獻(xiàn)翔，陳海明，譚運(yùn)壽，陳衛(wèi)軍*，鐘秋平*

1. 海南大學(xué)食品學(xué)院（?？?570228）；2. 海南侯臣生物科技有限公司（澄邁 571921）

茶皂素主要來源于油茶籽榨油剩下的油茶粕，具有良好的表面活性作用和藥理功能，在食品、日化、醫(yī)藥等領(lǐng)域應(yīng)用十分廣泛[1-6]。市售的茶皂素常因顏色深、純度低、含有多糖和蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，影響其在實(shí)際生產(chǎn)中的開發(fā)和利用，因此進(jìn)一步分離純化茶皂素十分必要。茶皂素的純化方法有化學(xué)沉淀法、雙水相法、膜富集法、大孔樹脂法等，膜富集法對設(shè)備要求較高，成本較大；雙水相法需要用到高聚物和無機(jī)鹽且后續(xù)脫鹽困難，不適宜大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)[7-8]；化學(xué)沉淀法溶劑消耗大，環(huán)境污染嚴(yán)重。而大孔樹脂法具有比表面積大、條件溫和、穩(wěn)定性高、選擇性好、再生簡單、耗能低、易于自動化、環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)[9]，彌補(bǔ)了傳統(tǒng)的化學(xué)沉淀法和膜分離法的不足[10]，被廣泛應(yīng)用于天然產(chǎn)物的提取與分離。目前，關(guān)于利用大孔樹脂純化茶皂素的研究已有文獻(xiàn)報道，但研究主要集中在對純化工藝的探索和優(yōu)化上，鮮有結(jié)合吸附動力學(xué)的報道。因此，試驗(yàn)以海南產(chǎn)茶枯餅中茶皂素的粗提物為原料，以大孔樹脂X-5為吸附試材，研究其對茶皂素的吸附動力學(xué)特征和純化條件，以期為大孔樹脂分離純化茶皂素提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

茶枯餅（熱壓法）：由海南侯臣生物科技有限公司提供。茶皂素標(biāo)準(zhǔn)品（北京索萊寶科技有限公司）；大孔樹脂（鄭州勤實(shí)科技有限公司）；乙醇、濃硫酸（廣州化學(xué)試劑廠）；香蘭素（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；除標(biāo)準(zhǔn)品外其余均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州澳華儀器有限公司）；XX型粉碎機(jī)（永康市小寶電器有限公司）；TU-1810型紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限公司）；T6型紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限公司）；Christ Alpha1型凍干機(jī)（德國Christ公司）；SHA-2型恒溫振蕩器（常州澳華儀器有限公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 茶皂素定量分析

稱取20 mg茶皂素標(biāo)品，用80%乙醇溶解，配置成質(zhì)量濃度為0.4 mg/mL的母液，按照李靜等[11]的方法光譜掃描得出最大吸收波長468 nm。

分別吸取0.05，0.15，0.25，0.35和0.45 mL上述標(biāo)準(zhǔn)溶液，相同的步驟，得出標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：y=18.712x+0.035 8，R2=0.999 9。

1.3.2 茶皂素粗品的制備

用研缽將茶枯餅初步搗碎，然后經(jīng)中藥粉碎機(jī)粉碎，過60目篩后置于干燥器中備用。準(zhǔn)確稱取一定量的茶餅粉，加入67%乙醇，料液比為1∶17（g/mL），于178 W超聲輔助提取36 min，過濾，氮?dú)獯蹈梢掖?，冷凍干燥后置于密封袋中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 大孔樹脂的預(yù)處理[12]

取一定量的樹脂，加入蒸餾水，浸泡24 h，經(jīng)蒸餾水反復(fù)沖洗后，用95%乙醇浸泡72 h以除去醇溶物，再分別用5%的鹽酸和5%的NaOH溶液浸泡24 h，用蒸餾水洗至中性，備用。

1.3.4 靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)

稱取0.5 g茶皂素粗品，定容至50 mL。準(zhǔn)確稱取3 g預(yù)處理后的濕樹脂于150 mL錐形瓶中，加入50 mL茶皂素溶液，分別置于30，40和50 ℃的恒溫?fù)u床中，在150 r/min的條件下進(jìn)行振蕩吸附，每間隔10 min取樣，測定上清液中茶皂素的濃度，直到吸附平衡。按式（1）和（2）計算吸附量（qe）和吸附率（E）。

