銅綠假單胞菌相關(guān)sRNA研究進(jìn)展*

李虹霖 綜述，陳 茶 審校

(1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，廣東廣州 510006；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)部，廣東廣州 510006)

細(xì)菌調(diào)控小RNA(sRNA)是一類長(zhǎng)度為50～500個(gè)堿基的RNA，廣泛分布于各類細(xì)菌中，不含開放閱讀框，通常由基因間區(qū)轉(zhuǎn)錄而來(lái)，也有小部分位于基因編碼5′和3′UTR區(qū)[1]。sRNA通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)與靶基因或靶標(biāo)蛋白質(zhì)結(jié)合，影響信使RNA(mRNA)的穩(wěn)定，從而參與基因的轉(zhuǎn)錄后表達(dá)調(diào)控，發(fā)揮多種生物學(xué)功能[2]。例如，在致病菌的新陳代謝、脂多糖修飾、生物膜形成、外膜蛋白合成、毒力產(chǎn)生、耐藥性和群體感應(yīng)等多個(gè)方面發(fā)揮重要調(diào)控作用[3-4]。近年來(lái)，研究者主要通過(guò)生物信息學(xué)模型預(yù)測(cè)sRNA的存在和可能的靶點(diǎn)，隨著sRNA研究的深入，sRNA的功能研究逐漸成為研究熱點(diǎn)。然而目前針對(duì)sRNA特別是銅綠假單胞菌相關(guān)sRNA的研究大都停留在新的sRNA鑒定方面，僅有少部分sRNA的功能被闡明。本文將在現(xiàn)有的理論和研究基礎(chǔ)上，從銅綠假單胞菌相關(guān)sRNA的概念、分類、作用機(jī)制及生物學(xué)功能等方面進(jìn)行闡述，旨在為銅綠假單胞菌sRNA進(jìn)一步研究提供參考。

1 sRNA的分類

細(xì)菌sRNA的長(zhǎng)度較短，其編碼基因大都位于基因間區(qū)。sRNA具有獨(dú)立的轉(zhuǎn)錄單元，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物通常不需要經(jīng)過(guò)加工。按作用方式，大致可將sRNA分為3種:(1)與蛋白質(zhì)結(jié)合的調(diào)控sRNA；(2)與mRNA相互作用的調(diào)控sRNA：反式編碼sRNA、順式編碼sRNA；(3)規(guī)律成簇間隔短回文重復(fù)序列系統(tǒng)(CRISPRS/Cas)相關(guān)sRNA。

2 細(xì)菌sRNA的作用機(jī)制

隨著生物信息及全基因組RNAseq技術(shù)的開發(fā)和改進(jìn)，細(xì)菌中已鑒定的sRNA數(shù)量激增，但其在各種調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的功能表征仍處于起步階段。sRNA發(fā)揮調(diào)控作用，主要通過(guò)以下兩種方式：(1)與相應(yīng)的靶mRNA進(jìn)行堿基互補(bǔ)配對(duì)，阻礙或促進(jìn)蛋白質(zhì)的翻譯，以調(diào)控目的基因的表達(dá)；(2)與調(diào)控蛋白結(jié)合，影響蛋白構(gòu)象，使其無(wú)法與靶mRNA結(jié)合，從而調(diào)控基因表達(dá)。

2.1sRNA與mRNA堿基互補(bǔ)配對(duì) 反式編碼sRNA與其靶基因起源于不同的轉(zhuǎn)錄位點(diǎn)，在染色體上的位置距離靶基因較遠(yuǎn)，與靶基因僅有部分互補(bǔ)。反式編碼sRNA的一般機(jī)制是通過(guò)與Shine-Dalgarno(SD)序列或起始密碼子堿基配對(duì)來(lái)隔離靶mRNA的核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS)，并且還可以與靶序列的編碼序列相互作用，抑制翻譯起始；與RNase形成核糖核蛋白復(fù)合體，作用于靶mRNA的RBS，降解靶mRNA，抑制翻譯[5-6]；大多反式編碼sRNA常與分子伴侶Hfq一起發(fā)揮調(diào)控作用。某些mRNA能夠在5′UTR端形成抑制翻譯的二級(jí)結(jié)構(gòu)，而sRNA在Hfq的協(xié)助下能夠結(jié)合到這種mRNA的5′UTR，從而阻止這種二級(jí)結(jié)構(gòu)的形成[7]。

