DNA條形碼技術(shù)在動(dòng)物類中藥鑒定中的應(yīng)用研究進(jìn)展

馮紅英

動(dòng)物類中藥材具有療效突出、不良反應(yīng)發(fā)生率低等特點(diǎn)，在我國(guó)中醫(yī)藥行業(yè)中占據(jù)重要地位。動(dòng)物類中藥材大多來源于動(dòng)物的不同組織或者器官，如：干燥全體、角、甲、殼、骨等，傳統(tǒng)性狀鑒定應(yīng)用具有局限性。分子鑒定技術(shù)為動(dòng)物類中藥材的鑒定提供了新的技術(shù)手段。DNA條形碼鑒定技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)對(duì)物種進(jìn)行快速鑒定，成功突破了傳統(tǒng)中藥鑒定技術(shù)對(duì)專業(yè)知識(shí)的要求。筆者對(duì)DNA條形碼技術(shù)在動(dòng)物類中藥鑒定中的應(yīng)用研究進(jìn)展展開綜述，為保護(hù)珍稀藥用動(dòng)物中藥資源提供理論依據(jù)。

1 DNA條形碼技術(shù)

DNA 條形碼的概念由加拿大動(dòng)物學(xué)家Paul Hebert首次提出，是指使用一段較短的、標(biāo)準(zhǔn)的、易擴(kuò)增的DNA片段對(duì)物種進(jìn)行快速、準(zhǔn)確、標(biāo)準(zhǔn)化的鑒定。DNA條形碼是以DNA序列為檢測(cè)對(duì)象，在物種個(gè)體發(fā)育過程中DNA序列不會(huì)改變，樣本受損也不會(huì)影響DNA識(shí)別結(jié)果；DNA條形碼技術(shù)是可以機(jī)械重復(fù)；DNA條形碼技術(shù)用于物種鑒別具有較高的準(zhǔn)確性；還可以建立DNA條形碼數(shù)據(jù)庫，可以實(shí)現(xiàn)一次性快速鑒別物種樣本。DNA條形碼技術(shù)用于動(dòng)物類中藥鑒定的主要技術(shù)流程為：采集樣品→處理樣品→提取DNA→設(shè)計(jì)、合成引物→提交結(jié)果至數(shù)據(jù)庫進(jìn)行分析。主要分析方法有序列比對(duì)、系統(tǒng)樹構(gòu)建、條形碼間距檢驗(yàn)等。

2 DNA條形碼在動(dòng)物類中藥鑒定的應(yīng)用現(xiàn)狀

在動(dòng)物類中藥材中，COI序列是公認(rèn)的DNA條形碼標(biāo)準(zhǔn)序列，有研究者提出將ITS2序列作為動(dòng)物類中藥材鑒定中的輔助序列。本文根據(jù)動(dòng)物類中藥的藥用部位分類，總結(jié)與闡述DNA條形碼在動(dòng)物類中藥鑒定的應(yīng)用現(xiàn)狀。

2.1 肌肉類中藥材肌肉類中藥材指的是入藥部位為動(dòng)物干燥全體、器官、肌肉纖維類中藥，此類中藥的DNA條形碼鑒定應(yīng)用比較廣泛，如蜈蚣、全蝎、蛤蚧、水蛭等中藥材。蜈蚣具有息風(fēng)止痙、攻毒散結(jié)、通絡(luò)止痛的功效，常與全蝎相須為用，蜈蚣、全蝎功效顯著，在藥材市場(chǎng)上摻偽品較多，在蜈蚣的傳統(tǒng)鑒別上，主要是根據(jù)蜈蚣的體型大小、背板顏色、步足等性狀特征[1]，鑒別準(zhǔn)確度較低，DNA分子鑒定已經(jīng)廣泛應(yīng)用于蜈蚣的基原鑒定。張紅印等[2]采用DNA條形碼技術(shù)鑒定蜈蚣藥材，基于COI條形碼技術(shù)對(duì)蜈蚣藥材進(jìn)行DNA提取，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，雙向測(cè)序，使用MEGA6.0軟件進(jìn)行序列比對(duì)、遺傳距離分析以及構(gòu)建系統(tǒng)聚類數(shù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)使用COI序列條形碼可以準(zhǔn)確鑒別蜈蚣藥材正品以及摻偽品，可以有效用于蜈蚣藥材的質(zhì)量控制與監(jiān)控。蛇類中藥材是中醫(yī)藥資源的寶庫，來源復(fù)雜,金錢白花蛇沒有毒性，在臨床上具有廣泛的應(yīng)用[3]。廖婧等[4]通過分子鑒定技術(shù)構(gòu)建華南地區(qū)20余種常用蛇類中藥材的DNA條形碼數(shù)據(jù)庫，主要用于蛇類中藥材的分子鑒定；該研究者還應(yīng)用DNA條形碼技術(shù)快速鑒別金錢白花蛇及其偽品。張紅印等[5]利用COI序列作為條形碼序列，對(duì)蛤蚧中藥材以及摻偽品進(jìn)行DNA提取，進(jìn)行PCR擴(kuò)增以及雙向測(cè)序，采用MEGA6.0對(duì)蛤蚧藥材所有11個(gè)物種的103份樣品進(jìn)行序列比對(duì)，構(gòu)建鄰接樹，基于COI序列構(gòu)建的鄰接樹中蛤蚧正品單獨(dú)聚在一起，可與蛤蚧偽品進(jìn)行準(zhǔn)確區(qū)分，為保障蛤蚧中藥材的臨床用藥安全以及藥材市場(chǎng)監(jiān)控提供有效方法。呂盼等[6]采用PCR技術(shù)，基于COI序列對(duì)水蛭科動(dòng)物藥材水蛭、螞蟥、柳葉螞蟥以及各地方常用品種進(jìn)行分子鑒定，構(gòu)建水蛭的DNA條形碼分子鑒定方法。地龍具有清熱定驚、通絡(luò)、平喘、利尿的功效，馬梅等[7]收集地龍藥材及其易混品種，提取DNA，得到COI和16SrRNA序列，經(jīng)MEGA6.0軟件分析，構(gòu)建地龍中藥材及其摻偽品的鄰接樹，結(jié)果發(fā)現(xiàn)地龍正品藥材以及混淆品種間COI和16SrRNA序列存在較多的變異位點(diǎn)，16SrRNA、COI序列可以準(zhǔn)確區(qū)分地龍藥材及其摻偽品。