式中：qe表示平衡吸附量，mg/g；C0表示茶皂素的初始質(zhì)量濃度，mg/mL；Ce表示茶皂素吸附平衡時的濃度，mg/mL；Vi表示茶皂素濃縮液的體積，mL；W表示樹脂的質(zhì)量，g；E表示吸附率，%。

大孔樹脂吸附茶皂素的動力學(xué)模型有一級動力學(xué)模型、二級動力學(xué)模型和顆粒擴(kuò)散動力學(xué)模型。采用上述3種模型來描述吸附過程，模型如式（3）、（4）和（5）所示[13]：

式中：qe表示平衡吸附量，mg/g；qt表示t時刻的吸附量，mg/g；K1表示準(zhǔn)一級動力學(xué)速率常數(shù)，min-1；K2表示準(zhǔn)二級動力學(xué)速率常數(shù)，g/（mg·min）；Kd表示顆粒擴(kuò)散動力學(xué)速率常數(shù)，mg/（g·min0.5）；C為常數(shù)。

1.3.5 吸附等溫線

準(zhǔn)確稱取3 g預(yù)處理后的濕樹脂X-5于150 mL錐形瓶中，分別稱取0.1，0.3，0.6，0.9，1.2，1.5，1.8和2.1 g茶皂素并定容至50 mL，依次加入150 mL錐形瓶中，于不同溫度（20，30，40和50 ℃）的搖床中振蕩，測定平衡時的茶皂素質(zhì)量濃度，建立吸附等溫線。

采用Langmuir模型和Langmuir模型來描述吸附平衡[14-17]，公式如（6）和（7）所示：

式中：Ce表示吸附平衡時的茶皂素質(zhì)量濃度，mg/mL；qm表示最大吸附量，mg/g；qe表示平衡吸附量，mg/g；KL表示Langmuir常數(shù)，mL/mg；KF表示Freundlich常數(shù)，[（mg/g）·（mL/mg）]1/n；n為表示吸附能力的表觀常數(shù)。

1.3.6 動態(tài)吸附與解析

1.3.6.1 X-5大孔樹脂的裝柱

將已處理好的樹脂濕法裝入固定好的玻璃層析柱中（Φ 30 mm×300 mm），柱體積為60 mL，待樹脂自然沉降后，先用80%乙醇清洗柱子約1個柱體積，再用去離子水洗至流出液呈無色，清洗時確保柱內(nèi)液面與樹脂表面的高度差保持在2 cm以上[18]。

1.3.6.2 上樣量的篩選

將體積為210 mL的茶皂素溶液以流速為1 mL/min的流速上柱，每10 mL收集一管，測定每管中茶皂素的濃度，繪制茶皂素泄漏曲線，確定茶皂素最大上樣量。

1.3.6.3 上樣流速的篩選

通過調(diào)整恒流泵的轉(zhuǎn)速，使上樣流速分別為0.5，1，1.5和2 mL/min，一邊上樣一邊收集下端的流出液，每0.5個柱體積（BV）收集一管，測定其中茶皂素濃度，確定最佳上樣流速。

1.3.6.4 洗脫梯度篩選

分別采用蒸餾水、20%乙醇、40%乙醇、60%乙醇和80%乙醇依次洗脫，控制洗脫流速為1 mL/min，每個梯度洗脫3 BV，收集各梯度的洗脫液并計算解析率，確定最佳的洗脫梯度。

1.3.6.5 洗脫流速的篩選

調(diào)整恒流泵的轉(zhuǎn)速，使洗脫液流速分別為1，2和3 mL/min，依次使用蒸餾水、40%乙醇、80%乙醇進(jìn)行洗脫，每個梯度洗脫3 BV，每0.5個柱體積（BV）收集一管，測定茶皂素的濃度，確定最佳洗脫流速。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用DPS的單因素方差分析進(jìn)行差異性分析（p＜0.05），使用Origin 2017進(jìn)行方程擬合并繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 吸附動力學(xué)