順式編碼sRNA是由編碼靶mRNA的DNA鏈的互補(bǔ)鏈為模板進(jìn)行轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物，存在一段序列與靶基因完全互補(bǔ)，具有高特異性、高親和力的特點(diǎn)。由于順式編碼sRNA的反義RNA與靶mRNA是互補(bǔ)的，因此它們可以自主地相互作用，從而對(duì)靶mRNA轉(zhuǎn)錄后翻譯進(jìn)行調(diào)控。一般順式編碼的sRNA不需要Hfq輔助即可對(duì)靶mRNA進(jìn)行調(diào)控。順式編碼的反義sRNA通常位于相應(yīng)基因的UTR，在與靶mRNA形成二聚體后，通過(guò)改變其二級(jí)結(jié)構(gòu)，從而影響mRNA翻譯[8]。具體調(diào)控圖，可見(jiàn)參考文獻(xiàn)[1-2]。

2.2細(xì)菌sRNA與蛋白相互作用 除堿基互補(bǔ)配對(duì)外，sRNA還可通過(guò)與蛋白質(zhì)結(jié)合而發(fā)揮調(diào)控作用。以銅綠假單胞菌的6 S RNA及CsrB/RsmZ家族為例。

在細(xì)菌中，6 S RNA十分保守且能夠在穩(wěn)定期積聚，它與σ70-RNA聚合酶能夠結(jié)合形成穩(wěn)定絡(luò)合物，而這種結(jié)合依賴于6 S RNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)——大型中央隆起兩側(cè)的螺旋，類似于開放的啟動(dòng)子。然而，6 S RNA過(guò)表達(dá)或敲除無(wú)法引起細(xì)菌表型變化，對(duì)其功能研究還需不斷探索[9]。轉(zhuǎn)錄因子CsrA通過(guò)與sRNA CsrB、CsrC特異性結(jié)合，減少CsrA與目標(biāo)mRNA結(jié)合機(jī)會(huì)，封閉它的sRNA轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控，從而抑制目標(biāo)mRNA的翻譯。RsmX、RsmY、RsmZ等這類sRNA能調(diào)節(jié)銅綠假單胞菌Rsm系統(tǒng)中RsmA、RsmE RNA結(jié)合蛋白，并且GacS/GacA能激活RsmX、RsmY及RsmZ的表達(dá)[3,10]。在銅綠假單胞菌中，RsmZ家族主要調(diào)控T3SS分泌、細(xì)菌運(yùn)動(dòng)和生物膜形成等[11]。同時(shí)，CsrA/RsmZ在碳代謝、毒力、糖異生等多種生理過(guò)程中發(fā)揮調(diào)控作用[12]。此外一類作用于碳代謝相關(guān)基因的sRNA CrcZ/CrcY，可通過(guò)與Hfq一起結(jié)合，通過(guò)碳分解代謝物阻遏使銅綠假單胞菌適應(yīng)環(huán)境，但具體機(jī)制不明[4]。

2.3與CRISP/Cas系統(tǒng)相關(guān)的sRNA 許多原核生物存在CRISP/Cas系統(tǒng)，其包含許多細(xì)菌的遺傳基因元素，是一種RNA介導(dǎo)的用于外源遺傳物質(zhì)降解的適應(yīng)性免疫防御系統(tǒng)[13]。最新研究發(fā)現(xiàn)，存在一類與CRISP/Cas有關(guān)的sRNA。一般而言，CRISPR位點(diǎn)由幾個(gè)短的直接重復(fù)序列組成，由25到40個(gè)堿基對(duì)的獨(dú)特序列分隔，Cas基因與CRISPR重復(fù)序列相連，兩者之間存在前導(dǎo)序列發(fā)揮啟動(dòng)子作用，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的非編碼RNA命名為CRISPR RNAs(crRNA)，CRISPR/Cas系統(tǒng)利用與特定Cas蛋白關(guān)聯(lián)的CrRNAs識(shí)別和消除外源噬菌體及質(zhì)粒等遺傳物質(zhì)[14]。研究者利用CRISP/Cas系統(tǒng)可對(duì)基因進(jìn)行編輯的特點(diǎn)，使其在基因組水平上的基因改造、轉(zhuǎn)錄調(diào)控與表觀遺傳調(diào)控等不同層次上得到快速的發(fā)展與應(yīng)用。