2.2 角骨類中藥材角骨類中藥材是指藥用部位為動(dòng)物的角、骨、刺、甲等藥材的總稱，這類藥材的DNA含量較小，提取難度較大。鹿茸具有益氣強(qiáng)志、補(bǔ)血的功效，價(jià)格比較昂貴，在中藥材市場(chǎng)上摻偽品較多，目前DNA分子鑒定技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用到鹿茸、鹿角類中藥材的鑒定[8]。劉冬等[9]對(duì)鹿茸、鹿角、鹿鞭、鹿筋、鹿尾、鹿胎分別進(jìn)行DNA提取、COI序列擴(kuò)增和序列測(cè)定，構(gòu)建鹿類藥材COI序列數(shù)據(jù)庫，并對(duì)市售鹿類中藥材進(jìn)行調(diào)查分析。DNA 條形碼技術(shù)可以作為鹿類中藥材的有效鑒定技術(shù)，并為市售鹿類中藥材的鑒定提供科學(xué)依據(jù)。王淼等[10]采用改良鹽析法從龜甲樣品中提取DNA，采用PCR技術(shù)鑒別中藥材龜甲真?zhèn)纹?，改法具有特異性高、鑒別簡(jiǎn)單快捷、具有較強(qiáng)實(shí)用性的優(yōu)點(diǎn),在中藥材龜甲的真?zhèn)舞b別上具有較高的應(yīng)用價(jià)值。崔麗娜等[11]研究龜甲及其摻偽品的原動(dòng)物COI序列,采用MEGA 4.0軟件進(jìn)行遺傳距離分析，并構(gòu)建龜甲及其混淆品種的NJ樹，為龜甲中藥材的準(zhǔn)確鑒定提供了有效的分子遺傳標(biāo)記方法。穿山甲是我國(guó)的一種名貴中藥材，市場(chǎng)需求量較大，賈靜等[12]驗(yàn)采用試劑盒法提取穿山甲及其混偽品的DNA，采用COI序列作為DNA條形碼對(duì)穿山甲及其摻偽品進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定，為穿山甲的分子鑒定提供了科學(xué)依據(jù)。

2.3 其他類中藥材在貝殼類中藥材的鑒定上，使用DNA條形碼鑒定此類中藥材，多選取新鮮活體作為研究對(duì)象，進(jìn)行DNA條形碼分類分析[13]。膠類中藥材多屬于貴重類中藥，由于炮制加工方法特殊，摻偽現(xiàn)象普遍存在，鑒別難度較大，DNA分子鑒定可以實(shí)現(xiàn)快速、準(zhǔn)確鑒別膠類中藥材。阿膠是我國(guó)傳統(tǒng)的名貴中藥，被列為“補(bǔ)血圣藥”，阿膠是驢皮熬制的固體膠，價(jià)格昂貴，在中藥材市場(chǎng)上摻偽品較多，羅暉明等[14]采用PCR-RFLP法，以Cytb基因?yàn)槟繕?biāo)基因，驢源性成分Cytb的PCR產(chǎn)物能夠被限制性內(nèi)切Ⅰ酶切成76 bp和314bp 2個(gè)片段，而摻偽品的源性成分均不能夠被酶切，DNA條形碼技術(shù)可以準(zhǔn)確鑒別阿膠原料驢源性成分。

3 小結(jié)

一些動(dòng)物藥材，如骨骼類中藥材、分泌物等DNA含量較低，在應(yīng)用DNA分子鑒定時(shí)，需要采取改良的DNA提取方法[15]。還有一些動(dòng)物類中藥材，經(jīng)過蒸煮、干燥等處理后，DNA降解比較嚴(yán)重，研究者開發(fā)出多種DNA條形碼序列[16]，可用于輔助區(qū)分COI序列無法準(zhǔn)確鑒別的動(dòng)物類中藥材。DNA條形碼數(shù)據(jù)庫是動(dòng)物類中藥材分子鑒定的重要參考依據(jù)，但許多中藥材基源動(dòng)物的DNA條形碼序列尚未被 Gen-Bank數(shù)據(jù)庫收錄[17]。今后應(yīng)進(jìn)一步拓展DNA條形碼技術(shù)在動(dòng)物類中藥材中的研究范圍，針對(duì)特殊中藥材應(yīng)開發(fā)出更加有效的檢測(cè)方法，完善基礎(chǔ)數(shù)據(jù)庫建設(shè)以及相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的制定，推動(dòng)動(dòng)物類中藥材分子鑒定和產(chǎn)業(yè)化的深入發(fā)展。