2.1.1 吸附動力學(xué)曲線

大孔樹脂X-5對茶皂素在不同溫度下不同時間內(nèi)的吸附量變化趨勢相似（圖1），在60 min之前隨著吸附時間的延長，茶皂素吸附量迅速增加，為快速吸附階段；在60～100 min之間，吸附量增加緩慢，為未飽和吸附階段；在100 min時茶皂素吸附量基本達(dá)到吸附平衡；100 min以后為飽和吸附階段[19]。

由表1可知，不同溫度下一級動力學(xué)模型有較好的線性相關(guān)性（R2最大），其次是顆粒擴(kuò)散動力學(xué)模型，說明一級動力學(xué)方程能更好描述該吸附模型，由一級動力學(xué)方程計算出的K1值在溫度為50 ℃時達(dá)到最大值。

2.1.2 吸附等溫線

進(jìn)一步研究X-5樹脂對茶皂素的吸附特性，結(jié)果如圖2所示。大孔樹脂X-5的平衡吸附量隨茶皂素濃度的增加而增加，當(dāng)平衡濃度為15.45 mg/mL時，平衡吸附量達(dá)到最大值。

圖1 不同溫度下大孔樹脂的吸附動力學(xué)曲線

表1 大孔樹脂對茶皂素的吸附動力學(xué)參數(shù)

圖2 X-5樹脂在不同溫度條件下對茶皂素的吸附等溫線

由表2可知，與Langmuir模型相比，F(xiàn)reundlich模型的擬合度較高，說明Freundlich方程更能準(zhǔn)確反映該吸附過程。由Freundlich方程擬合得到的參數(shù)可知，KF隨著溫度的增加而增加；1/n值均在0.1～0.5之間，表明茶皂素在X-5上的吸附很容易發(fā)生[20]。

表2 大孔樹脂對茶皂素的吸附等溫線參數(shù)

2.2 動態(tài)吸附、洗脫條件的確定

2.2.1 上樣體積和上樣流速的篩選

由圖3（A）可知，當(dāng)上樣量增加到60 mL時，茶皂素開始泄漏，因此選取60 mL作為最大上樣體積。從圖3（B）可知，當(dāng)上樣流速從0.5 mL/min增加到2 mL/min時，茶皂素泄漏得越來越快，在最大上樣量之前，流速0.5 mL/min與1 mL/min時的茶皂素泄漏速度相近，綜合考慮選擇1 mL/min為最佳上樣流速。

圖3 上樣體積和上樣流速對純化的影響

2.2.2 洗脫梯度和洗脫流速的篩選

由圖4（A）可知，茶皂素的解析率隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大而增大。使用60%和80%乙醇洗脫時，解析率均在80%以上，但用60%乙醇洗脫后仍有部分茶皂素殘留在樹脂中，造成原料的浪費(fèi)，因此考慮采用的洗脫梯度：蒸餾水→40%乙醇→80%乙醇。由圖4（B）可知，當(dāng)洗脫流速為1 mL/min時，洗脫峰基本可以分離，峰型尖銳，對稱性良好且無拖尾現(xiàn)象。當(dāng)洗脫流速增大時，洗脫峰開始變寬，流速為3 mL/min甚至出現(xiàn)了拖尾的現(xiàn)象。而流速2 mL/min的洗脫峰型與1 mL/min的峰型相近。綜合考慮，選擇洗脫流速2 mL/min為最佳洗脫流速。

圖4 洗脫梯度和洗脫流速對純化的影響

3 結(jié)論

此次試驗(yàn)研究表明：大孔樹脂X-5動態(tài)吸附的最佳條件為上樣濃度15.45 mg/mL、上樣量60 mL、上樣流mL/min；最佳洗脫條件為依次用蒸餾水、40%乙醇、80%乙醇進(jìn)行洗脫，每個梯度洗脫3個柱體積，洗脫流速2 mL/min，在此條件下茶皂素純度可以達(dá)到85.40%左右（純化前為27.68%），回收率可達(dá)77.13%。通過對X-5樹脂純化茶皂素動力學(xué)的研究發(fā)現(xiàn)，X-5樹脂對茶皂素的吸附更符合一級動力學(xué)模型。Freundlich方程能較好地擬合X-5對茶皂素的吸附過程。此次研究所得到茶皂素純度還有進(jìn)一步提升的空間，因此對茶皂素進(jìn)行單體分離、純化及分子鑒定，將是后續(xù)研究的重要內(nèi)容。