3 銅綠假單胞菌相關(guān)sRNA的生物學(xué)功能

細(xì)菌在面對(duì)生存環(huán)境的改變?nèi)鐪囟炔▌?dòng)、有氧到厭氧的環(huán)境轉(zhuǎn)換、pH值、碳源改變及抗菌藥物作用等，通過(guò)sRNA調(diào)控自身狀態(tài)以適應(yīng)環(huán)境的變化。例如，在新陳代謝、脂多糖修飾、生物膜形成、外膜蛋白合成、毒力產(chǎn)生、耐藥性和群體感應(yīng)等多個(gè)方面發(fā)揮重要調(diào)控作用。目前，銅綠假單胞菌相關(guān)sRNA的研究大都停留在新的sRNA鑒定方面，僅有少部分sRNA的生物學(xué)功能被闡明。整理現(xiàn)有的理論和研究基礎(chǔ)，可對(duì)其生物學(xué)功能總結(jié)如下。

3.1氧化應(yīng)激 在銅綠假單胞菌中，sRNA PhrS啟動(dòng)子含有一個(gè)保守的ANR盒——氧化反應(yīng)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，PhrS在缺氧條件下具有獨(dú)立的誘導(dǎo)作用。在氧缺乏時(shí)，PhrS通過(guò)與pqsR上游170個(gè)核苷酸的開放閱讀框結(jié)合而促進(jìn)pqsR的翻譯[15]。在不同濃度H2O2刺激實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，sRNA RgsA能夠增強(qiáng)銅綠假單胞菌的抗氧化應(yīng)激能力[16]，但具體機(jī)制沒(méi)有揭示。近期有研究發(fā)現(xiàn)，RgsA在RNA酶RpoS的調(diào)節(jié)下使轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子Fis和?；d體蛋白mRNA的表達(dá)下調(diào)，而rpoS編碼的σS亞單位在細(xì)菌的氧化應(yīng)激中扮演重要角色，而這與氧化應(yīng)激是否有關(guān)還需進(jìn)一步驗(yàn)證[17]。

3.2碳代謝 細(xì)菌碳的吸收和利用是由一種被稱為碳分解代謝抑制(CCR)的機(jī)制所控制的。在銅綠假單胞菌中，Hfq是CCR轉(zhuǎn)錄后的主要調(diào)節(jié)因子，其通過(guò)與編碼碳利用相關(guān)酶的mRNAs RBS中富含A的序列結(jié)合，來(lái)阻止核糖體的負(fù)載。在碳源較少時(shí)，銅綠假單胞菌中的CrcZ合成得到增強(qiáng)，抑制碳代謝而適應(yīng)環(huán)境的改變[4]。

3.3鐵代謝 機(jī)體一般通過(guò)限制細(xì)菌對(duì)鐵離子利用來(lái)抵抗感染。大多數(shù)病原菌的鐵調(diào)控蛋白——Fur，可參與sRNA對(duì)鐵的調(diào)控。在銅綠假單胞菌的基因間區(qū)存在sRNA PrrF，它包括2個(gè)95%以上的同源序列PrrF1和PrrF2，同時(shí)研究者在其上找到了Fur結(jié)合位點(diǎn)，與Fur蛋白一起調(diào)節(jié)銅綠假單胞菌體內(nèi)的鐵代謝[18]。在高鐵環(huán)境下，F(xiàn)ur與Fe2+結(jié)合，抑制PrrF的編碼，減少細(xì)菌對(duì)儲(chǔ)存鐵的利用；在低鐵環(huán)境下，F(xiàn)ur與Fe2+脫落，誘導(dǎo)PrrF的產(chǎn)生，從而增加儲(chǔ)存鐵的使用，也可增加對(duì)鐵的攝取。同時(shí)PrrF1、PrrF2以及兩者間的基因序列能一起編碼sRNA PrrH。PrrH轉(zhuǎn)錄起始于PrrF1的5′端，終止于PrrF2的3′末端，全長(zhǎng)325個(gè)堿基[19]。研究發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于PAO1野生株，PrrF1/PrrF2敲除株在低鐵培養(yǎng)基中生存能力下降，毒力降低；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也顯示接種PrrF1/PrrF2敲除株的小鼠，在急性肺部感染期間細(xì)菌載量減少。然而，目前還沒(méi)有研究證實(shí)PrrF和PrrH影響銅綠假單胞菌毒力的具體作用機(jī)制，需要進(jìn)一步的研究去闡釋。

3.4生物膜形成 細(xì)菌處于不利條件時(shí)，將合成由多糖蛋白質(zhì)和核酸組成的生物膜，黏附在固體表面。生物膜使細(xì)菌在代謝、物質(zhì)利用等方面具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，對(duì)抗菌藥物和宿主免疫防御的抵抗性增強(qiáng)。在銅綠假單胞菌中，存在受雙組分調(diào)節(jié)系統(tǒng)GacS/GacA控制的CsrB/RsmZ，其主要調(diào)控T3 SS的分泌、細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)和生物膜等[11]。同時(shí)，PrrF1、PrrF2和PhrS也能夠調(diào)控群體感應(yīng)系統(tǒng)中喹諾酮信號(hào)分子(PQS)的合成，其對(duì)銅綠假單胞菌群體的生物膜形成有一定影響[20-21]。有研究發(fā)現(xiàn)，在大腸埃希菌和銅綠假單胞菌中，存在的sRNA MtvR負(fù)調(diào)控Hfq。這種負(fù)調(diào)控與hfqEc的5′UTR區(qū)結(jié)合有關(guān)。MtvR在大腸埃希菌 和銅綠假單胞菌中的表達(dá)能夠調(diào)控多種表型，包括生物膜形成能力降低以及對(duì)各種抗菌藥物敏感。

3.5外膜蛋白形成 細(xì)菌外膜(OM)是一種選擇性屏障，用于廢物的排出和少量營(yíng)養(yǎng)物的進(jìn)入，這一特性對(duì)于細(xì)胞在不利的環(huán)境中生存至關(guān)重要[22]。研究發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌sRNA OmrA與OmrB通過(guò)下調(diào)幾種外膜蛋白(OmpT、CirA、FecA和FepA)的合成以重組外膜[23]。典型的OMP是由ompF和ompC基因編碼。在滲透壓變化時(shí)，sRNA MicF和MicC分別抑制mRNA編碼的OmpF和OmpC的翻譯，從而調(diào)控細(xì)胞膜孔隙的大小以適應(yīng)環(huán)境[24]。此外，在細(xì)菌應(yīng)激過(guò)程中，sRNA RybB和MicA的轉(zhuǎn)錄被激活，其下調(diào)大腸桿菌中OmpC和OmpA等主要OMP的合成，從而減少未組裝的周質(zhì)OMP的積累[25]。然而在銅綠假單胞菌中有關(guān)調(diào)控外膜蛋白形成的相關(guān)sRNA研究尚少。

3.6群體感應(yīng) 群體感應(yīng)(QS)即細(xì)菌通過(guò)分泌一種或者多種?；呓z氨酸內(nèi)酯(AHLs或HSL)小分子，促進(jìn)細(xì)菌個(gè)體間相互交流，協(xié)調(diào)群體行為的現(xiàn)象。QS一般由4部分組成：las、rhl、pqs和iqs[26]。細(xì)菌通過(guò)QS可以調(diào)控銅綠假單胞菌的運(yùn)動(dòng)、毒力產(chǎn)生、生物被膜形成及抗菌藥物耐藥等多種生理過(guò)程[27]。sRNA與QS系統(tǒng)存在著一種相互調(diào)控的關(guān)系。Gac/Rsm系統(tǒng)對(duì)正?；呓z氨酸內(nèi)酯(C4-HSL)和細(xì)胞外毒力因子(如氰化氫、花青素和彈性蛋白酶)的表達(dá)有積極的調(diào)節(jié)作用[28]。PrrF1、PrrF2通過(guò)抑制編碼降解鄰氨基苯甲酸的mRNA antABC而抑制鄰氨基苯甲酸降解，從而促使PQS信號(hào)分子產(chǎn)生。PhrS與pqsR通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)直接促進(jìn)pqsR的轉(zhuǎn)錄，PQSR蛋白直接作用于表達(dá)PQS信號(hào)分子合成的操縱子pqsABCDE，編碼的酶能轉(zhuǎn)化鄰氨基苯甲酸為PQS信號(hào)分子[15]。近期有研究發(fā)現(xiàn)，ReaL受las系統(tǒng)的LasR負(fù)調(diào)控，并且通過(guò)轉(zhuǎn)錄后調(diào)控pqsC正向調(diào)控PQS信號(hào)分子的合成[29]。現(xiàn)在研究大部分集中于sRNA對(duì)PQS系統(tǒng)的調(diào)控，而對(duì)其他QS系統(tǒng)的研究較少。因此，sRNA與QS系統(tǒng)之間的調(diào)控關(guān)系仍然還需要大量的研究去探索。

3.7毒力因子產(chǎn)生 銅綠假單胞菌為適應(yīng)環(huán)境，會(huì)產(chǎn)生外毒力因子，如氰化氫、吡咯烷、綠膿素和彈性蛋白酶等，而這些均與其毒力有關(guān)。以往研究表明，sRNA能調(diào)節(jié)毒力相關(guān)靶mRNA的穩(wěn)定性或表達(dá)，以調(diào)控細(xì)菌對(duì)宿主的侵襲力。銅綠假單胞菌需要大量復(fù)雜的調(diào)控元件來(lái)控制其毒力系統(tǒng)的表達(dá)，如最近一份研究報(bào)告顯示雙組分AlgZR調(diào)控系統(tǒng)控制著幾種重要毒力表型的表達(dá)，如鐵依賴基因σ因子pvds、PrrF1、PrrF2、吡咯烷以及綠膿素[30]。目前，在有關(guān)銅綠假單胞菌相關(guān)sRNA功能研究的報(bào)道中，對(duì)綠膿素等表型的調(diào)控機(jī)制研究較少。

3.8細(xì)菌耐藥 抗菌藥物作為一種威脅細(xì)菌生存的環(huán)境壓力，會(huì)誘導(dǎo)相應(yīng)抵抗機(jī)制產(chǎn)生。KIM等[31]利用過(guò)表達(dá)手段發(fā)現(xiàn)，17個(gè)Hfq依賴的sRNA調(diào)控了大腸埃希菌對(duì)抗菌藥物的敏感性，而敲除其中4個(gè)sRNA能逆轉(zhuǎn)相應(yīng)的表型。更重要的是，過(guò)表達(dá)sRNA RyeB能增強(qiáng)左氧氟沙星對(duì)泛耐菌株的抑制效果，這提示sRNA可能是影響細(xì)菌對(duì)抗菌藥物的抵抗作用。抗菌藥物脅迫下產(chǎn)生的sRNA譜可通過(guò)管理細(xì)菌的各種生理過(guò)程來(lái)調(diào)控細(xì)菌耐藥。研究發(fā)現(xiàn)，在銅綠假單胞菌中，阿奇霉素能抑制RsmY/Z的轉(zhuǎn)錄，并且其對(duì)阿奇霉素的敏感性增加，這可能與銅綠假單胞菌 QS及生物膜的形成被阻斷有關(guān)[32]。目前，尚無(wú)研究結(jié)果直接表明sRNA調(diào)控各種生理過(guò)程來(lái)調(diào)控細(xì)菌耐藥，而這種潛在的密切聯(lián)系值得進(jìn)一步探究，利于為發(fā)展以sRNA為靶點(diǎn)的抗菌藥物提供理論依據(jù)。

4 展 望

作為致病菌諸多調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵組成部分，sRNA已引起人們的關(guān)注。同時(shí)，隨著生物信息學(xué)的發(fā)展，許多銅綠假單胞菌相關(guān)sRNA被發(fā)現(xiàn),然而目前針對(duì)sRNA各方面的研究一直停留在表型層面，并未對(duì)sRNA的功能及其作用機(jī)制做出深入研究。今后研究者應(yīng)加深對(duì)銅綠假單胞菌相關(guān)sRNA功能和作用機(jī)制的探討，這將有助于闡明sRNA在細(xì)菌體內(nèi)的精細(xì)調(diào)控作用，促使人們對(duì)sRNA分子參與的翻譯調(diào)控和轉(zhuǎn)錄后加工產(chǎn)生更深的認(rèn)識(shí)，最終豐富人們對(duì)細(xì)菌耐藥機(jī)制的認(rèn)知，以便推進(jìn)抗菌治療的發(fā)展。